【】本发明涉及种质资源保存领域，特别涉及一种基于松材线虫病抗性分级马尾松特异种质高效保存方法。
背景技术
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背景技术：
1、马尾松(pinus massoniana lamb.)是我国南方主要的造林树种，其分布范围面积广、蓄积量大、经济价值高、适应性强。马尾松种植遍及我国17个省(区)，林分面积1203.5万hm2，占全国乔木林面积7.7％，林分总面积居全国乔木树种首位，蓄积量居第六位。马尾松生长迅速，可在较短的经营期内提供大量的木材和松脂，是许多木材工业、林产工业和造纸工业的支柱，此外其松脂、松针、松花粉均可入药，树皮可提取栲胶，树根可培养茯苓，是推动新兴森林产业发展的潜在动力。马尾松生命力极强、生态适应性广泛，是荒山造林和生态林建设的主要先锋树种。在我国生态安全和经济建设中，马尾松发挥着举足轻重的作用。
2、现有技术在马尾松地理变异和种源选择、种子园建设、纸浆材和建筑材定向培育等研究领域取得了重要的进展和成就。现代林业讲究良种良法。通过选育马尾松良种，提高单位面积木材产量和质量，对解决我国森林资源匮乏问题、缓解木材供需矛盾、保障生态安全、增加林业产业效益具有重要意义。自上世纪八十年代以来，我国众多学者在马尾松种质资源收集与筛选方式做了大量研究，选育出了一批速生、丰产的马尾松优良品系。然而，相较农用地而言，林地土壤较为贫瘠，环境条件恶劣，对林木抗逆性要求较高。受松材线虫病影响，当前马尾松产业发展严重受阻，亟需一批速生、丰产、优质、高抗马尾松种质。
3、林木种质资源是实现良种选育利用的原始材料，拥有林木种质资源的数量和质量，直接影响到种质资源的创新利用效率和现代种业的可持续发展。开展林木种质资源，尤其是速生、丰产、高抗等特异种质的高效保存是目前马尾松育种工作中必不可少的重要环节，但目前马尾松种质保存仍采用圃地保存的传统方式，导致资源流失严重，保存效率极低，完全无法满足当前对马尾松特异种质的需求。为此，本技术依托组培技术，通过种质筛选、圃地保存、离体保存、复壮培养等步骤，建立了一种基于松材线虫病抗性分级马尾松特异种质高效保存方法。
技术实现思路
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技术实现要素：
1、鉴于上述内容，有必要对马尾松种质保存进行优化，满足当前对马尾松特异种质不断增长的社会需求，本发明针对组培技术进行改进，通过种质筛选、圃地保存、离体保存、复壮培养等步骤，建立一种基于松材线虫病抗性分级马尾松特异种质高效保存方法。
2、为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：
3、一种基于松材线虫病抗性分级马尾松特异种质高效保存方法，所述方法为：
4、(1)对马尾松进行调查，在疫病区选择速生、丰产的生长正常的健康优势木枝条做为抗病材料，选择速生、丰产但感病明显的马尾松家系种子做为感病材料；
5、(2)将步骤(1)的抗病材料或感病材料通过播种育苗或离体组培方式获得幼嫩小苗，栽培过程中分别对抗病材料或感病材料的苗木喷施复配剂，调节植株高径比，直到至苗木培育至高度≧30cm、地径≧4mm，高径比65～90，且苗木离地10～15cm高度以下已木质化时完成苗木培育；
6、(3)将步骤(2)培育好的苗木接种线虫，在室内进行抗病情况的分级验证获得抗病种质或感病种质；
7、(4)对步骤(3)的抗病种质或感病种质进行截顶修枝并施加相应的育苗基质进行圃地保存，得到抗病植株或感病植株；
8、将步骤(4)圃地保存2年生以下抗病植株或感病植株为繁殖材料来源，采集当年新抽嫩梢为外植体，通过茎芽培养方法，进行无菌离体培养，待芽苗继代一定次数时，将继代芽进行离体保存，在每次离体保存达一定时间时进行复壮培养，然后再转至相应的离体保存培养基中保存即可。
9、进一步的，所述步骤(3)中抗病种质和感病种质的分级方法为：选择移至苗圃中培育8-12月，生长健壮、木质化程度较高的马尾松苗木接种线虫，接种量为4000头/株，将接种苗木置于温度为30-35℃、湿度为60％-70％、光照强度为8000lx-12000lx条件下培养，观察并测定马尾松的感病死亡频率，当感病死亡频率≤30％时，分级为抗病种质，当感病死亡频率>30％时，分级为感病种质。
10、进一步的，所述步骤(2)中抗病材料的复配剂由25～50mg/l多效唑、0.05～0.15g/l磷酸二氢钠、0.2～0.3g/l硝酸钾、1～3mg/l硼酸组成。
11、进一步的，所述步骤(4)中抗病种质的育苗基质由3份泥炭土、3～4份珍珠岩、1～2份黄泥、1～2份椰糠、2～3kg/m3过磷酸钙组成。
12、进一步的，所述步骤(5)中抗病植株的离体保存培养基组分为：kno3600 mg·l-1；nh4no3150mg·l-1；cacl2·2h2o 130mg·l-1；mgso4·7h2o 125mg·l-1；mg(no3)2·6h2o235mg·l-1；ca(no3)2·4h2o 110mg·l-1；kh2po4105 mg·l-1；mnso4·h2o 6mg·l-1；znso4·7h2o5mg·l-1；cuso4·5h2o 0.1mg·l-1；h3bo33 mg·l-1；na2moo4·2h2o 0.25mg·l-1；cocl2·6h2o0.025mg·l-1；维生素b11 mg·l-1；维生素b60.5 mg·l-1；烟酸0.5mg·l-1；甘氨酸2mg·l-1；肌醇100mg·l-1；6-ba0.2 mg·l-1；naa 0.05mg·l-1；硫代硫酸钠25mg·l-1。
13、进一步的，所述步骤(2)中感病材料的复配剂由0～25mg/l多效唑、0～0.15g/l磷酸二氢钠、0.1～0.3g/l硝酸钾、3～5mg/l硼酸组成。
14、进一步的，所述步骤(4)中感病种质的育苗基质由2份泥炭土、1～2份珍珠岩、1～2份黄泥、3～4份椰糠、2～3kg/m3过磷酸钙组成。
15、进一步的，所述步骤(5)中感病植株的离体保存培养基组分为：kno3800 mg·l-1；nh4no3200mg·l-1；cacl2·2h2o 150mg·l-1；mgso4·7h2o 125mg·l-1；mg(no3)2·6h2o235mg·l-1；ca(no3)2·4h2o 165mg·l-1；kh2po4340 mg·l-1；mnso4·h2o 6mg·l-1；znso4·7h2o5mg·l-1；cuso4·5h2o 0.1mg·l-1；h3bo33 mg·l-1；na2moo4·2h2o 0.25mg·l-1；cocl2·6h2o0.025mg·l-1；维生素b11 mg·l-1；维生素b60.5 mg·l-1；烟酸0.5mg·l-1；甘氨酸2mg·l-1；肌醇100mg·l-1；6-ba0.2 mg·l-1；naa 0.05mg·l-1；硫代硫酸钠30mg·l-1。
16、进一步的，所述抗病种质的芽苗继代4～8次后再进行离体保存，所述感病种质的芽苗继代8～12次后再进行离体保存。
17、进一步的，所述抗病种质和感病种质的芽苗在离体保存2年时，需进行复壮培养。
18、本发明具有如下有益效果：
19、本发明针对松材线虫病抗性，对疫区马尾松种质进行初步抗性分级，获得抗病/感病材料，然后利用优化复配剂对相应苗木进行壮苗培育，接种线虫后，再以发病率的30％为基准，将苗木分级确定为抗病种质或感病种质，然后对这两种种质进行保存，整体的保存结合组培方案进行优化，将整个保存过程分为：优化基质对苗木进行圃地保存、优化组织培养配方与周期进行离体保存及复壮培养，精准地实现了对速生、丰产但抗病能力不同的马尾松不同类型特异种质的保存。经过系列技术参数优化，课题组得出了针对抗病、感病两种种质的不同保存方案，实现了对马尾松特异种质的精准分级和高效保存。
1.一种基于松材线虫病抗性分级马尾松特异种质高效保存方法，其特征在于，所述方法为：
2.根据权利要求1所述的高效保存方法，其特征在于，所述步骤(3)中抗病种质和感病种质的分级方法为：选择移至苗圃中培育8-12月，生长健壮、木质化程度较高的马尾松苗木接种线虫，接种量为4000头/株，将接种线虫苗木置于温度为30-35℃、湿度为60％-70％、光照强度为8000lx-12000lx条件下培养，观察并测定苗木的感病死亡频率，当感病死亡频率≤30％时，分级为抗病种质，当感病死亡频率>30％时，分级为感病种质。
3.根据权利要求1所述的高效保存方法，其特征在于，所述步骤(2)中抗病材料的复配剂由25～50mg/l多效唑、0.05～0.15g/l磷酸二氢钠、0.2～0.3g/l硝酸钾、1～3mg/l硼酸组成。
4.根据权利要求1所述的方法为，其特征在于，所述步骤(4)中抗病种质的育苗基质由3份泥炭土、3～4份珍珠岩、1～2份黄泥、1～2份椰糠、2～3kg/m3过磷酸钙组成。
5.根据权利要求1所述的高效保存方法，其特征在于，所述步骤(5)中抗病植株的离体保存培养基组分为：kno3600 mg·l-1；nh4no3150 mg·l-1；cacl2·2h2o 130mg·l-1；mgso4·7h2o 125mg·l-1；mg(no3)2·6h2o 235mg·l-1；ca(no3)2·4h2o 110mg·l-1；kh2po4105 mg·l-1；mnso4·h2o 6mg·l-1；znso4·7h2o 5mg·l-1；cuso4·5h2o 0.1mg·l-1；h3bo33 mg·l-1；na2moo4·2h2o 0.25mg·l-1；cocl2·6h2o 0.025mg·l-1；维生素b11 mg·l-1；维生素b60.5mg·l-1；烟酸0.5mg·l-1；甘氨酸2mg·l-1；肌醇100mg·l-1；6-ba0.2 mg·l-1；naa0.05mg·l-1；硫代硫酸钠25mg·l-1。
6.根据权利要求1所述的高效保存方法，其特征在于，所述步骤(2)中感病材料的复配剂由0～25mg/l多效唑、0～0.15g/l磷酸二氢钠、0.1～0.3g/l硝酸钾、3～5mg/l硼酸组成。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中感病种质的育苗基质由2份泥炭土、1～2份珍珠岩、1～2份黄泥、3～4份椰糠、2～3kg/m3过磷酸钙组成。
8.根据权利要求1所述的高效保存方法，其特征在于，所述步骤(5)中感病植株的离体保存培养基组分为：kno3800 mg·l-1；nh4no3200 mg·l-1；cacl2·2h2o 150mg·l-1；mgso4·7h2o 125mg·l-1；mg(no3)2·6h2o 235mg·l-1；ca(no3)2·4h2o 165mg·l-1；kh2po4340 mg·l-1；mnso4·h2o 6mg·l-1；znso4·7h2o 5mg·l-1；cuso4·5h2o 0.1mg·l-1；h3bo33 mg·l-1；na2moo4·2h2o 0.25mg·l-1；cocl2·6h2o 0.025mg·l-1；维生素b11 mg·l-1；维生素b60.5mg·l-1；烟酸0.5mg·l-1；甘氨酸2mg·l-1；肌醇100mg·l-1；6-ba0.2 mg·l-1；naa0.05mg·l-1；硫代硫酸钠30mg·l-1。
9.根据权利要求1所述的高效保存方法，其特征在于，所述抗病种质的芽苗继代4～8次后再进行离体保存，所述感病种质的芽苗继代8～12次后再进行离体保存。
10.根据权利要求1所述的高效保存方法，其特征在于，所述抗病种质和感病种质的芽苗在离体保存2年时，需进行复壮培养。
