本发明属于生物，具体涉及基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法。
背景技术：
1、无论转基因技术的发展趋势如何，转化方案都应该朝着简单、易于操作和便于育种的方向发展（cunningham等，2018年；huang等，2023年）。然而，基于农杆菌介导和直接dna转移为基础开发的大多数技术都需要耗时、劳动密集型和昂贵的程序，如长期体外培养，为再生原生质体或外植体创造必要的条件（mini等，2018），以及使用昂贵的仪器，如基因枪（o'brien和lummis，2006）。花粉粒是将外源基因引入种系的理想载体，数量非常丰富（eapen 2011，gad等，2020）。然而，使用花粉作为载体产生转基因植物的成功率非常低，尤其是对于树木（yin等，2021），主要是因为在花粉发育过程中形成了两层外壁（codjoe jm等，2021，jaffri和macalister，2021），阻止外来基因进入花粉（zhao等，2017）。这是使用花粉作为转基因植物载体的第一步，也是最困难的一步。目前许多树木类的以花粉为载体本高效转化系统尚未成功建立。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本发明提供一种基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，本发明提供的方法简单、快速、且能够有效的将外源基因导入花粉中。
2、本发明是通过以下技术方案实现的：
3、基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，所述方法包括：
4、（1）对采集的花粉进行清洗，获得清洗后花粉；
5、（2）配置含有外源基因的溶液，将含有外源基因的溶液装入无针注射推进器中，将所述无针注射推进器的喷嘴对准所述清洗后花粉进行重复喷射；
6、（3）将步骤（2）处理后的花粉进行低压渗透处理，低压渗透处理后进行避光培养，获得含有外源基因的转化花粉。
7、进一步地，步骤（1）中，对花粉进行清洗的方法为：
8、（1）称取0.01-0.03g花粉置于10ml离心管中；
9、（2）往10ml离心管中加入3-5 ml bk培养基，震荡混匀后进行离心，弃上清；
10、（3）将步骤（2）重复2-3次后，往10ml离心管中加入5-8 ml bk培养基，震荡混匀后，将花粉溶液分装至1.5ml离心管中；
11、（4）将分装在1.5ml离心管中的花粉溶液在冰上静置，然后将置于冰上的花粉溶液在摇床上摇动；采用低温高速离心机进行离心，去上清，获得清洗后的花粉；将清洗后花粉置于冰上待用。
12、进一步地，步骤（2）中，所述外源基因的形态为质粒dna。
13、进一步地，步骤（2）具体为：
14、1）以蒸馏水为溶剂，配置含有外源基因的溶液；所述含有外源基因的溶液中外源基因的浓度为10-15ng/µl；
15、2）将含有外源基因的溶液加入到无针注射推进器中；
16、3）将无针注射推进器的喷嘴对准花粉进行喷射，重复喷射6-8次，将喷嘴和花粉的距离控制在30-40 mm。
17、进一步地，步骤3）中，将花粉盛放于1.5ml离心管的底部，将离心管管口与地面垂直，然后将无针注射推进器的喷嘴对准离心管的管口进行喷射。
18、进一步地，步骤（3）具体为：
19、1）将步骤（2）处理后的花粉置于冰上，将置于冰上的花粉放在真空干燥箱中进行低压渗透，低压渗透的条件为：压力-80pa，处理时间4-6 min；
20、2）低压渗透后静置2-3 min，然后在4℃、10000-12000rpm条件下离心4-5 min，去上清；
21、3）将步骤2）处理后花粉加入bk培养基震荡混匀，置于28℃摇床避光培养2-3 h。
22、进一步地，所述花粉为梨花粉或苹果花粉。
23、进一步地，采用所述转化花粉进行授粉，以培育获得具有外源基因的种子。
24、本发明的有益技术效果：
25、本发明利用无针注射推进器附加低压渗透的方法是一种利用花粉进行转化对象的间接转化技术；本发明利用无针注射推进器附加低压渗透技术，能够快速有效的将含有目的基因的质粒成功导入花粉中，导入率达到了43%，导入率较高。
1.基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，其特征在于，步骤（1）中，对花粉进行清洗的方法为：
3.根据权利要求1所述基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述外源基因的形态为质粒dna。
4.根据权利要求1所述基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，其特征在于，步骤（2）具体为：
5.根据权利要求4所述基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，其特征在于，步骤3）中，将花粉盛放于1.5ml离心管的底部，将离心管管口与地面垂直，然后将无针注射推进器的喷嘴对准离心管的管口进行喷射。
6.根据权利要求1所述基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，其特征在于，步骤（3）具体为：
7.根据权利要求1所述基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，其特征在于，所述花粉为梨花粉或苹果花粉。
8.根据权利要求1所述基于无针注射推进器、低压渗透将基因导入花粉的方法，其特征在于，采用所述转化花粉进行授粉，以培育获得具有外源基因的种子。
