1.本发明涉及一种肺结核评价的血清代谢标志物及其应用，属于生物检测技术领域。
背景技术：2.结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculos is，mtb)感染引起的一种广泛存在且在许多情况下可致命的慢性传染病，可侵袭累及许多脏器，其中肺部感染占绝大部分。全球结核病治疗结局数据显示，全球结核病复发率为2.3-6.5％，而中国的复发率为11.8％。由于痰涂片的特异性较低，目前只能根据临床症状、胸部ct和药物疗程来判断是否治愈结核病。然而，影像学证据是非特异性的，目前仍缺乏评价结核病治疗效果的实验室标准，有必要进一步进行研究。
技术实现要素：3.为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种肺结核评价的血清代谢标志物，该代谢标志物适用于肺结核情况的评价，结果精确度高，有利于提高评价效率。
4.本发明的第二个目的在于提供一种上述血清代谢标志物的应用。
5.实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种肺结核评价的血清代谢标志物，包括：木通皂苷、α-酮戊二酸、苄胺、纤维二糖、脱氢胆酸、胍基琥珀酸、左旋葡聚糖、来苏糖酸-1,4-内酯、甲羟孕酮17-乙酸酯、单硬脂酸、奥那斯酮、草酰胺、帕利哌酮、磺基石胆酸、舒尼替尼和柠檬酸三丁酯醋酸酯中的至少一种。
6.进一步地，包括：木通皂苷、α-酮戊二酸、苄胺、纤维二糖、脱氢胆酸、胍基琥珀酸、左旋葡聚糖、来苏糖酸-1,4-内酯、甲羟孕酮17-乙酸酯、单硬脂酸、奥那斯酮、草酰胺、帕利哌酮、磺基石胆酸、舒尼替尼和柠檬酸三丁酯醋酸酯。
7.实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种肺结核评价的血清代谢标志物的应用，将如上所述的血清代谢标志物用于制备试剂；试剂用于对肺结核进行评价。
8.进一步地，试剂对血清代谢标志物进行定性。
9.或者，实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种肺结核评价的血清代谢标志物的应用，将如上所述的血清代谢标志物应用于肺结核治疗效果的评价。
10.进一步地，获得血清代谢标志物在血清中的相对表达量以进行肺结核治疗效果的评价。
11.进一步地，相对表达量以lc-ms和gc-ms方法结合获得。
12.进一步地，待检样本的相对表达量＜未进行治疗的结核病患者样本的相对表达量，则认为待检样本的肺结核治疗有效。
chromatography-mass spectrometr，lc-ms)。gc-ms更适合分析小分子、热不敏感、可挥发、能气化的化合物。且具有较高的分辨率和灵敏度；并且有可利用的较为经济的统一规范的质谱数据库。相对于gc-ms，lc-ms更偏向分析较高极性、更高相对分子质量和对热敏感的化合物，且无需像gc-ms一样做复杂的化学衍生化等样品前处理。lc-ms更适用于复杂生物样本中代谢产物的检测与潜在的生物标记物的鉴定。
32.实施例中实验设备及生产商：
33.质谱仪-thermo qe
34.液相色谱仪-thermo vanquish uhplc
35.液相色谱柱-thermo hyperil gold column
36.气相色谱-agilent 7890a
37.气相质谱仪-leco pegasus ht
38.气相色谱柱-agilent db-5ms(30m
×
250μm
×
0.25μm)
39.实施例中试剂及生产商：
40.乙腈(acetonitrile)-merck
41.甲醇(methanol)-merck
42.甲酸(formic acid)-cnw
43.超纯水(ultrapure water)-merck
44.氯仿(chloroform)-adamas
45.吡啶(pyridine)-adamas
46.甲氧铵盐(methoxyaminatiohydrochloride)-tci
47.核糖醇(adonitol)-sigma
48.l-2-氯苯丙氨酸(2-chloro-l-phenylalanine)-上海恒柏生物科技
49.bstfa(with 1％tmcs，v/v)-regis technologies
50.饱和脂肪酸甲酯(fames)-dr.ehrenstorfer
51.实施例1：
52.血清代谢标志物的筛选：
53.1、取经2hrze/4hr标准治疗方案治疗6个月的初治活动性肺结核17例(t6)，清晨空腹血清，1小时之内80℃保存，未行抗结核药物治疗肺结核患者血清17例(t0)，1小时之内80℃保存，待样品收集完后，按下列方法统一处理。2hrze/4hr标准治疗方案的具体情况为：使用一线药物利福平(rifampin)、异烟肼(isonizid)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、乙胺丁醇(ethambutol)联合治疗两个月，后继续服用异烟肼和利福平4个月。
54.2、血清样本的处理方法
55.气相色谱血清样本处理方法：
56.①
取血清样本100μl于1.5ml ep管中，加入300μl提取液(甲醇)，再加入10μl l-2-氯苯丙氨酸，涡旋30s；
57.②
超声10min(冰水浴)；
58.③
将样本4℃离心，12000rpm离心15min；
59.④
小心移取300μl上清液与1.5ml ep管中，每个样本各取60μl混合成qc样本；
60.⑤
在真空浓缩器中干燥提取物；
61.⑥
向干燥后的代谢物加入60μl甲氧胺盐试剂(甲氧胺盐酸盐，溶于吡啶20mg/ml)，轻轻混匀后，放入烘箱中80℃孵育30min；
62.⑦
向每个样品中加入80μl bstfa(含有1％tmcs，v/v)，将混合物70℃孵育1.5h；
63.⑧
冷却至室温，向混合的样本中加入5μl fames(溶于氯仿)；
⑨
实验样本随机顺序上机检测。
64.液相色谱血清样本处理方法：
65.取100μl血清样本置于ep管中，加入400μl加入甲醇溶液，涡旋震荡，冰浴静置5min，15000rpm、4℃离心10min，取一定量的上清加质谱级水稀释至甲醇含量为60v/v％，并置于带有0.22μm滤膜的离心管中15000g、4℃离心10min，收集滤液，进样lc-ms进行分析。
66.3、色谱技术条件
67.①
气相色谱条件为：进样量：0.8μl，分流(分流比30:1)，进样口温度：230℃，柱箱升温程序：50℃(1min)，以20℃/min升至310℃保持6min。
68.②
液相色谱条件为：柱温：40℃，流速：0.2ml/min，正模式：流动相a：0.1v/v％甲酸、流动相b：甲醇，负模式：流动相a：5mm醋酸铵，ph9.0、流动相b：甲醇；
69.色谱梯度洗脱程序如表格1所示：
70.表格1色谱梯度洗脱程序
71.时间a％b％09821.598212010014010014.198216982
72.4、质谱数据采集和分析
73.①
gc-ms具体分析条件如下：进样量：1μl，分流模式：splitless mode，隔垫吹扫流速：3ml min-1
，载气：helium，柱流速：1ml min-1
，柱箱升温程序：50℃保温1min，然后以每分钟升温20℃的速度，将温度升至310℃，并在此温度下保持6min。前进样口温度：280℃，传输线温度：280℃，离子源温度：250℃，电离电压：-70ev，质量范围：m/z：50-500，扫描速率：12.5spectra/每秒，溶剂延迟：4.78min；
74.②
lc-ms条件如下：扫描范围选择m/z：70-1050；esi源的设置如下：spray voltage：3.2kv；sheath gas flow rate：35arb；aux gasflow rate：10arb；capillary temp：320℃.polarity：positive；negative；ms/ms二级扫描为data-dependent scans。
75.质谱数据采集在常规方法上增加gc-ms方法，采用lc-ms和gc-ms进行整合的非靶向代谢组共同鉴定获得，有助于提高代谢标志物鉴定的数量，双平台鉴定有利于提高代谢标志物鉴定的数量和准确性，区别于以往的胸部ct和药物疗程来判断疗效，为肺结核患者疗效评价提供一种全新的治疗靶标。
76.5、非靶向代谢组数据处理
77.①
基于gc-ms检测技术，结合使用了leco-fiehn rtx 5数据库，对分子特征峰进行匹配鉴定。下机原始数据使用chroma tof软件(v4.3x，leco)数据处理软件进行数据搜库预
处理，首先通过保留时间、质荷比对数据进行简单筛选并进行峰对齐；然后通过xic图中的质荷比确定化合物的精确分子量，根据质量数偏差、加合物离子信息进行分子式预测；通过与leco-fiehn rtx5数据库中每个化合物的碎片离子、碰撞能等信息进行匹配，对生物体系中的代谢物进行鉴定。然后选取qc样本中cv(coefficient of variance)值小于30％的化合物作为最终的鉴定结果，进行后续分析；
78.②
基于高分辨质谱(hrms)检测技术，结合由标准品构建的高质量mzcloud数据库搭配chemspider数据库。下机原始数据使用cd数据处理软件进行数据搜库预处理，首先通过保留时间、质荷比对数据进行简单筛选并进行峰对齐；然后通过高分辨xic图中的质荷比确定化合物的精确分子量，根据质量数偏差、加合物离子信息进行分子式预测；通过与mzcloud数据库中每个化合物的碎片离子、碰撞能等信息进行匹配，对生物体系中的代谢物进行鉴定，然后选取qc样本中cv(coefficient of variance)值小于30％的化合物作为最终的鉴定结果，进行后续分析。
79.6、数据质控
80.基于峰面积值来计算qc样本之间的pearson相关系数，qc样本相关性越高(r2越接近于1)说明整个检测过程稳定性越好，数据质量越高；
81.使用metax软件对数据进行对数转换及中心化格式化处理。将所有实验样本和qc样本提取得到的峰，经uv处理后进行pca分析。qc样本差异越小说明整个方法稳定性越好数据质量越高，体现在pca分析图上就是qc样本的分布会聚集在一起。
82.7、代谢标志物筛选
83.1)采用pca的方法，观察两组样本之间的总体分布趋势，
84.2)建立各比较组的opls-da模型，经7-fold cross-validation得到的模型评价参数(r2，q2)，如果r2和q2越接近1，表明模型越稳定可靠。
85.gc-ms和lc-ms两种方法的pca模型和opls-da的得分图如图1-6所示。
86.3)组间潜在生物标志物鉴定
87.本次实验采用t6组和t0组的opls-da模型第一主成分的变量投影重要度(variable importance in the projection，vip)值，vip值表示不同分组中代谢物差异的贡献率，并结合t-test的p值分别比较了这些代谢标志物在t6组和t0组是否存在差异。异性代谢物的定性方法为：搜索在线数据库(hmdb)(比较质谱的质荷比m/z或者精确分子质量mass，误差限制0.01da)。设置与t0的倍数＞2，vip》1，p值＜0.05，找出了16个有意义的代谢标志物，如表格2所示，代谢标志物的名称、id、差异倍数、vip值和p值。
88.表格2代谢标志物的数据
[0089][0090]
实施例2：
[0091]
根据表格2中的16个代谢标志物建立了如下评价初治活动性肺结核患者经2hrze/4hr标准治疗方案治疗6个月是否有效的方法：
[0092]
对待测患者血清进行lc-ms以及gc-ms检测，分别得到以上16个代谢标志物的相对表达量；2
×
待检样本中16个血清代谢物中至少一种的相对表达量＜未进行治疗的结核病患者样本的相对表达量，则认为待检样本的肺结核治疗有效。
[0093]
分析：
[0094]
采用spss软件进行基于logistic模型的受试者工作特征曲线(receive operating characteristic curve，roc曲线)计算，获得16个代谢标志物及其组合的roc曲线下面积(the area under the roc curve，auc)。在95％可信区间，计算敏感性、特异性和
可信区间，16个代谢物的auc在0.635-0.984之间，16个代谢物组合的auc为1.000，如图7所示。
[0095]
实施例3：
[0096]
肺结核患者疗效评价的验证
[0097]
选取与筛选样本同一来源的17例初治的肺结核患者，取经2hrze/4hr标准治疗方案治疗2个月(即经过hrze)(t2)且治愈时的血清与未行抗结核药物治疗对比，按照实施例1中的基于肺结核患者特异性的血清代谢标志物的筛选方法，分别得到16种代谢标志物的数据，如表格3所示，16个代谢标志物包括木通皂苷(akeboside ste)、α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid)、苄胺(benzylamine)、纤维二糖(cellobiose)、脱氢胆酸(dehydrocholic acid)、胍基琥珀酸(guanidinosuccinic acid)、左旋葡聚糖(levoglucosan)、来苏糖酸-1,4-内酯(lyxonic acid,1,4-lactone)、甲羟孕酮17-乙酸酯(medroxyprogesterone 17-acetate)、单硬脂酸(monostearin)、奥那斯酮(onapristone)、草酰胺(oxamide)、帕利哌酮(paliperidone)、磺基石胆酸(sulfolithocholic acid)、舒尼替尼(sunitinib)和柠檬酸三丁酯醋酸酯(tributyl citrate acetate)。
[0098]
检测结果均与实施例1中的评价待测活动性肺结核患者的治疗效果的方法中的表述一致，说明检测待测患者活动性肺结核疗效的方法准确，可以用于活动性肺结核的疗效评价，具有良好的临床使用和推广价值。
[0099]
表格3代谢标志物的数据
[0100][0101]
实施例4：
[0102]
区分待测患者为活动性肺结核患者的验证
[0103]
常规留取结核潜伏感染患者16例(lt)以及初诊为肺结核且未进行治疗的患者17例(t0)，按照实施例1中的基于肺结核患者特异性的血清代谢标志物的筛选方法，得到有显著差异的13种代谢物及其相对表达量，13个代谢标志物包括木通皂苷(akeboside ste)；α-酮戊二酸(alpha-ketoglutaric acid)；苄胺(benzylamine)；纤维二糖(cellobiose)；脱氢胆酸(dehydrocholic acid)；胍基琥珀酸(guanidinosuccinic acid)；左旋葡聚糖(levoglucosan)；来苏糖酸-1,4-内酯(lyxonic acid,1,4-lactone)；单硬脂酸(monostearin)；奥那斯酮(onapristone)；草酰胺(oxamide)；帕利哌酮(paliperidone)；磺基石胆酸(sulfolithocholic acid)。检测结果表明：如表格4所示，初诊为活动性肺结核且未进行治疗的患者血清中有13种代谢标志物的相对表达量均大于两倍lt组平均值。因此，本发明的代谢标志物可以有效地评价待测样品来源是否为活动性肺结核。
[0104]
表格4代谢标志物的数据
[0105][0106][0107]
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
技术特征：1.一种肺结核评价的血清代谢标志物，其特征在于包括：木通皂苷、α-酮戊二酸、苄胺、纤维二糖、脱氢胆酸、胍基琥珀酸、左旋葡聚糖、来苏糖酸-1,4-内酯、甲羟孕酮17-乙酸酯、单硬脂酸、奥那斯酮、草酰胺、帕利哌酮、磺基石胆酸、舒尼替尼和柠檬酸三丁酯醋酸酯中的至少一种。2.如权利要求1所述的肺结核评价的血清代谢标志物，其特征在于包括：木通皂苷、α-酮戊二酸、苄胺、纤维二糖、脱氢胆酸、胍基琥珀酸、左旋葡聚糖、来苏糖酸-1,4-内酯、甲羟孕酮17-乙
①
酸酯、单硬脂酸、奥那斯酮、草酰胺、帕利哌酮、磺基石胆酸、舒尼替尼和柠檬酸三丁酯醋酸酯。3.一种肺结核评价的血清代谢标志物的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的血清代谢标志物用于制备试剂；所述试剂用于对肺结核进行评价。4.如权利要求3所述的肺结核评价的血清代谢标志物的应用，其特征在于，所述试剂对血清代谢标志物进行定性。5.一种肺结核评价的血清代谢标志物的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的血清代谢标志物应用于肺结核治疗效果的评价。6.如权利要求5所述的肺结核评价的血清代谢标志物的应用，其特征在于，获得血清代谢标志物在血清中的相对表达量以进行肺结核治疗效果的评价。7.如权利要求6所述的肺结核评价的血清代谢标志物的应用，其特征在于，所述相对表达量以lc-ms和gc-ms方法结合获得。8.如权利要求6所述的肺结核评价的血清代谢标志物的应用，其特征在于，待检样本的相对表达量＜未进行治疗的结核病患者样本的相对表达量，则认为待检样本的肺结核治疗有效。9.如权利要求8所述的肺结核评价的血清代谢标志物的应用，其特征在于，2
×
待检样本的相对表达量＜未进行治疗的结核病患者样本的相对表达量，则认为待检样本的肺结核治疗有效。
技术总结本发明公开了一种肺结核评价的血清代谢标志物及其应用，肺结核评价的血清代谢标志物包括：木通皂苷、α-酮戊二酸、苄胺、纤维二糖、脱氢胆酸、胍基琥珀酸、左旋葡聚糖、来苏糖酸-1,4-内酯、甲羟孕酮17-乙酸酯、单硬脂酸、奥那斯酮、草酰胺、帕利哌酮、磺基石胆酸、舒尼替尼和柠檬酸三丁酯醋酸酯中的至少一种；血清代谢标志物可用于制备试剂，或应用于肺结核治疗效果的评价；该代谢标志物适用于肺结核情况的评价，结果精确度高，有利于提高评价效率。有利于提高评价效率。有利于提高评价效率。
技术研发人员：魏文静 巫株华 张晨晨 陈亮 王雪枝 余美玲 赵雨川 彭柯皓 徐华丽 黄珊珊 魏然 李观海
受保护的技术使用者：广东省结核病控制中心
技术研发日：2022.03.31
技术公布日：2022/7/5
