本发明属于生物，具体涉及一种cpf1突变体及其用途、包含该cpf1突变体的生物材料、包含cpf1突变体的crispr/cas系统，以及一种体外检测样品中的靶核酸的方法。
背景技术：
1、crispr/cas技术是近年来研发出用于病原体检测的新一代分子诊断技术。crispr/cas技术中，其中一种核酸内切酶是具有侧支切割活性的cas12核酸内切酶。cas12酶有三个分支，分别包括cas12a、cas12c、cas12d、cas12e、cas12b、cas12h、cas12i和cas12g。在这些亚型中，cas12a和cas12b最常用于crispr/cas技术的检测中，其中优选cas12a(又称，cpf1)，因为cas12b需要111个核苷酸的长grna，而cas12a酶仅需要41个核苷酸的短crrna。
2、crispr/cas反应的cas酶在37度左右，当crispr/cas与其他检测手段联用时，由于其他检测手段中所用的酶的反应温度与cas酶不同，可能会存在需要两个不同的温度的问题，这给产品开发和实用性带来很大的不便。
3、此外，cas12a蛋白需要识别grna就能有效切割单链dna和双链dna。cas12a蛋白的ruvc和核酸酶叶(nuc)结构域具有裂解活性。与cas9相同，cas12a在pam(5’-tttv-3’，v为a/c/g)序列旁边存在一个潜在靶点，一旦与cas12a相遇，就可以启动r-loop，在grna和目标dna链之间形成碱基对杂交，匹配目标序列的1～17个碱基对，形成r-loop。一旦r-loop形成，cas12a蛋白利用其活性ruvc结构域，在pam序列的帮助下切割非目标链。cas12a蛋白的切割功能被激活后，会切割周围的非特异性单链dna，这种现象被称之为反式切割。而受pam位点的影响，对模板dna的序列必要满足符合pam的要求，限制了cas12a蛋白的用途，
4、因此，亟需开发一种具有更广的pam识别和耐高温活性的cas12a酶，以解决crispr/cas技术存在的局限性和对模板的依赖性。
技术实现思路
1、本发明提供的cpf1突变体具有增强的耐高温活性，可以解决crispr/cas技术中酶适反应温度的局限性所带来的不便和污染风险。
2、具体地，第一方面，本发明提供了一种cpf1突变体，其相对于seq id no:10所示的cpf1，包含在第38位、第39位、第163位、第171位、第312位、第542位、第549位、第786位中的至少一个位置进行氨基酸替换。
3、本发明提供的cpf1突变体与seq id no:10所示的野生型cpf1相比，具有增强的耐高温活性，优选地具有增强的耐高温活性和/或更广的原间隔相邻基序(pam)特异性；其中，更广的pam特异性解决了野生型cpf1的pam识别5'-tttn-3'给模板选择带来的局限性问题。
4、在一些优选实施方案中，所述cpf1突变体的反应温度为37℃-62℃。例如37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃或其范围内的任意值。
5、在一些优选实施方案中，所述cpf1突变体能够识别含有以下pam位点中的至少一个：5'-tttn-3'、5'-cttn-3'、5'-gttn-3'、5'-attn-3'、5'-tatn-3'、5'-tctn-3'、5'-tgtn-3'、5'-ttan-3'、5'-ttcn-3'、5'-ttgn-3'、5'-cccn-3'、5'-tccn-3'。
6、本发明提供的cpf1突变体的野生型蛋白(cpf1)来源于acidaminococcussp.bv3l6，该菌株的ncbi生物分类数据库(taxonomy)id为id1111120。
7、在一些实施方案中，所述cpf1突变体的氨基酸序列与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少80％且小于100％序列同一性。
8、在一些优选实施方案中，所述cpf1突变体的氨基酸序列与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少90％且小于100％序列同一性。
9、在一些优选实施方案中，所述cpf1突变体的氨基酸序列与seq id no:10所示的氨基酸序列具有至少95％且小于100％序列同一性。
10、在一些优选实施方案中，所述cpf1突变体相对于seq id no:10所示的cpf1，包含在第38位、第39位、第163位、第171位、第312位、第542位、第549位、第786位中的至少一个位置进行氨基酸替换，并且所述氨基酸替换包括：
11、第38位的谷氨酸替换为精氨酸(即，e38r)；
12、第39位的谷氨酸替换为精氨酸(即，e39r)；
13、第163位的天冬氨酸替换为精氨酸(即，d136r)；
14、第171位的甘氨酸替换为精氨酸(即，g171r)；
15、第312位的天冬氨酸替换为赖氨酸(即，d312k)；
16、第542位的丝氨酸替换为精氨酸(即，s542r)；
17、第549位的谷氨酸替换为精氨酸(即，e549r)；和/或
18、第786位的谷氨酸替换为精氨酸(即，e786r)。
19、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第163位的天冬氨酸替换为精氨酸，并且任选地包含以下氨基酸替换中的任意一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种：第38位的谷氨酸替换为精氨酸、第39位的谷氨酸替换为精氨酸、第171位的甘氨酸替换为精氨酸、第312位的天冬氨酸替换为赖氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸和/或第786位的谷氨酸替换为精氨酸。
20、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第171位的甘氨酸替换为精氨酸，并且任选地包含以下氨基酸替换中的任意一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种：第38位的谷氨酸替换为精氨酸、第39位的谷氨酸替换为精氨酸、第163位的天冬氨酸替换为精氨酸、第312位的天冬氨酸替换为赖氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸、第786位的谷氨酸替换为精氨酸。
21、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体包含以下氨基酸替换中的任意一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种：第38位的谷氨酸替换为精氨酸、第39位的谷氨酸替换为精氨酸、第163位的天冬氨酸替换为精氨酸、第171位的甘氨酸替换为精氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸、第786位的谷氨酸替换为精氨酸。
22、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第38位的谷氨酸替换为精氨酸、第39位的谷氨酸替换为精氨酸。
23、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第163位的天冬氨酸替换为精氨酸。
24、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第786位的谷氨酸替换为精氨酸。
25、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第163位的天冬氨酸替换为精氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸。
26、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第171位的甘氨酸替换为精氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸。
27、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第38位的谷氨酸替换为精氨酸、第39位的谷氨酸替换为精氨酸、第171位的甘氨酸替换为精氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸。
28、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第163位的天冬氨酸替换为精氨酸、第171位的甘氨酸替换为精氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸。
29、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第171位的甘氨酸替换为精氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸、第786位的谷氨酸替换为精氨酸。
30、在一些优选实施方案中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第38位的谷氨酸替换为精氨酸、第39位的谷氨酸替换为精氨酸、第163位的天冬氨酸替换为精氨酸、第171位的甘氨酸替换为精氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸。
31、在一些优选实施方案中，所述cpf1突变体的氨基酸序列包含或由如seq id no:1-9所示的序列组成。
32、在一些优选实施方案中，所述cpf1突变体的编码核酸序列包含或由如seq id no:11-19所示的序列组成。
33、第二方面，本发明提供了一种生物材料，其包括以下(i)至(iii)中的至少一种：
34、(i)核酸分子，其编码本发明提供的所述cpf1突变体；
35、(ii)表达载体，其包含(i)所述的核酸分子；
36、(iii)宿主细胞，其经(ii)所述的表达载体转化而成。
37、在一些优选实施方案中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。
38、第三方面，本发明提供了一种cas效应蛋白，其包含本发明提供的所述cpf1突变体。在本文中，“效应蛋白”是指具有活性如位点特异性结合活性、单链dna切割活性、双链dna切割活性、单链rna切割活性或转录调节活性的蛋白。
39、第四方面，本发明提供了一种crispr/cas系统，其包含：
40、(i)cas效应蛋白，所述cas效应蛋白包含本发明提供的所述cpf1突变体；以及
41、(ii)包含与靶序列互补的序列的向导rna；
42、其中，所述cas效应蛋白与所述向导rna能够形成crispr复合物，所述crispr复合物特异性结合包含所述靶序列的靶核酸。
43、在本文中，“向导rna”为grna，又称sgrna，是指能够与cas效应蛋白和靶核酸(例如，双链dna)形成复合物的rna。向导rna可以包含单个rna分子或通过两个或多个rna分子，其通过在两个或更多个rna分子中的互补区域杂交而彼此结合。当与双rna引导的cas核酸酶如cas9结合使用时，向导rna包含crrna和tracrrna。当与单个rna引导的cas核酸酶如cas12a结合使用时，向导rna不包含tracrrna或另外的反式激活rna。
44、在一些实施方案中，所述向导rna的序列包含或由如seq id no:23所示的序列组成。
45、第五方面，本发明提供了所述cpf1突变体在以下(1)或(2)中的用途：
46、(1)作为crispr/cas系统中的核酸内切酶的用途；
47、(2)制备体外检测样品中的靶核酸的制剂中的用途。
48、在一些优选实施方案中，所述靶核酸为ssdna、dsdna或rna。
49、第六方面，本发明提供了所述crispr/cas系统在体外检测样品中的靶核酸中的用途。
50、在一些优选实施方案中，所述靶核酸为ssdna、dsdna或rna。
51、第七方面，本发明提供了一种体外检测样品中的靶核酸的方法，其包括：
52、提供本发明所述的crispr/cas系统、样品和加标签的检测核酸；其中，所述加标签的检测核酸为单链且不与crispr/cas系统中的向导rna杂交；
53、使所述样品与所述crispr/cas系统和所述加标签的检测核酸接触；
54、测量通过所述cas效应蛋白切割所述加标签的检测核酸而产生的可检测信号，从而检测所述样品中的所述靶核酸。
55、在一些优选实施方案中，所述加标签的检测核酸包含猝灭剂/荧光体对或fret对。
56、在一些优选实施方案中，所述靶核酸为ssdna、dsdna或rna。
57、在一些优选实施方案中，所述可检测信号包括检测金纳米颗粒、荧光团、荧光偏振、胶体金、电化学信号和基于半导体的信号中的一种或多种。
58、第八方面，本发明还提供了一种试剂盒，其包含一个或多个aav载体，其编码本发明所述的crispr/cas系统。
59、本发明提供的cpf1突变体与野生型cpf1相比，具有增强的耐高温活性，使得在利用crispr/cas技术进行靶核酸的检测时可以在更宽的温度下进行反应，提升了产品开发和检测技术的实用性以及准确性。此外，本发明提供的cpf1突变体与野生型cpf1相比，还可进一步具有更广的pam特异性，从而解决了野生型cpf1的pam识别5'-tttn-3'给模板选择带来的局限性问题。
1.一种cpf1突变体，其相对于seq id no:10所示的cpf1，包含在第38位、第39位、第163位、第171位、第312位、第542位、第549位、第786位中的至少一个位置进行氨基酸替换。
2.根据权利要求1所述的cpf1突变体，其中，所述cpf1突变体的氨基酸序列与seq idno:10所示的氨基酸序列具有至少80％且小于100％、至少90％且小于100％、或者至少95％且小于100％的序列同一性。
3.根据权利要求2所述的cpf1突变体，其中，所述氨基酸替换包括：
4.根据权利要求1-3任一项所述的cpf1突变体，其中，相对于seq id no:10所示的cpf1，所述cpf1突变体在第163位的天冬氨酸替换为精氨酸，并且任选地包含以下氨基酸替换中的任意一种、两种、三种、四种、五种、六种或七种：第38位的谷氨酸替换为精氨酸、第39位的谷氨酸替换为精氨酸、第171位的甘氨酸替换为精氨酸、第312位的天冬氨酸替换为赖氨酸、第542位的丝氨酸替换为精氨酸、第549位的谷氨酸替换为精氨酸、第786位的谷氨酸替换为精氨酸；
5.根据权利要求1-3任一项所述的cpf1突变体，其中，所述cpf1突变体的氨基酸序列包含或由如seq id no:1-9所示的序列组成；和/或
6.一种生物材料，其包括以下(i)至(iii)中的至少一种：
7.一种crispr/cas系统，其包含：
8.权利要求1-5任一项所述cpf1突变体在以下(1)或(2)中的用途：
9.一种体外检测样品中的靶核酸的方法，其包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述加标签的检测核酸包含猝灭剂/荧光体对或fret对；和/或
