本发明属于生物检测领域，特别涉及一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂、试剂盒及方法。
背景技术：
1、目前，人类肠道内大约居住100万亿来自数千种不同种属的微生物，统称为“微生物群”。微生物群的数量是我们体内细胞总数的10倍，携带的全部基因被称为“微生物组”，其数目是人类基因组的150倍。人类肠道微生物群由多种微生物组成，包括细菌、古细菌、真菌、病毒和寄生虫，主要以细菌为代表。每个人的肠道中平均有150-170种细菌占主导地位，并受益于肠道营养丰富的环境。肠道菌群在营养利用、抗感染、调节免疫系统发育成熟以及宿主代谢生物过程中起着关键作用。
2、肠道菌群与肠道黏液层共存。随着基因组测序技术和生物信息学的发展，人们发现微生物的定植、多样性和密度随胃肠道部位变化。胃和空肠中细菌数量最少，平均每毫升肠内容物中仅含几万个细菌; 回肠中的细菌密度开始增加，大肠中细菌数量最多，平均每毫升肠内容物中含数百亿个细菌。菌群在大肠黏膜上形成丰富而密集的微生物生物膜，人粪便中60%左右的成分是由肠道微生物组成。人类的微生物群与宿主一起进化，是人体的一个重要组成部分。肠道菌群的建立和定植是一个复杂的过程，其中涉及到许多微生物-微生物和微生物-宿主的相互作用。健康的肠道菌群生态在婴儿和儿童早期即开始建立，分娩方式会影响生命早期肠道菌群的建立。顺产婴儿获得的细菌群落与母体阴道微生物菌群相似，而剖腹产出生的婴儿肠道菌群生物多样性则较顺产婴儿低，剖腹产分娩方式造成的异常肠道微生物定植，可能会增加晚年后患多种老年性疾病的风险。此外，喂养方式也会影响生命早期肠道菌群的建立，与配方奶喂养的婴儿相比，母乳喂养的婴儿可能有一个更健康的肠道微生物生态。出生后大约三年，儿童才能建立起一种类似成人的肠道菌群结构，与免疫系统发育成熟时间一致。此外，肠道菌群的组成与结构随着年龄、饮食习惯和整体健康状况的变化而变化。健康老年受试者的肠道细菌组成有明显的个体间差异，致病性菌比例高，益生菌比例低。肠道菌群还受到抗生素和其它常用药物摄入量的影响。
3、胃肠道是人体最大的免疫细胞池，肠道淋巴细胞数目占人体免疫系统细胞总数的70%。肠道微生物生态学是动态变化的，这意味着并不是所有的细菌成员都能在肠道中永久定居。肠道菌群会调节宿主的免疫系统，而宿主免疫系统又影响肠道菌群的组成。宿主免疫系统确保有益菌群的建立，控制特定细菌的生长，防止致病菌损伤肠道。在健康状态下，肠道微生物群通过消化食物、产生代谢物、促进营养吸收和药物代谢等对人体发挥有益作用。肠道菌群还有助于维持肠道黏膜屏障结构的完整性、免疫调节和抵抗病原体入侵的功能。所以，人们认为肠道菌群是影响宿主多种生理生化功能的关键“器官”。如果肠道菌群受损，整个身体都会受到影响。研究发现，肠道菌群的失调与多种人类疾病的发生和发展有关，其中就包括缺血性心脑血管病。肠道菌群已被用作营养和医疗干预的潜在目标。
4、随着研究的深入，人们发现肠道菌群检测可能在缺血性心脑血管事件风险预测及防治方面具备潜力。一项来自比较权威的研究，在无菌条件下，对颈动脉严重狭窄患者施行颈动脉内膜剥脱术，使用全基因组测序技术鉴定活体受试者动脉粥样硬化斑块组织培养获得的细菌。结果发现，每个样本包含其独特的微生物菌群，如拟杆菌、副拟杆菌、卵形拟杆菌、瘤胃球菌及葡萄球菌等。其中，葡萄球菌在所有样本中占主导地位，尤其是巴氏葡萄球菌。这些细菌可能处于休眠状态，但在体外研究中可以被激活，激活后均含有毒力、细胞内入侵和耐药能力。对巴氏葡萄球菌分离株使用临床常规抗生素（如青霉素、四环素、氨苄西林、链霉素、庆大霉素）做药敏试验，结果发现所有菌株对不同抗生素均表现出一定程度的敏感性和耐药性。据此推断，巴氏葡萄球菌参与了颈动脉粥样硬化斑块的形成与发展。在一些地区采样研究也发现，颈动脉斑块中有多种菌株存在，包括葡萄球菌。另有研究报道，对15例临床动脉粥样硬化患者和15例年龄、性别匹配的健康对照组的研究发现，颈动脉斑块中有多种来自肠道和口腔的菌株存在，其中包括葡萄球菌。冠状动脉硬化斑块中也发现了某些肠道菌群株的存在。来自相关部门的一项大样本研究发现，冠状动脉粥样硬化与口腔链球菌过渡增值相关联。这些观察结果支持在动脉粥样硬化斑块中存在由同属水平谱系组成的“核心”微生物群的观点。动脉粥样硬化斑块的微生物群至少部分来自于口腔和肠道。
5、链球菌和葡萄球菌是人体内两种最常见的细菌，大量居住在口腔、肠道、呼吸道和皮肤。在正常情况下，链球菌和葡萄球菌不会感染机体，引起疾病。其主要原因之一，是人体内存在大量的抗链球菌和葡萄球菌抗体。来自2021年报道的一项研究，采用噬菌体免疫沉淀测序技术检测了997份正常人血清样品中的抗微生物菌群igg抗体。结果发现，99%以上的人都携带抗链球菌和葡萄球菌igg抗体。 可以认为，这些igg抗体的存在，能够确保人类与链球菌和葡萄球菌长期共存， 防止细菌进入体内，引起疾病。
技术实现思路
1、本发明的目的是为了判定金黄色葡萄球菌emp igg抗体水平，而提供的一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂、试剂盒及方法。
2、本发明提供的用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂包含一种或两种与目标emp抗体高度互补的线性抗原多肽，抗原多肽为emp 的抗原重叠表位，抗原重叠表位能够与人血浆中针对emp igg抗体发生特异性结合。
3、“emp抗体”为能够识别seq id no: 1和seq id no: 2多肽序列的多克隆抗体，具体如下表：
4、 缩写 抗原多肽序列 emp 1 h- cdfvvpesginkiiptydefkkapkvnv -oh (seq id no:1) emp 2 h- cevdkqivakdpevnrfitqnkvnh -oh (seq id no:2)
5、金黄色葡萄球菌emp分子的全长氨基酸序列341氨基酸及线性抗原表位多肽区域如下：
6、mkkkllvltmstlfatqfmnsnhanastesvdknfvvpesginkiiptydefkkapkvnvsnladnknfvasedklnkiadpsaaskivdknfavpesklgiivpeykeinnrvnvttnnpaskqvdkqivakdpevnrfitqnkvnhrfittqthykkvitsyksthvhkhvnhatssihhhftikpseaprythpsqsqsliinhhfavpgyhghkvvtpgqasirihhfcavpqinsfkvipsyghnshrmhvpsfqnnttathqnakvnktynykyfytykvvkgvkkhfsfskshgckivkpalniknvnyqyavpsnspthvvpefqgilpaprv。
7、检测试剂中seq id no:1和seq id no:2含量的质量或体积浓度比为1:1。
8、两种抗原多肽分别与一种载体蛋白偶联，然后将载体蛋白偶联的两种抗原多肽按质量浓度比1:1 比例混合，载体蛋白为钥孔血蓝蛋白klh。
9、本发明提供的用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂盒，是将klh偶联的抗原多肽混合液包被在96孔酶标板上，干燥后用非金属医用包装材料真空密封包装。
10、非金属医用包装材料为医用塑料。
11、试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。
12、本发明提供的用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测方法，其方法包括的步骤如下：
13、第一步、操作前，将每种抗原分别与klh蛋白偶联, 然后等体积混合并放置-20℃冰箱中保存，温度误差在±2℃范围内；
14、第二步、操作开始时，首先将klh偶联抗原多肽的混合液用包被液稀释为20-50μg/ml 的工作液，该包被液为0.1 m 碳酸盐缓冲液，测得酸碱度ph值为9.6；
15、第三步、用工作液包被96孔微量检测板，4 ℃过夜孵育后，用洗液洗板3遍，洗液为含0.15 m 氯化钠和0.1% tween-20的0.1 m磷酸盐缓冲液，ph为7.0-7.4之间；
16、第四步、用洗液制备3% bsa封闭液，封闭抗原包被的96孔微量检测板，室温孵育1小时后用洗液洗板2遍，然后在40℃ 烤箱中干燥，用非金属包装材料真空密封包装；
17、第五步、按以下步骤分步加样和分析emp igg抗体：
18、步骤1、打开非金属包装材料真空密封包装，取出96孔微量检测板，用含0.15 m 氯化钠和0.1% tween-20的0.1 m磷酸盐缓冲液，测得ph值为7.2的洗液洗板3遍，然后按步骤检测血浆抗体；
19、步骤2、待测血浆样品设双复孔，另设2个阴性对照孔， 参照物为不含emp igg抗体的阴性对照液，藉此反映2种抗原多肽在emp igg抗体阴性反应体系中的实验指标值和2个阳性对照孔，参照物为人源emp igg抗体的混合物，藉此反映2种抗原多肽在emp igg抗体阳性反应体系中的实验指标值；
20、步骤3、用分析液将待测血浆样品1:100稀释，分析液为0.1 m磷酸盐缓冲液含0.15m 氯化钠，10 mm edta和0.5% bsa，ph为7.0-7.4之间，每孔加100 μl, 25℃孵育1-2小时，然后洗板3遍；
21、步骤4、用分析液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人igg抗体，用以验证血浆中被检测的物质是否是特异性抗体，抗体稀释比例为1:25000-1:50000，每孔加100 μl，25℃孵育1-2小时；
22、步骤5、用含0.15 m 氯化钠和0.1% tween-20的0.1 m磷酸盐缓冲液，ph值为7.0-7.4之间的洗液洗板3遍后，每孔加100 μl 3,3',5,5'-四甲基联苯胺tmb及过氧化物酶混合液，室温避光20-30分钟；
23、步骤6、每孔加50µl的12%硫酸溶液为终止液，然后用酶标仪检测光密度od值，检测波长为450nm，参考波长为630nm，检测过程在加入终止液后10分钟内完成，由此定量分析个体血浆中emp igg抗体水平。
24、本发明的有益效果：
25、与现有技术相比，本发明提供的用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂、试剂盒及方法的有益效果如下：
26、（1）本发明用于检测emp igg抗体的组合物采用2种抗原多肽， 每条多肽序列长度不超过30个氨基酸，能够人工合成，生产成本极低。
27、（2）本发明的两种抗原多肽为一种衍生于金黄色葡萄球菌emp蛋白的抗原表位，这些抗原表位能够与人血液中emp igg抗体发生特异性结合，能够用于研究缺血性心脑血管疾病的发病机理。
28、（3）本发明的检测emp igg抗体的方法灵敏度高、特异性好、假阴性比例低，能够便捷、廉价的应用于预测缺血性心脑血管事件的风险，并能够进一步延伸应用至制药或生物制剂生产领域，具有较高的社会效益和经济效益。
1.一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂，其特征在于：包含一种或两种与目标emp抗体高度互补的线性抗原多肽，抗原多肽为emp 的抗原重叠表位，抗原重叠表位能够与人血浆中针对emp igg抗体发生特异性结合；所述的“emp抗体”为能够识别seq idno: 1和seq id no: 2多肽序列的多克隆抗体，具体如下：
2.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂，其特征在于：金黄色葡萄球菌emp分子的全长氨基酸序列341氨基酸及线性抗原表位多肽区域如下：
3.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂，其特征在于：所述的检测试剂中seq id no:1和seq id no:2含量的质量或体积浓度比为1:1。
4.根据权利要求1所述的一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂，其特征在于：两种所述的抗原多肽分别与一种载体蛋白偶联，然后将载体蛋白偶联的两种抗原多肽按质量浓度比1:1 比例混合，载体蛋白为钥孔血蓝蛋白klh。
5.一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂盒，其特征在于：包括权利要求1-4任一所述的一种检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂；将klh偶联的抗原多肽混合液包被在96孔酶标板上，干燥后用非金属医用包装材料真空密封包装。
6.根据权利要求5所述的一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂盒，其特征在于：所述的非金属医用包装材料为医用塑料。
7.根据权利要求5所述的一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照。
8.一种用于检测血浆金黄色葡萄球菌抗体的检测方法，其特征在于：其方法包括的步骤如下：
