本发明涉及基因工程领域，具体涉及提高葡萄糖氧化酶的热稳定性和酸稳定性的方法及突变体goxm12、基因和应用。
背景技术：
1、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, gox)是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-d-葡萄糖成为葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶作为替代抗生素的新型饲料酶制剂，具有改善动物肠道微生态平衡以及肠道消化环境、保护肠道健康、提高饲料利用率、促进动物生长、提高机体免疫力等多种功能，已被广泛应用于饲料工业。
2、中国专利cn 108893453 a中，以来源于 aspergillus niger的葡萄糖氧化酶god作为母本，经过多次突变后获得热稳定提高的突变体god-m5，但是其仍不能满足工业要求。
3、中国专利cn112301009a提供了来源于 aspergillus niger的葡萄糖氧化酶突变体god-m5的系列突变体，葡萄糖氧化酶突变体的热稳定获得明显提高，80℃热处理2 min 后，god-m10相较godm5相对剩余酶活提高了2.2倍左右。
4、作为饲料用酶，要求其在酸性和中性ph条件下维持较高的酶活性，但是上述葡萄糖氧化酶突变体goxm10发挥最大酶活性的ph条件为6.0，ph稳定性在ph 2.5-3.0条件下酶活性极低。
5、中国专利cn114736879a提供了来源于 aspergillus niger的葡萄糖氧化酶gox的突变体，其中，突变体e361p/a419i的最适温度以及最适ph分别为40 ℃，ph 6.0，在65 ℃的半衰期为578 min，是goxm10的1.5倍。中国专利申请cn113862233a提供了来源于 aspergillus niger的葡萄糖氧化酶gox的突变体，其中，突变体q241e/r499e的最适温度以及最适ph分别为40 ℃，ph 5.0。在ph 2.5和37 ℃处理60 min后，突变体q241e/r499e保留酶活力为15.89%，与goxm10相比提高了144.46%。
6、为了获得热稳定和酸稳定同时提高的gox，采用蛋白质工程改造技术对高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体goxm10进行热稳定性和酸稳定性的改良成为实现这一目的的重要手段。
技术实现思路
1、为了进一步优化来源于 aspergillus niger的高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体goxm10的酶学特性，提出并完成了本发明。
2、本发明的目的是提供热稳定性和酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体。
3、本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶突变体的编码基因。
4、本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体编码基因的重组载体。
5、本发明的再一目的是提供包含上述葡萄糖氧化酶突变体编码基因的重组菌株。
6、本发明的再一目的是提供一种制备热稳定性和酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶的方法。
7、本发明的再一目的是提供上述葡萄糖氧化酶突变体的应用。
8、本发明的再一目的是提供一种提高葡萄糖氧化酶的热稳定性和酸稳定性的方法。
9、本发明对高热稳定性葡萄糖氧化酶突变体goxm10进行突变，得到热稳定性和酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体，其中，母本葡萄糖氧化酶突变体goxm10的氨基酸序列如seq id no:1所示。
10、seq id no:1：
11、gieaslltdpkevagrtvdyiiagggltglvvaarltenpditvlviesgsyesdrgpiiedlnaygkifgssvdhayetvclatnnrtaliragnglggstlvnggtwtrphkaqvdswetvfgnegwnwdsvaayslqaerarapnakqiaaghyfnaschgingtvhagprdtgddyspivkalmsavedrgvptkkdlgcgdphgvsmfpntlhedqvrsdaarewllpnyqrpnlqvltgqyvgkvllsqnattpravgvefgthkgnfhnvtakhevllaagsavsptileysgigmksileplgiktvvdlpvglnlqdqttstvrsritsagagqgqaawfatfnetfgdytekahellntkleqwaeeavarggfhnttalliqyenyrdwivkdnvayselfldtageasfdvwdllpftrgyvhildkdpylrhfaydpqyflneldllgqaaatqlarnisnsgamqtyfagetipgdnlaydadlrawveyipyhfrpnyhgvgtcsmmpkemggvvdnaarvygvqglrvidgsipptqmsshvmtvfyamalkiadavladyasmq。
12、根据本发明的具体实施方式，将葡萄糖氧化酶突变体goxm10的第241位氨基酸由gln突变为glu、第361位氨基酸由glu突变为pro、第419位氨基酸由ala突变为ile，得到突变体q241e/e361p/a419i。
13、进一步，将葡萄糖氧化酶突变体goxm10的第241位氨基酸由gln突变为glu、第361位氨基酸由glu突变为pro、第419位氨基酸由ala突变为ile、第499位氨基酸由arg突变为glu，得到突变体q241e/r499e/e361p/a419i，即突变体goxm12，所述葡萄糖氧化酶突变体goxm12的氨基酸序列seq id no:2所示。
14、seq id no:2所示：
15、gieaslltdpkevagrtvdyiiagggltglvvaarltenpditvlviesgsyesdrgpiiedlnaygkifgssvdhayetvclatnnrtaliragnglggstlvnggtwtrphkaqvdswetvfgnegwnwdsvaayslqaerarapnakqiaaghyfnaschgingtvhagprdtgddyspivkalmsavedrgvptkkdlgcgdphgvsmfpntlhedqvrsdaarewllpnyqrpnlevltgqyvgkvllsqnattpravgvefgthkgnfhnvtakhevllaagsavsptileysgigmksileplgiktvvdlpvglnlqdqttstvrsritsagagqgqaawfatfnetfgdytpkahellntkleqwaeeavarggfhnttalliqyenyrdwivkdnvayselfldtageisfdvwdllpftrgyvhildkdpylrhfaydpqyflneldllgqaaatqlarnisnsgamqtyfagetipgdnlaydadleawveyipyhfrpnyhgvgtcsmmpkemggvvdnaarvygvqglrvidgsipptqmsshvmtvfyamalkiadavladyasmq。
16、根据本发明的具体实施方式，葡萄糖氧化酶突变体goxm12的编码基因序列如seqid no:3所示。
17、seq id no:3：
18、ggtattgaggcttccttgttgactgacccaaaggaggtcgccggtagaactgttgactacatcattgctggtggtggattgactggtttggttgtcgctgccagattgactgagaacccagacatcaccgttttggtcattgagtccggttcttacgaatctgatagaggtcctatcattgaagacttgaacgcttacggtaaaatcttcggatcttccgttgaccacgcttacgagactgtctgccttgccactaacaatagaaccgctttgattagagctggtaacggtttgggtggttctactttggttaacggaggtacttggaccagaccacacaaggctcaagttgactcttgggagaccgtcttcggtaacgaaggttggaattgggattctgtcgcagcttactccttgcaggccgagagagcccgtgctccaaacgctaagcaaatcgccgcaggtcactacttcaacgcctcctgtcacggtattaacggaactgttcacgctggtccaagagacaccggtgacgattactctcctatcgtcaaggccttgatgtccgctgttgaagacagaggtgtcccaactaagaaggacttgggttgcggagacccacatggtgtttctatgttccctaacaccttgcacgaggaccaagtcagatccgatgctgcccgtgaatggttgcttccaaactaccaaagacctaacttggaggttttgaccggtcaatacgttggtaaggtccttttgtctcaaaacgccactaccccaagagctgttggtgtcgagttcggaactcacaagggtaactttcacaatgttaccgctaaacacgaagtccttttggcagctggttccgctgtttctccaactatcttggagtactctggtatcggaatgaagtccattttggaaccacttggtattaagaccgtcgttgacttgcctgttggtctgaacttgcaagaccagactacctctactgtcagatcccgtattacctccgccggtgctggacagggtcaggctgcctggtttgctactttcaacgagaccttcggtgactacactccaaaggctcacgaattgcttaacaccaaattggaacaatgggctgaggaagccgttgctagaggtggtttccacaacactaccgctcttttgatccaatacgagaactacagagactggattgttaaggataacgtcgcttactctgaattgttcttggacactgccggtgagatttccttcgacgtctgggacttgctgccattcactagaggatacgttcacatcttggacaaggacccatacttgagacacttcgcttacgatcctcaatacttcttgaacgagttggacttgcttggtcaggctgccgctactcaattggctagaaacatctctaactccggtgccatgcaaacttactttgctggtgaaaccattccaggtgacaacttggcctacgatgctgacttggaggcttgggttgaatacattccataccacttcagacctaactaccatggtgtcggaacctgttctatgatgccaaaggagatgggtggtgtcgttgacaacgccgctagagtttacggtgtccagggattgagagttatcgacggttctatcccacctactcaaatgtcctctcacgttatgaccgtcttctacgctatggctttgaagatcgcagacgctgttttggctgactacgcctccatgcaataa。
19、根据本发明的提高葡萄糖氧化酶的酸热稳定性的方法包括以下步骤：
20、将葡萄糖氧化酶突变体goxm10进行四点突变，第241位氨基酸由gln突变为glu、第499位氨基酸由arg突变为glu、第361位氨基酸由glu突变为pro、第419位氨基酸由ala突变为ile。
21、本发明提供了包含上述葡萄糖氧化酶突变体的编码基因的重组载体。
22、本发明还提供了包含上述葡萄糖氧化酶突变体的编码基因的重组菌株。优选的，所述重组菌的出发菌株具体为gs115 (ppic9 -goxm10)。
23、根据本发明的具体实施方式，制备热稳定性和酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶的方法如下所述：
24、(1)用含有葡萄糖氧化酶突变体的编码基因的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌株；
25、(2)培养重组菌株，诱导葡萄糖氧化酶表达；
26、(3)纯化所表达的葡萄糖氧化酶。
27、本发明的有益效果：
28、本发明对goxm10进行三点突变q241e/e361p/a419i，进而再进行四点突变q241e/r499e/e361p/a419i，得到突变体goxm12。
29、将纯化的goxm10和突变体在ph 6.0、40℃下进行酶促反应以测定其酶活性。goxm10的酶活力为393.63 u/mg，本技术的突变酶q241e/e361p/a419i，goxm12的酶活力分别为336 u/mg和480 u/mg，goxm12较goxm10提高了22%。
30、goxm10和突变体的最适温度都为40 ℃；goxm10和突变体的最适ph为6.0。
31、goxm10在75℃下处理12 min之后，剩余酶活相当于处理前的36 %；突变体q241e/e361p/a419i和goxm12在75℃下处理12 min之后，剩余酶活相当于处理前的37%和48%。
32、在ph 2.5和37℃处理60 min后，突变体q241e/e361p/a419i和goxm12保留酶活力分别为12.87%和15.32%，与m10相比分别提高了101%和139%。
33、综上，对于本技术的突变体，三点突变体q241e/e361p/a419i的特性与goxm10基本相当，而突变体goxm12的酸稳定性和热稳定显著优于goxm10。
34、三点突变体q241e/e361p/a419i和四点突变体goxm12的最适反应和goxm10一致均为6.0。ph 2.5条件下处理10、20、30、40、50、60 min时，突变体goxm12的相对剩余酶活力分别为62%、41%、33%、24%、20%、15%，均高于goxm10；在ph 2.5和37℃处理60 min后，突变体q241e/e361p/a419i和goxm12保留酶活力分别为12.87%和15.32%，与m10相比分别提高了101%和139%；在ph 2.75和37℃处理60 min后，突变体q241e/e361p/a419i和goxm12的保留酶活力约为35.26%和42.96%，与goxm10相比分别提高了47%和79%。
35、本发明的葡萄糖氧化酶突变体与突变母本goxm10相比，在不影响母本的酶活性和热稳定性的前提下有效改善了其酸稳定性，纯化后酶液突变体q241e/e361p/a419i和goxm12在ph 2.5和37℃处理60min后保留酶活力分别为12.87%和15.32%左右，与goxm10相比分别提高了101%和139%。因此，本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体可以很好的应用于食品和饲料行业中，有广阔的应用前景。
36、本发明提供了上述热稳定性和酸稳定性改进的葡萄糖氧化酶突变体的应用，具体可以应用于食品和饲料领域中。
37、本发明提供的葡萄糖氧化酶突变体能很好的满足食品和饲料等领域中的应用，有着非常广阔的应用前景。
1.一种热稳定性和酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no:2所示。
2.一种葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，所述基因编码氨基酸序列如seq id no:2所示的葡萄糖氧化酶。
3.根据权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。
4.包括权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因的重组载体。
5.包括权利要求2所述的葡萄糖氧化酶基因的重组菌株。
6.一种提高葡萄糖氧化酶的热稳定性和酸稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括对seq id no:1所示的葡萄糖氧化酶进行以下突变的步骤：
7.权利要求1所述的稳定性和酸稳定性提高的葡萄糖氧化酶突变体的应用。
8.制备葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
