本发明属于蛋白工程，涉及一种神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白及其表达与应用。
背景技术：
1、肉毒毒素(botulinum toxin，bont)是已知微生物毒素中毒性最强的物质，其对人类的致死量为0.1～1.0μg,相当于3000～30000只小鼠半致死量(lethal dose，50％，ld50)，①经消化道吸收进入血液循环及淋巴循环(例如:食物源性肉毒中毒和婴儿肉毒中毒)；②通过伤口直接进入血液循环(例如:创伤肉毒中毒)。
2、a型肉毒素，其商用通用名为注射用a型肉毒素，是一种细菌外毒素，它可以阻断神经和肌肉之间的传递，使过度收缩的肌肉达到松弛从而除皱的效果，在医疗美容市场上应用广泛。目前市售的注射用a型肉毒素的活性药用成分为a型肉毒毒素复合物，以肉毒毒素复合体形式存在，由a型肉毒神经毒素(150kd)、血凝素蛋白(ha)和非毒素非血凝素蛋白(ntnh)通过非共价键组成的复合物，存在于天然肉毒梭菌的厌氧发酵培养基中，通过一系列提取沉淀等工艺纯化得到肉毒神经毒素(主要作用成分)；其中，起主要临床作用的为a型肉毒素神经毒素，由一条分子量为50kda的轻链和分子量为100kda的重链通过一对二硫键连接，重链负责与神经细胞膜受体结合并将轻链内化入神经细胞，轻链特异性裂解与突触相关的膜蛋白snap25，从而阻断神经递质乙酰胆碱释放而引起肌肉麻痹，达到去皱的作用，但是全长肉毒素具有难以高效表达和分泌，且大肠杆菌表达出的全长肉毒素很难具有正确的空间构象及正确的二硫键等问题。最终发挥毒素效应的是轻链，然而没有重链的条件下轻链无法自己穿透神经细胞膜进入神经细胞内部发挥snap25底物酶切的效应，且单纯的轻链易受到蛋白水解酶降解。因此，具有特异性识别神经细胞并穿透细胞膜进入细胞而不引起构象发生变化的穿膜肽可以被用来代替重链来引导轻链进入靶细胞发挥其生物活性。rvg29穿膜肽是从rvg受体识别关键序列中衍生的由29个氨基酸(ytiwmpenprpgtpcdiftnsrgkrasng)组成的短肽，具有高度嗜神经性，且具有极低的免疫原性，能够特异性识别神经受体、以能量依赖的方式选择性地进入神经细胞，是肉毒素重链最佳的替代物(王禾，张振昶等人“狂犬病毒糖蛋白中多肽片段作为脑靶向药物载体的研究进展”，中国细胞生物学学报，2022,44(11):2199-2206)。
3、根据杨仲璠,薛峰,肖在滢,等人的报道(“治疗用a型肉毒毒素的制备及其质量控制”[j].微生物学免疫学进展,1999,(03):43-46.)，目前，市售肉毒毒素均通过发酵培养天然肉毒梭菌，随后再进行一系列复杂的分离和纯化手段来生产肉毒素(botulinum toxin，bont)的，这种方式复杂危险，工艺成本高且蛋白产量低。因此异源表达系统允许使用简单安全的培养基，工艺安全性提高，生产工艺也能得到简化，从而使大规模工业生产肉毒素成为可能。但是，构建全功能重组bont并非易事，专利wo0012728报道了以大肠杆菌作为底盘菌株，诱导表达全功能重组bont/a的方法，使得肉毒素神经毒素蛋白表达量占总蛋白质的6％-35％范围内，但是产品缺乏成熟的二硫键结构，因而无法发挥天然梭菌肉毒素神经毒素特异性切割与突触相关的膜蛋白而阻断神经递质的功效，且表达量低无法有效分泌至细胞外。
4、因此，目前亟需研究开发一种代替全长肉毒素发挥除皱功效且安全性能提高的产品。
技术实现思路
1、本发明的目的之一在于针对现有技术的不足提供一种神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白，该重组蛋白具有高效的神经细胞靶向性，可完全替代市面上的全长肉毒素产品，且安全性更高，也更易表达。
2、本发明的目的之二在于提供表达上述神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白的重组基因工程菌，该重组基因工程菌具有高效的神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素重组蛋白分泌水平。
3、为此，本发明第一方面提供了一种神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白，其为由神经细胞靶向性穿膜肽连接于肉毒素轻链蛋白的n端或c端构成的蛋白质。
4、本发明中，所述神经细胞靶向性穿膜肽能够完全替代肉毒素重链来引导轻链特异性穿透神经细胞进入细胞质，其氨基酸残基≤30，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
5、优选地，所述肉毒素轻链蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
6、本发明第二方面提供了一种编码本发明第一方面所述的穿膜肽肉毒素重组蛋白的核苷酸分子，其为由编码神经细胞靶向性穿膜肽的核苷酸分子连接于编码肉毒素轻链蛋白的核苷酸序列的3′端或5′端构成的核苷酸分子；其中，所述编码神经细胞靶向性穿膜肽的核苷酸分子的序列如seq id no.2所示。
7、优选地，编码所述肉毒素轻链蛋白的肉毒素轻链基因的核苷酸序列如seq idno.4所示。
8、本发明第三方面提供了一种含有本发明第二方面所述的核苷酸分子的表达盒。
9、本发明第四方面提供了一种用于表达如本发明第一方面所述的穿膜肽肉毒素重组蛋白的核苷酸分子的重组载体。
10、优选地，所述重组载体为ptrxa-gub-ftsy。
11、本发明第五方面提供了一种表达如本发明第一方面所述的穿膜肽肉毒素重组蛋白的重组基因工程菌，其由本发明第二方面所述的核苷酸分子的序列通过添加linker序列融合于编码肉毒素轻链蛋白的核苷酸分子序列的3′端或5′端，然后在宿主细胞中表达获得。
12、优选地，所述linker序列为ggggs或(ggggs)n。
13、优选地，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌wb800n。
14、本发明第六方面提供了本发明第一方面所述的神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白或由本发明第二方面所述的核苷酸分子编码的穿膜肽重组蛋白或如本发明第三方面所述的表达盒或如本发明第四方面所述的重组载体或如本发明第五方面所述的重组基因工程菌制得的神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白在制备肉毒素产品中的应用。
15、本发明通过大量前期神经细胞穿膜实验，筛选获得一种可以有效引导轻链穿透神经细胞进入细胞质的穿膜肽rvg29。其中，穿膜肽与肉毒素轻链通过基因重组方式获得穿膜肽重组轻链蛋白。由于所述重组蛋白不含有血凝素等复合物蛋白，相比于botox，衡力等产品免疫原性更低，患者可以避免因多次使用产品导致的效力降低的可能性。且相对于市面上的全长肉毒素，该产品生产安全性更高，且能实现高效的分泌表达。
16、本发明以枯草芽孢杆菌wb800n为底盘菌，pht43为表达载体，通过对枯草芽孢杆菌内源性强启动子的筛选和理性改造以及强启动子的双串联构建，使目的蛋白的胞内表达水平达到1g/l以上，最高可达1.175g/l；通过signalp6.0、tmhmm2.0以及wolf psort等数据库预测和筛选了pel，apre，npr，ppb4，gub等一系列不同的信号肽，最终筛选出分泌效果较优的三种信号肽，使肉毒素轻链蛋白首次实现在枯草芽孢杆菌的分泌表达，且分泌水平显著提升，再通过对信号识别粒子受体ftsy的过表达，最终使目的蛋白分泌表达量达到475mg/l，为产品的工业化生产和简化下游纯化、降低成本带来了可能性。
1.一种神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白，其为由神经细胞靶向性穿膜肽连接于肉毒素轻链蛋白的n端或c端构成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的穿膜肽肉毒素重组蛋白，其特征在于，所述神经细胞靶向性穿膜肽能够完全替代肉毒素重链来引导轻链特异性穿透神经细胞进入细胞质，其氨基酸残基≤30，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的穿膜肽肉毒素重组蛋白，其特征在于，所述肉毒素轻链蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
4.一种编码如权利要求1-3中任意一项所述的穿膜肽肉毒素重组蛋白的核苷酸分子，其为由编码神经细胞靶向性穿膜肽的核苷酸分子连接于编码肉毒素轻链蛋白的核苷酸序列的3′端或5′端构成的核苷酸分子；其中，所述编码神经细胞靶向性穿膜肽的核苷酸分子的序列如seq id no.2所示。
5.根据权利要求4所述的核苷酸分子，其特征在于，编码所述肉毒素轻链蛋白的肉毒素轻链基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
6.一种含有权利要求4或5所述的核苷酸分子的表达盒。
7.一种用于表达编码如权利要求1-3中所述的穿膜肽肉毒素重组蛋白的核苷酸分子的重组载体。
8.根据权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为ptrxa-gub-ftsy。
9.一种表达如权利要求1-3中所述的穿膜肽肉毒素重组蛋白的重组基因工程菌，其由权利要求4或5所述的核苷酸分子的序列通过添加linker序列融合于编码肉毒素轻链蛋白的核苷酸分子序列的3′端或5′端，然后在宿主细胞中表达获得；
10.根据权利要求1-3中任意一项所述的神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白或由权利要求4或5所述的核苷酸分子编码的穿膜肽重组蛋白或如权利要求6所述的表达盒或如权利要求7或8所述的重组载体或如权利要求9所述的重组基因工程菌制得的神经细胞靶向性穿膜肽-肉毒素轻链重组蛋白在制备肉毒素产品中的应用。
