本发明属于基因工程，涉及一种来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白pst09944及其相关生物材料与应用。
背景技术：
1、由条形柄锈菌小麦专化型(条锈菌， puccinia striiformis f.sp. tritici)引起的条锈病是小麦种植区的一种病害。条锈菌侵染寄主植物后，寄主植物出现黄萎和坏死等症状，使寄主植物活力减弱，分蘖数、穗数和种子数减少，株高及种子的重量和质量降低，引起产量的损失和品质的下降。为了拓宽和丰富小麦抗条锈病基因资源库，科技工作者不断从小麦推广品种、地方品种、野生亲缘种以及远缘物种中发掘抗条锈病基因。条锈菌毒性小种的快速变异使其克服了小麦品种中的抗病基因，并且适应了不同的环境条件。以植物免疫防御机理为理论依据，从病原菌中发掘天然免疫诱抗资源，阐明诱抗剂提高作物抗性的激活机制是制定作物病害防治策略的核心问题，也是设计植物免疫诱抗剂作为农药的分子基础。因此鉴定条锈菌的免疫激发子，挖掘新的基因资源，对诱抗剂的靶标、受体识别、关键激活部位、信号转导以及诱抗剂的激活机制进行深入的研究对小麦条锈病的持久防控具有重要的理论意义。
2、随着病原菌和植物的不断斗争，植物进化出位于细胞表面的模式识别受体(pattern recognition receptors, prrs)用以识别来自于病原菌相关分子(pathogenassociated molecular pattern, pamp)进而激发一系列的下游免疫反应。以细菌鞭毛蛋白为例，鞭毛是细菌的一种鞭状运动器官，主要存在于革兰氏阴性细菌。鞭毛不仅为细菌提供运动力，而且通过趋化作用有助于细菌入侵和黏附到宿主细胞，还参与生物膜形成，并与细菌毒力分泌系统相关，是细菌致病潜力的必需结构。1999年，felix等最先发现来自丁香假单胞菌dc3000等病原菌鞭毛蛋白n端保守的22个氨基酸能被植物识别，该氨基酸序列组成的多肽(flg22)能够诱导番茄和拟南芥产生免疫反应。通过图位克隆和受体-配体结合分析，确认了fls2（flagellin-sensitive 2, 鞭毛蛋白敏感2）为flg22的受体。flg22是目前研究最为深入的一个pamp，flg22诱导的免疫也是研究植物与微生物相互作用的最经常使用的模式系统之一。inf1是一种脂质结合蛋白，也是卵菌中最具有代表性的pamp之一，可被多种十字花科和茄科植物识别并激发防御反应。除此以外。疫霉lrr-rlk具有胞外域相对较短，lrr motif数量较少，激酶区与植物激酶独立进化的特点，最新的研究发现卵菌rlk6蛋白的胞外lrr（leucine-rich repeat，富含亮氨酸重复序列）片段可以作为pamp被植物识别。几丁质寡聚糖是来自于真菌中典型的pamp。几丁质由一系列1,4连接的n-乙酰氨基葡萄糖组成，该组份广泛分布在真菌细胞壁、节肢动物外骨骼及线虫中。在植物病原真菌侵染宿主过程中，宿主产生的水解酶如几丁质酶可以将真菌细胞壁降解产生几丁质寡聚物，这些几丁质低聚物进而激活宿主免疫反应。识别几丁质低聚物的分子位于细胞表面，已知有免疫受体如cerk1，cerk1识别几丁质低聚物后，会诱导一系列免疫反应。除了几丁质以外，近些年的研究陆续报道了一系列来自于病原真菌的pamp分子。例如，稻曲病菌的一个富含丝氨酸苏氨酸的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白sgp1在水稻叶片上引起免疫反应，植物可以特异性识别其n端的22个氨基酸保守氨基酸snp22。大丽轮枝孢分泌蛋白vp2主要在病原入侵棉花的中期表达，并能引起烟草、拟南芥和棉花叶片的活性氧爆发与坏死。vp2转基因棉花在苗期对大丽轮枝菌的抗性显著增强，转基因棉花中参与细胞壁修饰、响应真菌和木质素代谢基因的表达显著增强，转基因棉花中木质素含量也显著增强，表明vp2在棉花中能诱导免疫。
3、离子内流是目前已知的反应最快的病原体相关分子模式触发的免疫反应（pamp-triggered immunity，pti）之一，不同的pamps或damps能够在0.5-2分钟内引起定位在细胞质膜上的离子通道打开和胞外ca2+内流。正常情况下质外体中游离的ca2+浓度远高于细胞质，当植物的免疫受体识别到病原菌后可以迅速激活ca2+通道，触发胞质内ca2+的瞬时增加，因此，ca2+内流是触发下游免疫信号转导的基础。pamps诱导的活性氧(reactive oxygenspecies, ros)产生是另一种典型的早期免疫反应，ca2+的流入和ros的产生是植物细胞对于病原菌应激的基本反应之一。当植物遭受病原菌侵染时会迅速产生大量的ros，并在某一时段达到峰值，这被称为活性氧迸发。ros本身可以作为一种抗菌剂，并且它还能促进细胞壁的糖蛋白交联，引起细胞壁增厚。不仅如此，ros的产生机制与ca2+息息相关：prr复合体在pti激活后，可以通过胞质类受体激酶激活ca2+通道，导致细胞质中的ca2+上调；ca2+也可以直接结合并激活rbohd，或激活相关激酶的活性来诱导rbohd的磷酸化，进而引起ros的快速产生。丝裂原活化蛋白激酶(mapk)级联是真核生物中进化高度保守且功能重要的信号模块，它通过mapkkks、mapkks、mapks逐级磷酸化的方式将这些信号一步步传递和放大。激活的mapks磷酸化下游底物，引起细胞生理活动的改变。目前参与响应最多的植物mapk级联是mkk4/5-mpk3/6级联。除了以上这些信号事件，pti经典信号转导事件还包括防御基因的表达、气孔关闭、胼胝质沉积等。由于植物的免疫水平与其生长抑制密切相关，植物免疫的持续激活可能也会导致植株的生长长势变弱，也称之为免疫自激活。
4、值得注意的是，尽管目前pamp等质外体效应子的研究取得了巨大的进展，但锈菌中的pamp分子仍未被鉴定到。发掘锈菌的pamp分子并探究其发挥作用的分子机理是亟待解决的重要科学问题，也为培育小麦抗条锈病提供新的基因资源和绿色免疫诱抗材料。
技术实现思路
1、本发明通过基因工程手段，筛选出免疫诱抗蛋白pst09944和免疫诱抗基因pst09944，通过对所述蛋白和基因进行功能分析，揭示其在茄科植物与条锈病互作中的抗病机理，为抗条锈材料培育提供解决方案。
2、为实现这一技术目的，本发明采用如下技术方案。
3、第一方面，本发明提供一种来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白pst09944，具有如seqid no:1所示的氨基酸序列。
4、第二方面，提供一种来自小麦条锈菌的免疫诱抗基因pst09944，包括编码本发明所述的免疫诱抗蛋白pst09944的核苷酸序列。
5、优选的，所述免疫诱抗基因pst09944具有如seq id no:2所示的cds序列。
6、优选的，瞬时表达所述免疫诱抗基因pst09944能够提高茄科植物对条锈病的抗性。
7、第三方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有本发明所述的免疫诱抗基因pst09944。
8、第四方面，提供一种茄科植物抗条锈病品种培育方法，包括将本发明所述的免疫诱抗基因pst09944的特异性片段转入茄科植物的步骤。
9、第五方面，提供一种茄科植物抗条锈病品种的培育方法，包括将本发明所述表达载体转入茄科植物的步骤。
10、第六方面，提供本发明所述的免疫诱抗蛋白pst09944在茄科植物抗条锈病品种培育中的应用。
11、第七方面，提供本发明所述的免疫诱抗基因pst09944在茄科植物抗条锈病品种培育中的应用。
12、第八方面，提供本发明所述的表达载体在茄科植物抗条锈病品种培育中的应用。
13、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码免疫诱抗蛋白pst09944的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的免疫诱抗基因pst09944的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码免疫诱抗蛋白pst09944且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
14、在本发明中，术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，85%或更高，90%或更高，95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
15、上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
16、上述所述的含有编码免疫诱抗蛋白pst09944的核酸分子的表达盒（免疫诱抗基因pst09944表达盒），是指能够在宿主细胞中表达pst09944的dna，该dna不但可包括启动pst09944转录的启动子，还可包括终止pst09944转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。
17、在本发明中，术语“核苷酸序列”或“多核苷酸”是指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或合成的核苷酸残基的线性聚合体。其可以是单链的或双链的，并且包括rna、dna(例如可以是基因组、cdna或合成的)、其类似物或其组合。本领域技术人员应该理解，通常核苷酸序列的表示顺序从左到右是5'-3'顺序，并且，除非另外指出，否则“a”是指脱氧腺苷，“c”是指脱氧胞苷，“g”是指脱氧鸟苷，“t”是指脱氧胸苷，而“u”是指核糖核苷，尿苷。通常，核苷酸序列包含四种天然脱氧核苷酸或四种天然核糖核苷酸；然而，它们还可以包含非天然核苷酸类似物。
18、在本发明中，术语“氨基酸序列”是指蛋白质中氨基酸的排列顺序。这个序列由遗传信息决定，具体来说，就是由dna或rna中的基因通过转录和翻译的过程决定的。氨基酸序列通常由字母组成的字符串表示，每个字母代表一个特定的氨基酸。这些序列是按照从n端（氨基端）到c端（羧基端）的方向排列的。在生物学中，有20种不同的标准氨基酸，每种氨基酸都有一个特定的单字母或三字母缩写。例如，蛋氨酸（lysine）的三字母和单字母缩写分别是lys和k。
19、在本发明中，术语“基因”基因(gene)是遗传变异的主要物质。它是控制性状的基本单位，由脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)分子上许多决定生物性状的不同碱基对排列顺序所组成。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。具体来说，基因位于染色体上，呈线性排列，在染色体上是占有一定位置的遗传单位。基因具有双重性，即能忠实地复制自己，以保持生物的基本特征；同时在繁衍后代中又可能发生突变。突变基因也可以继续复制，传递给后代。基因不仅可以通过复制把遗传信息传递给下一代，还可以使遗传信息在蛋白质的分子结构上得到表达，因此，基因是控制性状的基本单位。一个基因只有一个dna分子，但一个dna分子上包含多个基因。基因是dna分子上具有遗传效应的片段，它们决定性状的表达。
20、在本发明中，术语“蛋白“是指蛋白质，蛋白质是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。没有蛋白质就没有生命。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。
21、cds（coding sequence）序列是编码一段蛋白产物的序列，它指的是与蛋白质序列一一对应的dna序列，且该序列中间不含其他非该蛋白质对应的序列。cds是mrna（信使rna）中的编码区，由起始密码子(aug)开始，直到终止密码子(uag、uga、uaa)结束，与蛋白质的密码子完全对应。cds序列是单链dna序列，它位于基因中，指导mrna的转录和随后蛋白质的翻译。启动子序列是位于cds上游的特定dna序列，参与特定基因转录及其调控。启动子的范围非常大，可以包含转录起始位点上游2000bp，有些特定基因的转录区内部也存在着转录因子的结合位点，因此也属于启动子范围。例如，原核生物在转录起始位点上游-10有一段tataat的保守序列，有助于局部解链，在-35有一段ttgaca序列提供rna聚合酶识别信号。
22、与现有技术相比，本发明提供的技术方案至少具备下述的有益效果或优点：
23、为了筛选具有免疫激发子活性的条锈菌分泌蛋白，本发明对条锈菌生理小种cyr32带有分泌信号肽的蛋白进行了系统的分析，从中克隆到能够在本氏烟上引起细胞死亡的分泌蛋白免疫诱抗蛋白pst09944。利用农杆菌介导的瞬时表达技术，分别在本氏烟上注射免疫诱抗蛋白pst09944，免疫诱抗蛋白pst09944△sp（去除信号肽版本），以及阴性对照gfp和能够引起死亡的阳性对照基因inf1，利用western blot技术也检测到了对应蛋白的表达，该结果可以证实免疫诱抗蛋白pst09944可以引起细胞死亡且依赖于其分泌活性。不仅如此，免疫诱抗蛋白pst09944引起的细胞死亡依赖于经典的共受体bak1而非sobir1，这也为后续识别受体的鉴定和信号传递的研究提供了切入点。
24、在发现免疫诱抗蛋白pst09944具有诱导植物细胞死亡的激发子活性以后，本发明想要进一步明确该活性是否能够诱导植物免疫，从而提高对于病原菌的抗性。为此，本发明在体外表达并纯化了免疫诱抗蛋白pst09944。研究发现，对比经典的pamp分子flg22，外源施加免疫诱抗蛋白pst09944同样可以诱导本氏烟mapk的激活和胞外活性氧的迸发，而对照gfp蛋白无法引起相应的免疫反应；此外，相比较瞬时表达gfp的叶片，在本氏烟叶片上瞬时表达免疫诱抗基因pst09944可以诱导pti信号的标记基因nbcyp71d20的显著上调，同时有效的抑制了寄生疫霉在本氏烟的侵染。因此，本发明认为免疫诱抗蛋白pst09944是一个来源于条锈菌的能够在异源寄主本氏烟中发挥免疫诱抗功能的新型病原相关分子模式。
25、本氏烟区别于小麦，二者完全是不同属种的植物类型。由此本发明想要进一步探索免疫诱抗蛋白pst09944免疫诱抗活性是否能够在小麦上诱抗，以及在其他植物中是否具有相同的功能。结果发现，免疫诱抗蛋白pst09944能够在拟南芥和番茄中引起不同程度的细胞死亡，但在玉米和水稻中不具有引起细胞死亡的能力。同样，在小麦中无法引起细胞死亡，使用免疫诱抗蛋白pst09944处理后的小麦叶片也尚未发现能够提高对于条锈菌生理小种cyr31的抗性。
26、本发明从反应遗传学原理入手，利用生化试验、病原菌接种等手段鉴定并明确了条锈菌分泌蛋白免疫诱抗蛋白pst09944是一类新型病原相关分子模式。免疫诱抗蛋白pst09944能够在番茄、本氏烟等茄科植物触发细胞死亡，但在小麦、玉米和水稻等单子叶作物中尚未发现该活性。该发现为茄科作物的天然免疫诱抗资源的开发提供了新型的材料基础和理论依据；同时为条锈病的防治和小麦抗病性的改良提供了新的方向。
1.一种抗条锈病品种培育方法，其特征在于，包括将来自小麦条锈菌的免疫诱抗基因pst09944的特异性片段转入拟南芥和番茄的步骤；
2.一种抗条锈病品种的培育方法，其特征在于，包括将表达载体转入拟南芥和番茄的步骤；
3.来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白pst09944在拟南芥和番茄抗条锈病品种培育中的应用，其特征在于，所述来自小麦条锈菌的免疫诱抗蛋白pst09944具有如seq id no:1所示的氨基酸序列。
4.来自小麦条锈菌的免疫诱抗基因pst09944在拟南芥和番茄抗条锈病品种培育中的应用，其特征在于，所述来自小麦条锈菌的免疫诱抗基因pst09944具有如seq id no:2所示的cds序列。
5.表达载体在拟南芥和番茄抗条锈病品种培育中的应用，其特征在于，所述表达载体含有来自小麦条锈菌的免疫诱抗基因pst09944；
