本发明属于生物检测，具体涉及一种用于肝癌检测的甲基化生物标记物组合物、核酸组合物及其试剂盒的应用。
背景技术：
1、原发性肝细胞癌(hepatocellulaar，hcc)是全世界常见的恶性肿瘤之一，也是慢性肝病患者最常见的死亡原因。肝癌的发病特点大多遵循乙型肝炎-肝硬化-肝癌的“三步曲”模式，约85%hcc是由hbv感染引起。
2、随着诊疗技术水平的提高，hcc防治工作取得长足进步，但由于hcc起病隐匿、进展迅速，大多数病例确诊时已处于中晚期，因此，hcc早期筛查和诊断成为关键。afp是诊断肝癌的血清标志物之一，但约30%的肝癌患者血清afp始终为阴性，且在一些慢性肝炎、肝硬化等肝癌的高危人群中afp也会升高。afp在早期肝癌检测中，假阴性较高，作为肝癌的早期筛查指标不十分理想。
3、外周血cfdna甲基化检测，是近年肿瘤另一种无创早期诊断方法。相比于血液afp水平，游离dna甲基化标记物用于肝癌检测具有更高的灵敏度和特异性。尽管有研究已经初步报道了一些肝癌的游离dna甲基化标记物，然而这些标志物绝大部分筛选于450k甲基化芯片数据，仅覆盖了不到2%的人类基因组甲基化位点。
4、因此，使用更为全面的标志物筛选策略和方法是开发更准确的肝癌甲基化标志物的关键。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于肝癌检测的甲基化生物标记物组合物，该试剂盒所用的dna甲基化标记物和组合物是从覆盖率10倍于450k甲基化芯片的基因组区域所筛选获得，在本发明所用的样本数据集中，所筛选的标记物和组合物的检测性能最优。
2、本发明通过以下技术方案实现：
3、一种用于肝癌检测的甲基化生物标记物组合物，所述甲基化生物标记物组合物为chr2:25216400-25216752、chr6:26250469-26250942、chr17:30970348-30970741、chr5:42992299-42992764、chr14:53955979-53956219和chr2:63054088-63054326的组合；
4、所述甲基化生物标记物来源于hg38人类基因组；
5、所述甲基化水平为分子标记物上的cpg位点的甲基化水平。
6、一种用于肝癌检测的核酸组合物，包括用于检测所述的chr2:25216400-25216752甲基化的第一核酸组合、用于检测chr6:26250469-26250942甲基化的第二核酸组合、用于检测chr17:30970348-30970741甲基化的第三核酸组合、用于检测chr5:42992299-42992764甲基化的第四核酸组合、用于检测chr14:53955979-53956219甲基化的第五核酸组合和用于检测chr2:63054088-63054326甲基化的第六核酸组合。
7、作为优选地，所述第一核酸组合包括引物对1，所述引物对1的碱基序列与seq idno.1-2所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
8、所述第二核酸组合包括引物对2，所述引物对2的碱基序列与seq id no.3-4所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
9、所述第三核酸组合包括引物对3，所述引物对3的碱基序列与seq id no.5-6所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
10、所述第四核酸组合包括引物对4，所述引物对4的碱基序列与seq id no.7-8所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
11、所述第五核酸组合包括引物对5，所述引物对5的碱基序列与seq id no.9-10所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
12、所述第六核酸组合包括引物对6，所述引物对6的碱基序列与seq id no.11-12所示的碱基序列具有至少90%的一致性。
13、作为优选地，所述第一核酸组合还包括探针1，所述探针1的碱基序列与seq idno.13所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
14、所述第二核酸组合还包括探针2，所述探针2的碱基序列与seq id no.14所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
15、所述第三核酸组合还包括探针3，所述探针3的碱基序列与seq id no.15所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
16、所述第四核酸组合还包括探针4，所述探针4的碱基序列与seq id no.16所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
17、所述第五核酸组合还包括探针5，所述探针5的碱基序列与seq id no.17所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
18、所述第六核酸组合还包括探针6，所述探针6的碱基序列与seq id no.18所示的碱基序列具有至少90%的一致性。
19、一种用于肝癌检测的试剂产品，所述试剂产品中包含所述的甲基化生物标记物组合物及所述的核酸组合物。
20、作为优选地，所述试剂产品为试剂、试剂盒、芯片和测序文库中的任意一种。
21、一种用于肝癌检测的试剂盒，所述的试剂产品为试剂盒时，还包括阳性对照、阴性对照、内参基因的检测引物、内参基因的检测探针、dna聚合酶和缓冲液。
22、作为优选地，所述内参基因为actb基因。
23、作为优选地，所述试剂盒的检测样本包括离体血液样本；所述离体血液样本选自离体血浆样本、离体血清样本、离体全血样本或离体血细胞样本。
24、在上述探针的5’端标记有荧光报告基团，在上述探针的3’端标记有荧光猝灭基团，通过荧光标记以便于更好的实现信号的放大，实现高灵敏度地检测。
25、一种实施方式中，上述探针为taqman探针。
26、上述荧光报告基团为hex、fam、tet、cf532、joe、tamra、rox、cy3、cy5、texas red、ned、alexa flour或vic，淬灭基团为mgb、tamra、bhq1、bhq2、bhq3或qsy。
27、在本发明应用较佳的实施方式中，上述甲基化水平通过如下至少一种的方法进行检测：甲基化特异性pcr法、测序法、甲基化特异性高效液相层析法、数字pcr法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化特异性微阵列法、甲基化敏感性限制性内切酶法和flapendonucleas法。
28、上述测序法选自亚硫酸氢盐测序法、全基因组甲基化测序、靶向甲基化测序法或焦磷酸测序法。
29、与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：
30、（一）本发明提供了一种肝癌分子标记物组合及检测试剂盒，所述分子标记物组合为包括chr2:25216400-25216752、chr6:26250469-26250942、chr17:30970348-30970741、chr5:42992299-42992764、chr14:53955979-53956219、chr2:63054088-63054326共六个生物标记物的组合物，用于检测肝癌异常甲基化上升的信号，具有理想的检测特异性与灵敏度。
31、（二）本发明联合多个辅助肝癌检测相关的分子标记物来预测早期肝癌，在单一甲基化标记物的基础上能够进一步显著提高早期肝癌的检出率，避免错检、漏检的问题。
32、（三）该试剂盒所用的dna甲基化标记物和组合物是从覆盖率10倍于450k甲基化芯片的基因组区域所筛选获得，在本发明所用的样本数据集中，所筛选的标记物和组合物的检测性能最优。
33、（四）标志物筛选过程中采用的甲基化测序均基于酶转化的方法进行进行胞嘧啶到尿嘧啶的转化，相比于传统的重亚硫酸盐转化，可以避免对dna的损伤，从而解决血液游离dna含量较低的问题
34、（五）本发明所提供的分子标记物组合及其试剂盒与大规模ngs测序相比操作简单、检测成本低廉，可以快速、准确地对肝癌患者进行合理的辅助鉴别。
1.一种用于肝癌检测的甲基化生物标记物组合物，其特征在于，所述甲基化生物标记物组合物为chr2:25216400-25216752、chr6:26250469-26250942、chr17:30970348-30970741、chr5:42992299-42992764、chr14:53955979-53956219和chr2:63054088-63054326的组合；
2.一种用于肝癌检测的核酸组合物，其特征在于，包括用于检测如权利要求1所述的chr2:25216400-25216752甲基化的第一核酸组合、用于检测chr6:26250469-26250942甲基化的第二核酸组合、用于检测chr17:30970348-30970741甲基化的第三核酸组合、用于检测chr5:42992299-42992764甲基化的第四核酸组合、用于检测chr14:53955979-53956219甲基化的第五核酸组合和用于检测chr2:63054088-63054326甲基化的第六核酸组合。
3.根据权利要求2所述的一种用于肝癌检测的核酸组合物，其特征在于，所述第一核酸组合包括引物对1，所述引物对1的碱基序列与seq id no.1-2所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
4.根据权利要求3所述的一种用于肝癌检测的核酸组合物，其特征在于，所述第一核酸组合还包括探针1，所述探针1的碱基序列与seq id no.13所示的碱基序列具有至少90%的一致性；
5.一种用于肝癌检测的试剂产品，其特征在于，所述试剂产品中包含如权利要求1所述的甲基化生物标记物组合物及如权利要求2-4任一项所述的核酸组合物。
6.根据权利要求5所述的一种用于肝癌检测的试剂产品，其特征在于，所述试剂产品为试剂、试剂盒、芯片和测序文库中的任意一种。
7.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，如权利要求6所述的试剂产品为试剂盒时，还包括阳性对照、阴性对照、内参基因的检测引物、内参基因的检测探针、dna聚合酶和缓冲液。
8.根据权利要求7所述的一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述内参基因为actb基因。
9.根据权利要求7所述的一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本包括离体血液样本；所述离体血液样本选自离体血浆样本、离体血清样本、离体全血样本或离体血细胞样本。
