本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法；
背景技术：
1、动脉粥样硬化(atherosclerosis,as)的病变基础主要表现为脂质代谢紊乱，可引发一系列严重的心脑血管疾病，因疾病而带来的经济负担也越发繁重；当前为分析as的复杂发病机制、筛选和评价抗as的药物，大多数研究学者会采用动脉粥样硬化小鼠模型或者构建相关细胞损伤模型，但这两种研究模型都存在一定的弊端；小鼠模型的构建周期长、成本高，不便于对药物进行大规模筛选；也无法在体内观察与as关系密切的细胞的实时动态改变；细胞模型的靶点较为单一，也无法体现药物在体内的生物活性；尤其是不便于开展复杂中药复方的研究；因此迫切需要探索一种新的模式动物用以动脉粥样硬化的研究。
2、近年来研究者发现斑马鱼是目前唯一适于高通量药物筛选的脊椎类动物。斑马鱼模型既具有体外实验快速、高效、费用低等优势，又具有哺乳类动物实验预测性强、可比度高等优点，可以有效弥补体外实验和哺乳类动物实验之间的巨大生物学断层，逐渐成为心血管疾病研究的新型模式动物；斑马鱼基因组与人类高度同源等特性，既可以重现某些人类心血管疾病特征，也可以针对某个生物学表型进行药物筛选及寻找未知的药物靶点，有利于进一步探索心血管疾病的发病机制及提出有效的治疗措施，逐渐受到研究者的青睐；但目前以斑马鱼为模型进行动脉粥样硬化的研究，多采用单一造模因素或者单一转基因品系，尚不能满足精准反映药物在机体内的复杂药效活性，因此急需构建一种从多病理角度、多品系转基因斑马鱼动物模型的药物筛选平台，提高对抗as药物的筛选规模、效率及靶向性。
技术实现思路
1、基于现有技术的缺点，我们采用crispr/cas9技术构建了斑马鱼apoeb基因突变模型，并以此为背景与野生型ab斑马鱼、绿色荧光蛋白标记巨噬细胞的转基因斑马鱼tg(mpeg1:egfp)、红色荧光蛋白标记中性粒细胞的转基因斑马鱼tg(lyzc:dsred)、红色荧光蛋白标记红细胞的转基因斑马鱼tg(gata1a:mcherry)和绿色荧光蛋白标记血管内皮细胞的转基因斑马鱼tg(flk1:egfp)杂交，构建能够稳定遗传的apoeb-/-tg(mpeg1:egfp)、apoeb-/-tg(lyzc:dsred)、apoeb-/-tg(gata1a:mcherry)、apoeb-/-tg(flk1:egfp)多品系斑马鱼，搭建一个简便、高效、快速的从多病理角度评价as的药物筛选平台；通过该平台可观察到apoeb斑马鱼突变体as模型早期体内的变化，通过油红o染色可发现在突变体as模型斑马鱼中出现脂质斑块积聚；通过共聚焦显微镜发现中性粒细胞、巨噬细胞、红细胞在突变体as模型斑马鱼腹部积聚，还可观察到血管内皮细胞有不同程度的损伤，以及生化指标在斑马鱼体内的改变等；给予抗as药物后可观察到上述表征有不同程度的减轻，验证了平台；根据以上特征，此平台可用于对抗as药物进行高效筛选，以期发现具有潜在治疗价值的药物。
2、本发明是通过以下技术方案实现的：
3、本发明提供了一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，包括以下步骤：
4、setp1利用crispr/cas9技术构建apoeb基因突变斑马鱼模型；
5、setp1.1设计apoeb基因grna，位点由在dna正义链或反义链中寻找gg(n)18ngg序列确定；
6、setp1.2将grna与cas9蛋白混匀，共同显微注射到单细胞期斑马鱼受精卵中，利用crispr/cas9系统对apoeb基因进行大片段敲除；
7、setp1.3 apoeb-/-斑马鱼显微注射后12周龄时，剪下尾鳍，提取dna进行鉴定，确定f0斑马鱼基因敲除成功；
8、setp1.4将基因敲除成功f0斑马鱼回交，产卵后收集48hpf胚胎20枚，提取dna行基因组测序；余f1斑马鱼饲养至成鱼12周龄时，剪下尾鳍，提取dna进行鉴定及测序，确定f1斑马鱼基因敲除成功，后续进行回交传代；
9、setp2基于多品系apoeb基因突变斑马鱼模型构建抗as药物筛选平台；
10、setp2.1杂交获取多品系apoeb基因突变斑马鱼；
11、setp2.2将斑马鱼分为4组，分别处理；ctrl组不予喂食；nd+ctrl组给予普通饲料喂食；ctrl+hfd组给予高脂饲料；apoeb-/-+hfd组给予高脂饲料喂食；
12、setp2.3指标检测，油红o染色观察血管壁脂质沉积、斑块形成及体内脂肪积累等病理改变，全组织匀浆液生化学指标检测，观察血流速度，观察血管内皮细胞损伤程度setp3基于apoeb-/-斑马鱼as模型评价瑞舒伐他汀抗as疗效
13、setp3.1斑马鱼分为2组，给予不同处理；model组apoeb-/-ab斑马鱼给予高脂饲料喂食；model+statin组apoeb-/-ab斑马鱼高脂饲料喂食后给予0.4ug/ml瑞舒伐他汀24h药浴；
14、setp3.2指标检测同setp2.3。
15、优选的，setp1.1所述设计apoeb基因grna，选择了2处序列设计相应grna，其中grna1靶序为：tgatgcccctcagcccagat[tgg]；grna2靶序为：gatgacgtgaagaaccgtgt[tgg]。
16、优选的，setp1.3所述f0斑马鱼基因敲除成功，crispr/cas9注射胚胎在目标条带300bp处有缺失带；
17、优选的，setp1.4所述f1斑马鱼基因敲除成功，所述胚胎dna基因组测序显示突变条带300bp处有插入片段，存在突变；所述余f1斑马鱼饲养至成鱼12周龄时，dna鉴定及测序apoeb-/-的基因组中在300bp处存在突变，存在约400余碱基对的缺失；f1代全胚组织基因型鉴定结果结合测序结果显示apoeb纯合子存在约10bp的缺失。
18、优选的，setp2.1所述杂交获取多品系apoeb基因突变斑马鱼，将f1 apoeb-/-斑马鱼与wt斑马鱼杂交获得f2代杂合基因突变斑马鱼；f2 apoeb-/-wt斑马鱼性成熟后与tg(mpeg1:egfp)、tg(lyzc:dsred)、tg(gata1a:mcherry)、tg(flk1:egfp)转基因斑马鱼自交，获得f3斑马鱼，培养2月后，对其进行基因型鉴定，获得多品系稳定遗传apoeb基因突变模型。
19、优选的，setp2.3所述指标检测其结果，apoeb-/-+hfd组48h后出现较明显的血管内脂质斑块，总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量明显增高，体内存在脂质过氧化，as早期可出现巨噬细胞及中性粒细胞在体内积聚，血液流动缓慢，可出现血管内皮细胞的部分损伤。
20、优选的，setp3.2所述指标检测其结果，瑞舒伐他汀降低血管内脂质积聚，显著下调总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平，显著下调脂质过氧化物水平，在as早期有减少体内巨噬细胞的浸润及中性粒细胞积聚，减轻红细胞积聚，修复血管内皮损伤。
21、本发明的有益效果是：本发明通过敲除斑马鱼apoeb基因辅以48h高脂饮食构建抗as药物筛选平台，基于平台对抗as药物进行快速、便捷、高通量的筛选，挖掘具有抗as疗效的药物，不仅为抗as药物筛选提供基本的工具，也对后期药物作用机制的研究提供了方向；为进一步研究动脉粥样硬化的发病机制、药物研发和药效评价提供了有力支持；此平台将大大提高药物筛选的效率和准确性，缩短药物研发周期，降低研发成本，同时为as的治疗提供更多有效的选择和治疗方法。
1.一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，其特征在于：setp1.1所述设计apoeb基因grna，选择了2处序列设计相应grna，其中grna1靶序为：tgatgcccctcagcccagattgg；grna2靶序为：gatgacgtgaagaaccgtgttgg。
3.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，其特征在于：setp1.3所述f0斑马鱼基因敲除成功，crispr/cas9注射胚胎在目标条带300bp处有缺失带。
4.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，其特征在于：setp1.4所述f1斑马鱼基因敲除成功，所述胚胎dna基因组测序显示突变条带300bp处有插入片段，存在突变；所述余f1斑马鱼饲养至成鱼12周龄时，dna鉴定及测序apoeb-/-的基因组中在300bp处存在突变，存在约400余碱基对的缺失；f1代全胚组织基因型鉴定结果结合测序结果显示apoeb纯合子存在约10bp的缺失。
5.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，其特征在于：setp2.1所述杂交获取多品系apoeb基因突变斑马鱼，将f1 apoeb-/-斑马鱼与wt斑马鱼杂交获得f2代杂合基因突变斑马鱼；f2apoeb-/-wt斑马鱼性成熟后与mpeg1::egfp、lyzc::dsred、gata1a::mcherry、flk1::egfp转基因斑马鱼自交，获得f3斑马鱼，培养2月后，对其进行基因型鉴定，获得多品系稳定遗传apoeb基因突变模型。
6.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，其特征在于：setp2.3所述指标检测其结果，apoeb-/-+hfd组48h后出现较明显的血管内脂质斑块，总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白含量明显增高，体内存在脂质过氧化，as早期可出现巨噬细胞及中性粒细胞在体内积聚，血液流动缓慢，可出现血管内皮细胞的部分损伤。
7.根据权利要求1所述的一种基于斑马鱼模型apoeb基因编辑的抗动脉粥样硬化药物筛选平台的构建方法，其特征在于：setp3.2所述指标检测其结果，瑞舒伐他汀降低血管内脂质积聚，显著下调总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇水平，显著下调脂质过氧化物水平，在as早期有减少体内巨噬细胞的浸润及中性粒细胞积聚，减轻红细胞积聚，修复血管内皮损伤。
