本发明涉及重组蛋白活性检测，更具体的说是涉及一种基于hips细胞的vitronectin生物学活性检测方法。
背景技术：
1、重组人vitronectin蛋白(vtn,玻连蛋白)能有效地与细胞外基质集合，主要用于包被组织培养板，以促进细胞贴壁。在基质中，玻连蛋白可以通过与各种整合素和其他蛋白多糖结合来支持细胞粘附。此外，vtn蛋白在hips细胞的培养和应用中具有重要意义。作为一种高效、可靠的细胞培养试剂，vtn蛋白可以显著提高hips细胞的生长和增殖速率，并促进其向特定细胞系的分化，在最大程度上为ips细胞研究和应用开辟新的道路。重组蛋白的活性检测，是产品质量检测的一个关键参数，活性有无和优劣直接关系到产品能否放行销售、能否满足客户的使用需求。
2、vtn与其他常用细胞因子不同，目前暂无国际标准品可作为定量标准，这对用户来说需要花费大量时间和经济成本进行测试，确定实际用量浓度。目前市场上提供vtn定量活性检测的只有基于vtn蛋白对肿瘤细胞的促黏附作用的检测方法。然而肿瘤细胞自身就是贴壁细胞，实验过程中的细胞清洗、细胞计数等关键操作，不同操作员、不同洗涤过程都会直接影响贴壁率的计算，从而对蛋白活性结果的判定造成很大影响。
3、因此，提供一种可准确定量检测vitronectin生物学活性的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供了一种基于hips细胞的vitronectin生物学活性检测方法。人诱导多能干细胞(human ips，hipsc,hips)是由人体细胞(皮肤成纤维、尿液上皮或血液单个核细胞)通过非整合的方法诱导获得，具有高度近似人类胚胎干细胞(hesc)的克隆形态和基因表达，长期维持正常核型，并在体内外具有三胚层分化潜能。vtn蛋白可促进hips细胞克隆团贴壁增殖，这种促进细胞增殖的效果可以通过cck-8法测定进行量化。以同一待测vtn蛋白样品不同浓度下的促hips增殖结果，绘制四参数拟合s型曲线，利用该曲线所得的ed50，即为该待测vtn蛋白样品的定量结果。本发明检测方法可实现对vtn蛋白活性的定量检测，检测过程中不涉及细胞计数等引入人员操作误差的过程，受试验人员、试验条件变化影响较小，操作准确、便捷，检测周期短，方法稳定性较好，可同时快速进行多批次vtn的活性检测。利用本发明的检测方法，一方面可为试验研究提供质量有保障、批次稳定的vtn蛋白，还有利于排查研发过程中失败案例是否由vtn活性问题导致的情况。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种基于hips细胞的vitronectin生物学活性检测方法，包括以下步骤：
4、(1)包被vitronectin蛋白：用1×dpbs将待测vtn蛋白稀释至不同浓度作为包被液，每孔加入100μl，每个浓度包被3孔，37℃包被1～2h或2～8℃包被12～20h；
5、(2)准备细胞：收集对数期的hips-b1细胞，按照细胞铺板密度为2.5e4/cm2，计算96孔板每孔细胞数为0.8e4个细胞，根据样品数计算此次实验所需细胞总数n；
6、根据细胞计数中活细胞密度，计算取n个hips-b1细胞，需要的对数期的hips细胞的体积，并用5ml 1×dpbs离心清洗细胞一次；
7、按照每孔加入细胞体积为100μl，计算重悬细胞沉淀所需细胞维持液体积v；
8、将离心后的细胞沉淀，用v体积的细胞维持液重悬，并加入y-27632，使y-27632终浓度为10μmol/l，混匀待用，此为细胞终悬液；
9、(3)细胞铺板：将步骤(1)包被好vtn蛋白的96孔细胞培养板取出，吸弃包被液；步骤(2)中混匀的细胞终悬液，按每孔100μl加入包被好vtn蛋白的96孔细胞培养板孔中，将细胞轻轻拍散，置于37℃，5％co2培养箱中培养19-21h；
10、(4)检测及数据处理：
11、采用cck-8法对每孔进行检测，读取od450值：吸弃孔中培养基，并每孔加入100μldmem/f12培养基清洗两次；每孔加入100μl dmem/f12培养基和10μl cck-8试剂，37℃，5％co2培养箱中孵育4h后，于酶标仪读取od450值；
12、采用graphpad软件进行数据处理，以x轴为不同浓度vtn的值，y轴为od450值，采用四参数拟合s型曲线，得到ed50。
13、优选的，步骤(1)所述不同浓度为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml、0.156μg/ml、0.078μg/ml。
14、优选的，步骤(2)所述细胞维持液为培养hips-b1的完全培养基。
15、有益效果：
16、本发明检测方法对vtn蛋白活性的定量检测，检测过程中不涉及细胞计数等引入人员操作误差的过程，受试验人员、试验条件变化影响较小，操作准确、便捷，检测周期短，方法稳定性较好，可同时快速进行多批次vtn的活性检测。
1.一种基于hips细胞的vitronectin生物学活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于hips细胞的vitronectin生物学活性检测方法，其特征在于，步骤(1)所述不同浓度为20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.313μg/ml、0.156μg/ml、0.078μg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种基于hips细胞的vitronectin生物学活性检测方法，其特征在于，步骤(2)所述细胞维持液为培养hips-b1的完全培养基。
