本发明属于病毒检测，具体是指一种哈桑病毒实时等温重组酶聚合酶检测试剂盒和方法。
背景技术：
1、哈桑病毒(khasan virus)是白蛉纤细病毒科(phenuiviridae)白蛉病毒属(phlebovirus)的一种病毒，基因组为单股负链分段rna。哈桑病毒是1971年在俄罗斯的哈桑区森林中，从梅花鹿身上采集的蜱虫中被首次分离得到。哈桑病毒主要通过蜱虫叮咬传播，可感染牛、羊、马、猪和鹿等哺乳动物，是一种潜在的人畜共患传染病的病原体。传统荧光探针pcr技术存在的耗时长、仪器设备要求高、无法实现野外、床旁检测等缺陷。
2、因此，有必要开发一种灵敏度高、耗时短、特异性强、检测准确性高、重复性好的哈桑病毒的检测引物或产品。
技术实现思路
1、本发明的目的在于克服传统荧光探针pcr技术存在的耗时长、仪器设备要求高、无法实现野外、床旁检测等缺陷，提供了一种哈桑病毒双通道恒温检测引物对、探针、试剂盒及方法，能在25分钟内准确且灵敏地检测出哈桑病毒，且特异性强、防污染、防假阳性。针对这种哈桑病毒的全基因组序列信息，本发明提供了一种基于重组酶聚合酶技术的哈桑病毒双通道恒温检测引物和探针、检测试剂盒及检测方法，目的在于满足操作简单、快速、灵敏和准确的检测需求。
2、本发明是这样实现的：
3、本发明的目的之一在于提供一种基于重组酶聚合酶技术的哈桑病毒双通道恒温检测引物和探针，包括哈桑病毒特异性引物如seq id no.1-2所示及其探针如seq id no.3所示。
4、本发明的目的之二在于提供一种哈桑病毒双通道恒温检测试剂盒，包括所述的基于重组酶聚合酶技术的检测引物和探针，以及m13噬菌体内部阳性质控特异性探针包括如seq id no.4所示。
5、进一步地，还包括：
6、酶混合物：包含逆转录酶、重组酶、链置换dna聚合酶、ung酶和单链结合蛋白的混合物
7、2×反应缓冲液：包含dntp和dutp等的缓冲液；
8、醋酸镁：280mm的醋酸镁溶液；
9、阳性对照品：含哈桑病毒阳性标准品的t克隆质粒溶液；
10、m13噬菌体内部阳性质控品：含m13噬菌体序列的t克隆质粒溶液；
11、阴性对照品：超纯无菌水。
12、本发明的目的之三在于提供所述哈桑病毒的双通道恒温检测引物对与探针在制备用于检测哈桑病毒的试剂盒中的应用。
13、本发明的目的之四在于提供一种所述的哈桑病毒的双通道恒温检测试剂盒的使用方法，所述方法包括利用所述的哈桑病毒的双通道恒温检测引物对与探针进行双通道实时恒温荧光扩增。
14、进一步地，所述方法包括如下步骤：
15、以样品rna为模板，配制扩增反应体系进行双通道恒温扩增得到扩增曲线，对所述扩增曲线进行分析，并作出判断；所述扩增反应体系包括所述的哈桑病毒的双通道恒温检测引物对和探针。
16、进一步地，所述扩增反应体系包括：样品rna模板、所述的哈桑病毒的双通道恒温检测引物对和探针、无菌超纯水、2×反应缓冲液、m13噬菌体内部阳性质控品溶液、醋酸镁溶液、以及逆转录酶、重组酶、链置换dna聚合酶、ung酶和单链结合蛋白混合物；恒温扩增检测程序为：42℃5分钟；42℃20秒(收集荧光信号)，45个循环。
17、进一步地，对扩增曲线进行分析判断原则为：
18、当fam荧光通道有扩增曲线，hex荧光通道有或无扩增曲线时，判断样品为哈桑病毒核酸阳性；
19、当fam荧光通道无扩增曲线，且hex荧光通道有扩增曲线时，判断样品为哈桑病毒核酸阴性；
20、当fam荧光通道无扩增曲线，且hex通道也无扩增曲线时，判断本次实验异常，需重新提取标本rna和重新扩增检测。
21、本发明设计的引物、探针和反应系统灵敏度高，最低检测限能达到5拷贝/ml，准确性100％，特异性强，和其它80种病原体没有交叉扩增。这个试剂盒采用的是重组酶聚合酶恒温扩增技术，不需要大型pcr仪，且仅需要25分钟即可完成检测，比传统的荧光探针pcr节省近2小时时间，同时采用m13噬菌体探针作为内部阳性质控，能防止“假阴性”情况发生，加入了ung酶，能防止污染的发生。本试剂盒可用于实验室、野外和床旁检测，尤其适用于检疫口岸、机场和疫病爆发现场的哈桑病毒检测。
22、综上所述，本发明的优点及积极效果为：
23、1、本发明提供了供了哈桑病毒的双通道恒温检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，采用重组酶聚合酶扩增技术，能够在25分钟内完成核酸检测，比传统的荧光探针pcr检测方法节省近2小时时间，极大的缩短了检测时间。检测灵敏度高，最低检测限能达到5拷贝/ml，且优于传统的荧光探针pcr检测方法。同时采用了双通道检测技术，m13噬菌体探针作为内部阳性质控，能防止假阴性情况发生；加入了ung酶，能防止污染的发生。此外，检测准确性高、重复性好、精密度高。
24、2、本申请经过大量的创新性试验得出本申请的引物对、探针、试剂盒及检测方法，解决了用一对引物对和一对探针，一台小型恒温检测设备就检测出哈桑病毒，且极大的缩短了检测时间，同时保证其特异性强、灵敏度高、准确性高和重复性好，这也是本申请最大的技术难点。本发明采用单管双荧光通道同时检测哈桑病毒和m13噬菌体内部阳性质控品的存在，能检测全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、肺泡灌洗液和咽拭子等标本中哈桑病毒核酸的存在。当全血、血清、血浆、尿液、脑脊液、肺泡灌洗液和咽拭子等标本提取失败，以及这些标本中存在反转录酶或其它扩增酶的抑制剂时，容易出现“假阴性”结果，针对这个难点与技术问题，本发明设计了m13噬菌体内部阳性质控品，可对标本的提取和扩增全过程进行质量监控，能监控病毒核酸是否被成功提取，以及逆转录和恒温扩增是否顺利进行。恒温扩增产物容易形成气溶胶，造成下一次检测结果被污染，产生“假阳性”报告，针对这个难点与技术问题，本发明加入了ung酶和dutp，能在新的扩增反应前通过42℃加热将可能存在以前的核酸扩增产物降解消除掉，从而极大的杜绝了污染的可能性。本发明采用了高效逆转录酶，能在5分钟完成逆转录，同时采用了基于重组酶聚合酶扩增技术的重组酶、链置换dna聚合酶和单链结合蛋白，能在15分钟内完成核酸恒温扩增，从而保证能在25分钟内完成检测，比一般逆转录荧光探针pcr检测方法缩短了2小时检测时间，满足了快速和准确检测诊断的需求。
25、3、本发明提供了哈桑病毒的双通道恒温检测引物对、探针、试剂盒及检测方法，不仅极大的缩短了检测时间，且灵敏度高、特异性强、重复性好和能防污染，不需要大型设备，特别适用于野外、床旁和疫情发生地等现场检测。
1.一种哈桑病毒的双通道恒温检测引物对与探针，其特征在于：包括哈桑病毒特异性引物对和探针、m13噬菌体内部阳性质控特异性探针：
2.一种哈桑病毒的双通道恒温检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的哈桑病毒的双通道恒温检测引物对与探针。
3.根据权利要求2所述的哈桑病毒的双通道快速恒温检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：
4.一种如权利要求1所述哈桑病毒的双通道恒温检测引物对与探针在制备用于检测哈桑病毒的试剂盒中的应用。
5.一种权利要求2-3任一所述的哈桑病毒的双通道恒温检测试剂盒的使用方法，其特征在于：所述方法包括利用权利要求1所述的哈桑病毒的双通道恒温检测引物对与探针进行双通道实时恒温荧光扩增。
6.根据权利要求求5所述的使用方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的哈桑病毒的双通道恒温检测方法，其特征在于：
8.根据权利要求6或7所述的哈桑病毒的双通道恒温检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中具体判断规则为：
