本发明涉及肺炎支原体大环内酯类耐药突变位点的检测，是一种基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法。
背景技术：
1、肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，mp）首次发现于1944年，是呼吸道疾病的病原之一，也是社区获得性肺炎（cap）和非典型肺炎的一个重要病原，可感染全年龄段人群，在学龄前儿童和青少年中具有较高的传染性。多数mp感染病例的临床表现为包括咳嗽、头痛、发热等自限性呼吸道症状。但在极少数病例中，肺炎支原体可引起肺外症状，如神经系统、皮肤、血液系统及心脏症候群等，部分患者表现为肺炎、溶血性铁缺乏或各种皮肤损伤。肺炎支原体感染的死亡率一般较低，但是老年人中会高达30%。
2、随着对mp研究的深入，已逐步揭示其生物学特性和致病机制。mp的长度约为1µm至2µm，宽度约为0.1µm至0.2µm，与其他细菌相比，体积较小。mp的基因组大小为816,394 bp，含有87个基因。因基因组容量有限，mp无法合成肽聚糖细胞壁，因此对β-内酰胺类抗菌药物具有天然的耐受性。
3、肺炎m.是世界上可以独立生活、在实验室培养基上自我复制的最小微生物。它是呼吸系统中微生物和病毒之间的病原体。直径较小（长度1µm至2µm，宽度0.1µm至0.2µm）。因此，光镜下，无法识别支原体。支原体的大小为125纳米至250纳米，其形状是多形性的，因为它们缺乏一个灵活的细胞壁作为3层“单位膜”，包括一个甾醇。因此，必须加入血清或产生胆固醇的甾醇，它们在产生琼脂的菌落上生长，这些菌落的中心通常固定在琼脂下面。支原体影响人的细胞膜，并可被其特异性抗体抑制。肺炎支原体具有青霉素耐药性，因为青霉素的作用模式是通过抑制我们有机体中缺乏的细胞壁合成。然而，肺炎支原体对四环素或红霉素敏感。肺炎支原体基因组由687个基因组成，由于遗传物质很少，导致其基因所能表达的功能蛋白受到限制，仅有甾醇在细胞膜作为结构支撑的功能性分子。因此，肺炎支原体对β-内酰胺不敏感，并且不被革兰氏染色策略染色。
4、目前,临床针对肺炎支原体感染的一线用药是大环内酯类抗生素。大环内酯是通过靶向抑制核糖体蛋白质合成的抗生素，它在50s核糖体亚基中与特定的核苷酸在23srrna结构域ii和/或v结合，使氨基酸-trna复合体与核糖体分离,从而阻碍蛋白质合成。研究显示,a2063g或a2064g位点在23srrna肽基转移酶环中的突变是mp对大环内酯产生耐药的关键位点。由于大环内酯类抗菌素的广泛应用,世界范围内大环内酯类抗药性肺炎支原体(macrolide-resistant m. pneumoniaemrmp)的流行率不断上升,mrmp对大环内酯类抗药性可造成治疗失败、抗生素改变和病程延长的困扰。
技术实现思路
1、本发明提供了一种基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决现有肺炎支原体核酸的快速检测中存在溶解曲线法易受干扰、非特异性扩增，从而导致鉴定肺炎支原体对大环内酯类抗菌药物高水平耐药突变过程时间过长的问题。
2、本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，包括下述步骤：
3、s1，引物与探针的选择和设计，包括：目的片段选择、引物与探针设计；
4、s2，引物与探针的合成和验证，包括：目的片段合成、探针性能实验；
5、s3，rt-pcr体系构建和检测性能评估，包括：各阳性质粒梯度稀释、检测rt-pcr反应体系检出限与线性、rt-pcr反应体系检测特异性验证、确定检出限。
6、下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进：
7、上述步骤s1中，目的片段选择的具体过程包括：选择肺炎支原体m129标准株序列，下载肺炎支原体m129标准株的23srrna序列用于引物和探针筛选。
8、上述步骤s1中，引物与探针设计的具体过程包括：
9、设计引物，在23srrna序列的a2063g和a2064g位点两端，扩增150bp至250bp；
10、设计探针，对a2063g、a2064g和未突变位点设计分子信标。
11、上述肺炎支原体m129标准株的23srrna序列包括含未突变位点的序列、含a2063g突变位点的序列、含a2064g突变位点的序列，其中，所述含未突变位点的序列如seq idno.1所示，所述含a2063g突变位点的序列如seq id no.2所示，所述含a2064g突变位点的序列如seq id no.3所示。
12、上述引物包括mp-f、mp-r，其中，mp-f的序列如seq id no.4所示，mp-r的序列如seq id no.5所示；设计分子信标采用的探针包括wt-mb、2063-mb、2064-mb，wt-mb、2063-mb、2064-mb对应采用的荧光基团分别为fam、hex、rox，其中，wt-mb的序列如seq id no.6所示，2063-mb的序列如seq id no.7所示，2064-mb的序列如seq id no.8所示。
13、上述步骤s2中，目的片段合成的具体过程包括：分别合成包含a2063g、a2064g和未突变位点的序列，并构建至克隆载体puc57中；探针性能实验的具体过程包括：通过信噪比实验验证分子信标对各突变位点的识别能力以及扩增反应中的退火温度。
14、上述步骤s3中，各阳性质粒梯度稀释的具体过程包括：在菌种（e.coli dh5α）中使用提取试剂盒提取质粒、稀释样本、数字pcr定值，其中，将质粒稀释103至109倍7个浓度。
15、上述步骤s3中，检测rt-pcr反应体系检出限的具体过程包括：利用slan-96s荧光定量pcr仪熔解曲线模式下测其热变性曲线；
16、检测rt-pcr反应体系线性的具体过程包括：利用slan-96s荧光定量pcr仪荧光定量模式，在50℃下持续1min，循环5次，计算分子信标与靶序列结合的信号背景比。
17、上述确定检出限的具体过程包括：将包含a2063g、a2064g和未突变位点的三个质粒10倍梯度稀释至1copy/μl，使用rt-pcr检测体系分别对三个质粒进行扩增，扩增后观察其检测灵敏度和检测线性。
18、本发明针对肺炎支原体a2063g、a2064g两个临近突变位点和野生型序列设计三个分子信标，实现在一个rt-pcr体系中使用一对引物三个探针进行肺炎支原体大环内酯类抗菌药物高水平耐药检测的目的，实现了常规实验室里既能检测肺炎支原体，也能鉴定大环内酯类高水平耐药突变位点的目标。
1.一种基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于包括下述步骤：
2.根据权利要求1所述的基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于步骤s1中，目的片段选择的具体过程包括：选择肺炎支原体m129标准株序列，下载肺炎支原体m129标准株的23srrna序列用于引物和探针筛选。
3.根据权利要求1或2所述的基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于步骤s1中，引物与探针设计的具体过程包括：
4.根据权利要求2或3所述的基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于肺炎支原体m129标准株的23srrna序列包括含未突变位点的序列、含a2063g突变位点的序列、含a2064g突变位点的序列，其中，所述含未突变位点的序列如seq id no.1所示，所述含a2063g突变位点的序列如seq id no.2所示，所述含a2064g突变位点的序列如seq id no.3所示。
5.根据权利要求3或4所述的基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于引物包括mp-f、mp-r，其中，mp-f的序列如seq id no.4所示，mp-r的序列如seq id no.5所示；设计分子信标采用的探针包括wt-mb、2063-mb、2064-mb，wt-mb、2063-mb、2064-mb对应采用的荧光基团分别为fam、hex、rox，其中，wt-mb的序列如seq idno.6所示，2063-mb的序列如seq id no.7所示，2064-mb的序列如seq id no.8所示。
6.根据权利要求3或4或5所述的基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于步骤s2中，目的片段合成的具体过程包括：分别合成包含a2063g、a2064g和未突变位点的序列，并构建至克隆载体puc57中；探针性能实验的具体过程包括：通过信噪比实验验证分子信标对各突变位点的识别能力以及扩增反应中的退火温度。
7.根据权利要求1至6中任意一项所述的基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于步骤s3中，各阳性质粒梯度稀释的具体过程包括：在菌种中使用提取试剂盒提取质粒、稀释样本、数字pcr定值，其中，将质粒稀释103至109倍7个浓度。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于步骤s3中，检测rt-pcr反应体系检出限的具体过程包括：利用slan-96s荧光定量pcr仪熔解曲线模式下测其热变性曲线；
9.根据权利要求1至8中任意一项所述的基于分子信标技术检测肺炎支原体高频耐药突变位点rt-pcr的方法，其特征在于确定检出限的具体过程包括：将包含a2063g、a2064g和未突变位点的三个质粒10倍梯度稀释至1copy/μl，使用rt-pcr检测体系分别对三个质粒进行扩增，扩增后观察其检测灵敏度和检测线性。
