本发明涉及啤酒生产，特别是涉及一种麦芽中蛋白酶活力的检测方法及其应用。
背景技术：
1、啤酒麦芽是啤酒酿造中最主要的原料，啤酒麦芽经粉碎、糖化、过滤、煮沸、澄清、冷却后得到啤酒发酵用的麦汁。啤酒麦芽含有多种酶系，在糖化过程中，麦芽中的中性蛋白酶将蛋白质分解成氨基酸和多肽等。
2、通常情况下，酿酒师为了弥补麦芽质量缺陷、提高原料利用率、改善麦汁特性等原因，会在糖化过程中添加外源酶制剂，其中包括中性蛋白酶。
3、不同国家产地的啤酒麦芽的特性有所差异，为了获得更好的酿造性能，酿酒师通常会使用两种或以上的麦芽品种进行生产。不同国家产地的啤酒麦芽品种的中性蛋白酶活力不一样。
4、为了保证啤酒质量稳定性，产出的每批麦汁的氨基酸、多肽等蛋白质分解产物的含量应该保持稳定。氨基酸、多肽是靠麦芽中的蛋白酶和外源蛋白酶分解得到，因此，我们需要准确地测定麦芽中的蛋白酶活力，根据原料的蛋白质含量、所需的蛋白分解程度，计算每批麦汁糖化中需要添加的外源蛋白酶制剂剂量。
技术实现思路
1、针对上述问题，本发明提供一种麦芽中蛋白酶活力的检测方法，该检测方法能够准确测定单品种麦芽或混合麦芽中酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力，从而为麦汁糖化工序中外源蛋白酶的添加量提供数据基础。
2、为了达到上述目的，本发明提供了一种麦芽中蛋白酶活力的检测方法，包括以下步骤：对单品种麦芽进行蛋白酶活力检测，得到单品种麦芽的蛋白酶活力值，将蛋白酶活力值代入蛋白酶活力模型计算得到麦芽的蛋白酶活力值；
3、所述蛋白酶活力模型为：s＝s1×p1+s2×p2+……+sn×pn
4、其中，s为麦芽蛋白酶活力，单位为u/g；s1为品种1麦芽蛋白酶活力，单位为u/g；p1为麦芽中品种1麦芽质量占比，单位为％；s2为品种2麦芽蛋白酶活力，单位为u/g；p2为麦芽中品种2麦芽质量占比，单位为％；sn为品种n麦芽蛋白酶活力，单位为u/g；pn为麦芽中品种n麦芽质量占比，单位为％。
5、单品种麦芽或混合麦芽常规是由供应商送至厂家使用，如是混合麦芽则由供应商预先混合，过往对于单品种麦芽、混合麦芽(即有两个或两个以上麦芽品种)中蛋白酶活力的检测结果十分不稳定，常出现部分批次麦芽检测结果为0或是负数的情况，平行样品也无法达到检测方法常规的重复性要求。本发明人在研究过程中发现常用的国标gb/t 28715-2012，其检测对象为工业中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶制剂，其与具有植物复杂结构的大麦相差甚远，且当待检测物为混合麦芽的时候，混合麦芽的均匀性与混合用的设备、操作相关，无法保证到货原料的每一处均是按理论数值混合均匀的，而取样的位置是随机的，加之不同品种的啤酒麦芽直接从外观上极难区分，因此，若直接从混合麦芽中随机取样，实际无法保证取得样品中各单品种的麦芽的混合比例，是否约为理论数值，进而导致即使是同一次取样，在不同日期相同检验员或同一日期不同检验员得到的检测结果也可能相差很大，最终导致无论是单品种麦芽还是混合麦芽，采用国标方法检测得到的蛋白酶活力检测数值均存在不稳定、无法达到重复性的问题。因此，本发明人提出采用上述检测方法，先对个单品种的麦芽进行蛋白酶活力检测，得到蛋白酶活力数值，再根据各单品种麦芽的混合比例，计算得到混合麦芽的蛋白酶活力值，或直接得到单品种麦芽的蛋白酶活力值，该检测方法能够准确测定单品种麦芽或混合麦芽中酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力，从而为麦汁糖化工序中外源蛋白酶的添加量提供数据基础。
6、在其中一个实施例中，所述蛋白酶活力检测包括以下步骤：
7、制备样品：取单品种麦芽，粉碎，过筛，得到麦芽样品，加入缓冲液，加入木聚糖酶溶液，搅拌，超声水浴提取，摇匀，过滤，得到待测麦芽蛋白酶提取液样品；
8、检测蛋白酶活力：将待测麦芽蛋白酶提取液样品预热，加入酪蛋白溶液，进行水解反应，得到含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，还原福林试剂，检测吸光度，得到酪氨酸浓度，计算得到蛋白酶活力。
9、过往对于单品种麦芽、混合麦芽(即有两个或两个以上麦芽品种)中蛋白酶活力的检测，一般采用国标gb/t 28715-2012的方法，但结果十分不稳定，常出现部分批次麦芽检测结果为0或是负数的情况，平行样品也无法达到检测方法常规的重复性要求，发明人对该问题进行研究，发现国标gb/t 28715-2012是用于工业中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶制剂的检测，其检测的原理是通过水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下，可将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。通过在680nm测定其吸光度，得到酶解产生的酚基氨基酸的量，进而计算蛋白酶活力。然而，上述国标方法的检测对象是已经商品化的蛋白酶产品，除含有少量的防腐剂、稳定剂等辅助成分外，主要成分是蛋白酶，蛋白酶溶解在液体中或吸附在固体助剂上；而本发明人面对的检测对象大麦，是由多个植物细胞组成的个体，包括种皮、胚、胚乳等多层结构，对单个细胞来说具有细胞壁、细胞核、细胞质等生物结构，复杂程度远高于单纯的蛋白酶产品。因此，在检测过程中，蛋白酶产品中的蛋白酶可轻易溶解到缓冲液中，而麦芽中存在于胚乳的各种酶系(主要分布于细胞壁胞间层和细胞内)无法较好地溶解于缓冲液中，若直接采用粉碎或碾碎等常规的物理破碎方法，无法将酶系从麦芽的每个细胞中释放出来，进而导致蛋白酶活力的检测结果不准且波动性较大。
10、并且，国标方法中将试样粉碎后，称取0.2-2g样品进行前处理、稀释至约5-20u/ml的比例后再进行检测，然而常规用于生产啤酒的麦芽的蛋白质含量为11％左右，且蛋白质中含有的酶系占比较少，更多的酶起细胞支撑、储存、防御或其他生物学功能。因此，即使按国标方法中样品量的最大值进行称取，前处理后，溶液中实际含有的蛋白酶含量也可能很低，检测结果的误差会偏大。
11、因此，本发明人提出采用超声水浴提取的方式制备待测的麦芽蛋白酶溶液，利用超声波在液体中产生的高频振动，使麦芽细胞壁、细胞膜充分破碎，释放麦芽细胞中的中性蛋白酶、酸性蛋白酶，释放后的蛋白酶充分溶解到缓冲液中。然而这样得到的麦芽蛋白酶提取液的粘度较大，不利于后面的过滤工序，故本发明人为了降低粘度，且进一步提升中性蛋白酶、酸性蛋白酶的释放率，在超声水浴的基础上提出引入木聚糖酶溶液，麦芽经过制麦工序后，损失掉了木聚糖酶，通过外加的形式，使外加的木聚糖酶与制麦后留存的β-葡聚糖酶共同作用，在超声水解提取的条件下，协同水解细胞的多糖结构，尤其是细胞壁的多糖结构，使与多糖结构结合在一起的蛋白得到充分释放，并且细胞壁分解后，细胞内的蛋白也得到一并释放，从而使蛋白酶得到了充分释放。并且，木聚糖酶与β-葡聚糖酶的共同作用还能降低麦芽蛋白酶提取液粘度，方便后面过滤工序的进行。
12、在其中一个实施例中，所述麦芽为单品种麦芽或混合麦芽。
13、在其中一个实施例中，所述制备样品步骤中，所述麦芽样品与所述缓冲液的质量体积比为1g：(5-8)ml，所述麦芽样品与所述木聚糖酶溶液的质量体积比为1g：(0.2-0.3)μl。
14、在其中一个实施例中，所述麦芽样品与所述缓冲液的质量体积比为1g：5ml，所述麦芽样品与所述木聚糖酶溶液的质量体积比为1g：0.25μl。
15、在其中一个实施例中，所述木聚糖酶溶液的酶活力为450-600fxus/g。
16、在其中一个实施例中，所述制备样品步骤中，所述超声水浴提取的温度为43-48℃，所述超声水浴提取的时间为25-35min。
17、常规超声水浴提取的温度大约为30℃左右，但在实验过程中，本发明人发现常规温度并不能满足木聚糖酶的分解需求，但一味提高温度可能会使中性蛋白酶或酸性蛋白酶失活，因此，本发明人经过大量实验提出以上述温度进行超声水浴提取，一方面能够保证蛋白酶具有活性，另一方面能够促进β-葡聚糖酶、木聚糖酶有效分解麦芽中的葡聚糖、木聚糖，并且还能降低提取液的粘度，方便后面的过滤工序。
18、在其中一个实施例中，所述检测蛋白酶活力步骤具体包括：将待测麦芽蛋白酶提取液样品预热，加入酪蛋白溶液，进行水解反应，加入三氯乙酸溶液，水浴加热，冷却，过滤，加入碳酸钠溶液、福林试剂，混合，水浴加热，冷却，检测吸光度，得到酪氨酸浓度，计算得到蛋白酶活力。
19、在其中一个实施例中，所述蛋白酶活力根据以下公式计算得到：
20、
21、其中，xi为蛋白酶活力，单位为u/g；c为待测麦芽蛋白酶提取液样品的酪氨酸浓度，单位为μg/ml；co为空白样品的酪氨酸浓度，单位为μg/ml；v为待测麦芽蛋白酶提取液样品的总体积，单位为ml；4为酶反应体系总体积，单位为ml；1.0为参与反应的酶量，单位为ml；m为麦芽样品的质量，单位为g；10为反应时间，单位为min。在其中一个实施例中，所述蛋白酶包括中性蛋白酶或酸性蛋白酶；
22、所述蛋白酶为中性蛋白酶时，所述缓冲液为磷酸缓冲液；
23、所述蛋白酶为酸性蛋白酶时，所述缓冲液为乳酸缓冲液。
24、本发明还提供了所述的检测方法在啤酒生产原料质控或啤酒生产中的应用。
25、本发明还提供了一种啤酒的生产方法，包括以下步骤：根据麦芽中蛋白酶活力，加入外源蛋白酶制剂，进行糖化，制备得到麦汁；
26、所述外源蛋白酶制剂的添加量根据所述检测方法得到的麦芽中蛋白酶活力计算得到。
27、利用上述检测方法能够检测啤酒麦芽中的蛋白酶活力，根据啤酒麦芽提供的蛋白酶活力、原料的蛋白质含量，在生产控制中适当调整外源蛋白酶制剂的添加量，以便产出的每批麦汁的氨基酸、多肽等蛋白质分解产物含量保持稳定，提高后续生产的一致性和成品啤酒质量稳定性，制备得到的麦汁质量稳定。
28、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
29、本发明的一种麦芽中蛋白酶活力的检测方法及其应用，该检测方法能够准确测定单品种麦芽或混合麦芽中酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力，从而为麦汁糖化工序中外源蛋白酶的添加量提供数据基础。利用上述检测方法能够检测啤酒麦芽中的蛋白酶活力，根据啤酒麦芽提供的蛋白酶活力、原料的蛋白质含量，在生产控制中适当调整外源蛋白酶制剂的添加量，以便产出的每批麦汁的氨基酸、多肽等蛋白质分解产物含量保持稳定，提高后续生产的一致性和成品啤酒质量稳定性。
1.一种麦芽中蛋白酶活力的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：对单品种麦芽进行蛋白酶活力检测，得到单品种麦芽的蛋白酶活力值，将蛋白酶活力值代入蛋白酶活力模型计算得到麦芽的蛋白酶活力值；
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶活力检测包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述制备样品步骤中，所述麦芽样品与所述缓冲液的质量体积比为1g：(5-8)ml，所述麦芽样品与所述木聚糖酶溶液的质量体积比为1g：(0.2-0.3)μl。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述制备样品步骤中，所述超声水浴提取的温度为43-48℃，所述超声水浴提取的时间为25-35min。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述检测蛋白酶活力步骤具体包括：将待测麦芽蛋白酶提取液样品预热，加入酪蛋白溶液，进行水解反应，加入三氯乙酸溶液，水浴加热，冷却，过滤，加入碳酸钠溶液、福林试剂，混合，水浴加热，冷却，检测吸光度，得到酪氨酸浓度，计算得到蛋白酶活力。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶活力根据以下公式计算得到：
7.根据权利要求1-6中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述蛋白酶包括中性蛋白酶或酸性蛋白酶；
8.权利要求1-7中任一项所述的检测方法在啤酒生产原料质控或啤酒生产中的应用。
9.一种啤酒的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：根据麦芽中蛋白酶活力，加入外源蛋白酶制剂，进行糖化，制备得到麦汁；
