本发明属于生物工程领域，涉及一种l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其制备方法和应用。
背景技术：
1、β-丙氨酸是一种非蛋白质氨基酸，是唯一天然存在的β-氨基酸，在生物体的新陈代谢中具有重要功能。β-丙氨酸在代谢过程中作为重要的中间产物参与肌肉中的肌肽合成，具有抗氧化和抗疲劳的作用。它也在哺乳动物的中枢神经系统中发挥一定的神经保护作用。因此，β-丙氨酸是许多重要医药产品和食品添加剂的前体，如今其市场需求持续增长。
2、β-丙氨酸的生产方法主要包括化学合成和生物合成两种途径。1.化学合成：β-丙氨酸的化学合成通常采用从氨基酸的前体化合物进行的合成反应。常见的方法包括：丙烯腈还原法、丙酮酸转化法。2.生物合成：a.微生物发酵法：近年来，利用微生物发酵法生产β-丙氨酸成为一种高效环保的生产途径。b.酶催化法：使用酶催化法也可以合成β-丙氨酸。此方法通常选择l-天冬氨酸-α-脱羧酶(l-aspartate alpha-decarboxylase,ec:4.1.1.11,pand/adc)来专一催化l-天冬氨酸生成β-丙氨酸。在适宜的反应体系中，酶催化底物转化为β-丙氨酸。β-丙氨酸的生产方法多种多样，化学合成法在工业上应用广泛，但生物合成法因其环保和高效性正逐渐受到青睐。
3、酶催化法生成β-丙氨酸，主要依赖l-天冬氨酸-α-脱羧酶。然而，目前发现的l-天冬氨酸-α-脱羧酶存在易失活、表达量低或催化活性差等问题，因此仍有必要采用有效策略改善l-天冬氨酸-α-脱羧酶。现有研究中对酶的改造方式有：定点突变、随机突变、定向进化、计算机辅助设计、融合蛋白技术、改造反应条件等方法，从而利用蛋白质工程的技术来改造和优化蛋白质的功能和特性来推动生物医学、工业生产和基础科学的发展。
4、同时可采用多酶级联反应，利用多个酶在一个连续的反应路径中进行协作，其优点如下：首先，能够提高反应效率，因为中间产物在酶的催化下迅速转化，减少了中间体的积累。其次，降低了副产物的生成，因为酶反应的步骤是特异性的，可以减少不必要的化学反应。最后，这种反应还可以提高反应的选择性和特异性，通过精确控制反应条件和酶的组合，实现更高的产物纯度和产量。
5、因此，亟需提供一种酶活高且具有ph稳定性的l-天冬氨酸-α-脱羧酶的突变体。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体及其制备方法和应用，构建了一种更适应反应条件的枯草芽孢杆菌l-天冬氨酸-α-脱羧酶的突变体，利用该突变体蛋白催化l-天冬氨酸制备β-丙氨酸，并进一步以马来酸酐为底物，通过共表达马来酸顺反异构酶和天冬氨酸酶与bspand突变体多酶级联催化反应制备β-丙氨酸。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下突变：s7k、e81p、q96e或s104r中的任意一种或至少两种的组合。
4、本发明构建的枯草芽孢杆菌l-天冬氨酸-α-脱羧酶的突变体，其酶活较对照组bspand*提高1.4倍，突变体具有ph稳定性，在ph为6.0-9.0条件下仍能发挥较好活性，有效降低反应成本，使用所构建的突变体菌株、共表达菌株以1mol/l马来酸酐为底物直接催化生产β-丙氨酸，转化率大于99％，产量可达87.5.g/l，产物产率为98.3％。
5、本发明中，枯草芽孢杆菌来源的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体和野生型相比更适应反应条件，利用本发明突变体蛋白催化l-天冬氨酸制备β-丙氨酸，并进一步以马来酸酐为底物，通过共表达马来酸顺反异构酶(smaia)和天冬氨酸酶(ecaspa)与bspand突变体多酶级联催化反应制备β-丙氨酸。
6、seq id no.1：
7、myrtmmsgklhratvteanlnyvgsitidedlidavgmlpnekvqvvnnnngarletyiipgkrgsgviclngaaarlvqegdkviimsykmmsdqeaashepsvavlndqnkieqmlgnepart。
8、优选地，所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下组合突变中的任意一种：
9、(1)s7k；
10、(2)s7k和e81p；
11、(3)s7k、e81p和q96e；
12、(4)s7k、e81p、q96e和s104r。
13、第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子含有第一方面所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码序列。
14、第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。
15、优选地，所述重组载体还含有smaia马来酸顺反异构酶基因和/或ecaspa天冬氨酸酶基因，所述smaia马来酸顺反异构酶基因的核酸序列包括如seq id no.2所示的序列，所述ecaspa天冬氨酸酶基因的核酸序列包括如seq id no.3所示的序列。
16、seq id no.2：
17、atgagcaaccactaccgtatcggtcagatcgttccgagcagcaacaccaccatggaaaccgaaatcccggcgatgctgggtgcgcgtcagctgatccgtccggaacgtttcaccttccacagcagccgtatgcgtatgaaacacgttaacaaagaagaactggcggcgatggatgcggaatccgatcgttgcgcgctggaactgtctgatgctcgtgttgatgttctgggctacgcgtgcctggttgcgatcatggcgatgggtctgggctaccaccgtgaaagccaggcgcgtctggcgcaggttaccaaagataaccaggcggcggcgccggtgatttctagcgcgggcgcgctggttaacggcctgaaagttatcggtgcaaaacgtatcgctctggttgcgccgtacatgaaaccgctgacccagctggttgttgattacatccagcacgaaggcatcgaagttaaagtttggcgtgcgctggaaatcccggacaacctggatgttggccgtcacgatccggcgcgtctgccgggtatcgttgcagaaatggatctgcgtgaagttgacgctatcgttctgagcgcgtgcgttcagatgccgagcctgccggcggttccgaccgttgaagcgcagaccggcaaaccggttatcaccgcggcgatcgcgaccacctacgcgatgctgaccgcgctggaactggaaccgatcgttccgggcgcgggtgcgctgctgagcggcgcgtaccaccaccatcaccaccactaa。
18、seq id no.3：
19、atgtcaaacaacattcgtatcgaagaagatctgttgggtaccagggaagttccagctgatgcctactatggtgttcacactctgagagcgattgaaaacttctatatcagcaacaacaaaatcagtgatattcctgaatttgttcgcggtatggtaatggttaaaaaagccgcagctatggcaaacaaagagctgcaaaccattcctaaaagtgtagcgaatgccatcattgccgcatgtgatgaagtcctgaacaacggaaaatgcatggatcagttcccggtagacgtctaccagggcggcgcaggtacttccgtaaacatgaacaccaacgaagtgctggccaatatcggtctggaactgatgggtcaccaaaaaggtgaatatcagtacctgaacccgaacgaccatgttaacaaatgtcagtccactaacgacgcctacccgaccggtttccgtatcgcagtttactcttccctgattaagctggtagatgcgattaaccaactgcgtgaaggctttgaacgtaaagctgtcgaattccaggacatcctgaaaatgggtcgtacccagctgcaggacgcagtaccgatgaccctcggtcaggaattccgcgctttcagcatcctgctgaaagaagaagtgaaaaacatccaacgtaccgctgaactgctgctggaagttaaccttggtgcaacagcaatcggtactggtctgaacacgccgaaagagtactctccgctggcagtgaaaaaactggctgaagttactggcttcccatgcgtaccggctgaagacctgatcgaagcgacctctgact gcggcgcttatgttatggttcacggcgcgctgaaacgcctggctgtgaagatgtccaaaatctgtaacgacctgcgcttgctctcttcaggcccacgtgccggcctgaacgagatcaacctgccggaactgcaggcgggctcttccatcatgccagctaaagtaaacccggttgttccggaagtggttaaccaggtatgcttcaaagtcatcggtaacgacaccactgttaccatggcagcagaagcaggtcagctgcagttgaacgttatggagccggtcattggccaggccatgttcgaatccgttcacattctgaccaacgcttgctacaacctgctggaaaaatgcattaacggcatcactgctaacaaagaagtgtgcgaaggttacgtttacaactctatcggtatcgttacttacctgaacccgttcatcggtcaccacaacggtgacatcgtgggtaaaatctgtgccgaaaccggtaagagtgtacgtgaagtcgttctggaacgcggtctgttgactgaagcggaacttgacgatattttctccgtacagaatctgatgcacccggcttacaaagcaaaacgctatactgatgaaagcgaacagtaa。
20、第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第二方面所述的核酸分子和/或第三方面所述的重组载体。
21、第五方面，本发明提供了一种制备第一方面所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的方法，所述方法包括如下步骤：
22、(1)将l-天冬氨酸-α-脱羧酶的核酸序列seq id no.4插入质粒中，得到重组质粒，以所述重组质粒为模板，对所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶的第7位、第81位、第96位或第104位中任意一种或至少两种组合进行定点饱和突变；
23、(2)将步骤(1)获得的突变质粒转化至宿主菌，进行培养及纯化处理，得到所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体。
24、seq id no.4：
25、atgtatcgaacaatgatgagcggcaaacttcacagggcaactgttacggaagcaaacctgaactatgtgggaagcattacaattgatgaagatctcattgatgctgtgggaatgcttcctaatgaaaaagtacaagtggtgaataataataatggagcacgtcttgaaacgtatattattcctggtaaacggggaagcggcgtcatatgcttaaacggtgcagccgcacgccttgtgcaggaaggagataaggtcattattatgtcctacaaaatgatgtctgatcaagaagcggcaagccatgagccgtctgtggctgttctgaatgatcaaaacaaaattgaacaaatgctggggaacgaaccagcccgtacatga。
26、优选地，所述质粒包括pet21a(+)。
27、优选地，所述宿主菌包括大肠杆菌、毕氏酵母菌或枯草芽孢杆菌。
28、第六方面，本发明提供了一种根据第一方面所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体与马来酸顺反异构酶和天冬氨酸酶双酶共表达菌株生产β-丙氨酸的方法；所述方法包括：以马来酸酐为底物，将马来酸顺反异构酶和天冬氨酸酶共表菌株与l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体加入反应液，在ph6.5-8.0(例如ph6.5、ph7.5、ph8)、35-37℃(例如35℃、36℃、37℃)条件下反应4-12h(例如4h、8h、12h)。
29、在本发明的一种实施方式中，所述马来酸顺反异构酶和天冬氨酸酶共表菌株的添加量终浓度为3-20g/l(例如3g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l)。
30、在本发明的一种实施方式中，所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的添加量终浓度10-30g/l(例如10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l)。
31、优选地，所述马来酸顺反异构酶和天冬氨酸酶双酶共表达菌株的构建方法包括：
32、(1)以马来酸酐的编码基因为模板进行pcr，得到第一pcr产物；
33、载体prsfduet-1经限制性内切酶酶切，与得到的第一pcr产物连接，转入感受态细胞中，进行序列测定并提取质粒，得到连接产物；
34、以天冬氨酸酶的编码基因为模板进行pcr，得到第二pcr产物；
35、(2)将步骤(1)得到的连接产物经限制性内切酶酶切后，与第二pcr产物连接，转入感受态细胞中，进行序列测定并提取质粒，得到共表达载体；
36、(3)将共表达载体转入感受态细胞中。
37、其中，步骤(1)所述限制性内切酶为bamhi和sali；步骤(2)所述限制性内切酶为ndei和xhoi；步骤(1)和步骤(2)中所述感受态细胞为dh5α，步骤(3)中所述感受态细胞为bl21(de3)。
38、使用上述构建方法得到共表达菌株。
39、第七方面，本发明提供了第一方面所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体在催化马来酸酐反应中的应用。
40、第八方面，本发明提供了一种β-丙氨酸的制备方法，所述制备方法包括：
41、将马来酸酐和第一方面所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体混合，进行反应，反应结束后进行产物纯化，得到所述β-丙氨酸。
42、优选地，所述制备方法还包括：将马来酸酐和第一方面所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体混合后再与第三方面所述的重组载体混合进行反应。
43、优选地，所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的终浓度为10-30g/l(例如10g/l、15g/l、20g/l、25g/l、30g/l)。
44、优选地，所述重组载体的终浓度3-20g/l(例如3g/l、5g/l、10g/l、15g/l、20g/l)。
45、优选地，所述反应的温度为25-30℃(例如25℃、26℃、28℃、30℃)，所述反应的时间为4-24h(例如4h、8h、10h、20h、24h)。
46、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
47、(1)本发明构建的枯草芽孢杆菌l-天冬氨酸-α-脱羧酶的突变体，其酶活较对照组bspand*提高1.4倍，突变体具有ph稳定性，在ph为6.0-9.0条件下仍能发挥较好活性，有效降低反应成本；
48、(2)本发明同时使用所构建的突变体菌株、共表达菌株以1mol/l马来酸酐为底物直接催化生产β-丙氨酸，转化率大于99％，产量可达87.5.g/l，产物产率为98.3％；
49、(3)本发明使用“一锅法”多酶级联，不经中间体的分离，减少中间产物的损失，同时采用一次性投放低料，减少工作作业量，进一步降低了β-丙氨酸的工业生产成本。
1.一种l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于，所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下突变：s7k、e81p、q96e或s104r中的任意一种或至少两种的组合。
2.根据权利要求1所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体，其特征在于，所述l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体在氨基酸序列seq id no.1的基础上发生如下组合突变中的任意一种：
3.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1或2所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的编码序列。
4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求3所述的核酸分子；
5.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求3所述的核酸分子和/或权利要求4所述的重组载体。
6.一种制备权利要求1或2所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体的方法，其特征在于，所述质粒包括pet21a(+)；
8.权利要求1或2所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体在催化马来酸酐反应中的应用。
9.一种β-丙氨酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将马来酸酐和权利要求1或2所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体混合，进行反应，反应结束后进行产物纯化，得到所述β-丙氨酸。
10.根据权利要求9所述的β-丙氨酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：将马来酸酐和权利要求1或2所述的l-天冬氨酸-α-脱羧酶突变体混合后再与权利要求4所述的重组载体混合进行反应；
