本发明属于基因工程。更具体地，本发明涉及一种从葡萄糖全合成香兰素的重组拟无枝酸菌，还涉及所述拟无枝酸菌的构建方法，及其在生产香兰素中的应用。
背景技术：
1、香兰素(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)又称香草醛，在食品、药品、化妆品、农业等领域被广泛应用。目前市场上香兰素的供应有三种，包括从香荚兰豆中提取的天然香兰素、用化学合成法生产的香兰素、用微生物转化法生产的香兰素。其中，在微生物转化法生产香兰素技术中，丁香酚、异丁香酚、阿魏酸和葡萄糖是该法生产香兰素的主要底物。但是丁香酚、异丁香酚毒性大，阿魏酸价格高，而葡萄糖价格低廉，原料充足，且安全无毒，是生物合成香兰素的理想原料。
2、从葡萄糖全合成香兰素所用的菌株如酿酒酵母、大肠杆菌、谷氨酸棒状杆菌等。中国发明专利cn 116751730a公开了一种合成香兰素的重组大肠杆菌，通过敲除aroe和6个降解香兰素的基因，异源表达dsd、liomt和nicar基因，香兰素产量仅为63mg/l，其产量低，且香兰素对大肠杆菌毒性大，不利于其积累。中国发明专利cn 117004544b通过改造谷氨酸棒状杆菌底盘细胞，引入香兰素合成模块和甲基循坏再生模块，以原儿茶酸为中间体合成香兰素，产量为765.85mg/l，可见产量仍较低。
3、在本领域中，从葡萄糖全合成香兰素产量低是难以实现产业化生产的主要原因。
技术实现思路
1、本发明的目的是克服现有技术方案，通过基因改造提供一种从葡萄糖全合成香兰素的重组拟无枝酸菌。
2、本发明的思路是从拟无枝酸菌工程菌株出发，在敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh、香草酸脱甲基酶基因vanab和丙酮酸激酶基因pyk基因，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase后，通过筛选更优的o-甲基转移酶基因omt，以提高香兰素的产量并降低副产物浓度。
3、为此，本发明提供o-甲基转移酶基因omt在提高重组拟无枝酸菌发酵产香兰素中的应用，所述o-甲基转移酶基因omt来源于海胆(lytechinus pictus)、链藻(klebsormidium nitens)或分枝杆菌(mycobacterium lentiflavum)。
4、其中，所述重组拟无枝酸菌敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh和香草酸脱甲基酶基因vanab，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase。
5、优选地，所述o-甲基转移酶基因omt来源于分枝杆菌(mycobacteriumlentiflavum)，以获得最高的香兰素产量。
6、本发明还提供启动子sp44在提高重组拟无枝酸菌发酵产香兰素中的应用，启动子sp44的序列如核苷酸序列如seq id no:19所示。
7、具体地，所述重组拟无枝酸菌敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh和香草酸脱甲基酶基因vanab，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase并表达来源于海胆(lytechinus pictus)、链藻(klebsormidium nitens)或分枝杆菌(mycobacterium lentiflavum)的o-甲基转移酶基因omt。
8、本发明还提供过表达o-甲基转移酶基因omt在提高重组拟无枝酸菌发酵产香兰素中的应用，表达两个拷贝的来源于分枝杆菌(mycobacterium lentiflavum)的o-甲基转移酶基因omt。
9、其中，所述重组拟无枝酸菌敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh和香草酸脱甲基酶基因vanab，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase。
10、另一方面，本发明提供一种重组拟无枝酸菌，所述重组拟无枝酸菌是在拟无枝酸菌hm-141中敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh、香草酸脱甲基酶基因vanab和丙酮酸激酶基因pyk基因，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase并表达o-甲基转移酶基因omt得到的。
11、特别地，所述脱氢莽草酸脱水酶基因dsd来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seqid no:1所示；分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic来源于拉氏普罗威登斯菌(providenciarustigianii)，其核苷酸序列如seq id no:2所示；4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seq id no:3所示；3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seq id no:4所示；羧酸还原酶基因car来源于喜热梭孢壳，其核苷酸序列如seq id no:5所示；磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seq id no:6所示；o-甲基转移酶基因omt来源于分枝杆菌(mycobacterium lentiflavum)，其核苷酸序列如seq id no:16所示；磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seq id no:21所示。
12、为了进一步提高香兰素产量，重组拟无枝酸菌还表达磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa并敲除丙酮酸激酶基因pyk。
13、特别优选地，重组拟无枝酸菌表达2个拷贝的o-甲基转移酶基因omt基因。
14、根据另一种优选的实施方式，所述o-甲基转移酶基因omt是在启动子sp44的作用下启动的，启动子sp44核苷酸序列如seq id no:19所示。
15、本发明还提供上述重组拟无枝酸菌在以葡萄糖为底物发酵产香兰素的应用。
16、具体地，将所述重组拟无枝酸菌接种于50ml种子培养基m1中，在30c、200rpm条件下培养48h，将种子液按照质量比5％的接种量接种到含有50ml发酵培养基m1的250ml锥形瓶中，在37c、200rpm条件下发酵培养96h；
17、所述m1培养基配方为：葡萄糖30g/l，酵母浸粉10g/l，磷酸氢二钠4g/l，磷酸二氢钾1g/l，七水硫酸镁0.2g/l，其余为水，调节ph为7.2。
18、另一方面，本发明还提供上述重组拟无枝酸菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：
19、(1)敲除香兰素分解途径和副产物分解途径的基因vdh、pcagh和vanab
20、构建敲除质粒pkg1132-vdh-2500、pkg1132-pcagh-2500和pkg1132-vanab-2500。将pkg1132-vdh-2500转化到拟无枝酸菌hm-141中，通过单交换和双交换筛选验证得到van-1菌株。将pkg1132-pcagh-2500转化到van-1中，通过单交换和双交换筛选验证得到van-2菌株。将pkg1132-vanab-2500转化到van-2中，通过单交换和双交换筛选验证得到van-3菌株。
21、(2)整合dsd、ubic、poba和arof基因到拟无枝酸菌染色体
22、构建整合质粒pkg1132-258-dsd-prubic和pkg1132-vdh-poba-arof。将pkg1132-258-dsd-prubic转化到van-3中，通过单交换和双交换筛选验证得到van-4菌株。将pkg1132-vdh-poba-arof转化到van-4中，通过单交换和双交换筛选验证得到van-5菌株。
23、(3)整合car和pptase基因到拟无枝酸菌pcagh位点
24、构建整合质粒pkg1132-pcagh-ttcar-pptase。将pkg1132-pcagh-ttcar-pptase转化到van-5中，通过单交换和双交换筛选验证得到van-6菌株。
25、(4)整合2个拷贝的sp44-mlomt基因到拟无枝酸菌vanab位点
26、构建2个拷贝的sp44-mlomt基因整合到vanab位点的质粒pkg1132-vanab-mlomt×2。将pkg1132-vanab-mlomt×2质粒转化到van-6中，通过单交换和双交换筛选验证得到van-10菌株。
27、(5)构建整合ppsa基因的拟无枝酸菌van-11
28、将整合质粒pkg1132-pyk-ppsa转化到van-10中，通过单交换和双交换筛选验证得到高产香兰素的重组拟无枝酸菌。
29、本发明通过在拟无枝酸菌中敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh、香草酸脱甲基酶基因vanab和丙酮酸激酶基因pyk基因，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase、o-甲基转移酶基因omt和磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa，获得van-11菌株，van-11的香兰素产量为5.09g/l，是目前已报道的相关研究中生物法从葡萄糖全合成香兰素的最高产量，葡萄糖价格低廉，且香兰素产量较高，为工业生产生物合成香兰素提供技术支撑。
30、本发明通过筛选omt基因的来源，获得来源于分枝杆菌(mycobacteriumlentiflavum)的mlomt基因优先催化原儿茶酸或原儿茶醛的间位甲基化而不是对位甲基化，并且在拟无枝酸菌中表达时能获得最高的香兰素产量，并且没有副产物异香兰素的生成。
1.o-甲基转移酶基因omt在提高重组拟无枝酸菌发酵产香兰素中的应用，所述重组拟无枝酸菌敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh和香草酸脱甲基酶基因vanab，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase，所述o-甲基转移酶基因omt来源于海胆(lytechinus pictus)、链藻(klebsormidium nitens)或分枝杆菌(mycobacteriumlentiflavum)。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述o-甲基转移酶基因omt来源于分枝杆菌(mycobacterium lentiflavum)。
3.启动子sp44在提高重组拟无枝酸菌发酵产香兰素中的应用，所述重组拟无枝酸菌敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh和香草酸脱甲基酶基因vanab，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase并表达来源于海胆(lytechinus pictus)、链藻(klebsormidium nitens)或分枝杆菌(mycobacterium lentiflavum)的o-甲基转移酶基因omt；启动子sp44的序列如核苷酸序列如seq id no:19所示。
4.过表达o-甲基转移酶基因omt在提高重组拟无枝酸菌发酵产香兰素中的应用，所述重组拟无枝酸菌敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh和香草酸脱甲基酶基因vanab，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car、磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase并表达两个拷贝的来源于分枝杆菌(mycobacterium lentiflavum)的o-甲基转移酶基因omt。
5.一种重组拟无枝酸菌，所述重组拟无枝酸菌是在拟无枝酸菌hm-141中敲除香兰素脱氢酶基因vdh、原儿茶酸3,4双加氧酶基因pcagh和香草酸脱甲基酶基因vanab，表达脱氢莽草酸脱水酶基因dsd、分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic、4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba、3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof、羧酸还原酶基因car和磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase并表达o-甲基转移酶基因omt得到的。
6.根据权利要求所述的重组拟无枝酸菌，其特征在于所述脱氢莽草酸脱水酶基因dsd来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seq id no:1所示；分支酸丙酮酸裂合酶基因ubic来源于拉氏普罗威登斯菌(providencia rustigianii)，其核苷酸序列如seq id no:2所示；4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶基因poba来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seq id no:3所示；3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸(dahp)合成酶基因arof来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seq id no:4所示；羧酸还原酶基因car来源于喜热梭孢壳，其核苷酸序列如seq idno:5所示；磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因pptase来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seqid no:6所示；o-甲基转移酶基因omt来源于分枝杆菌(mycobacterium lentiflavum)，其核苷酸序列如seq id no:16所示。
7.根据权利要求5所述的重组拟无枝酸菌，其特征在于重组拟无枝酸菌还表达磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa并敲除丙酮酸激酶基因pyk，磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因ppsa来源于拟无枝酸菌，其核苷酸序列如seq id no:21所示。
8.根据权利要求5所述的重组拟无枝酸菌，其特征在于重组拟无枝酸菌表达2个拷贝的o-甲基转移酶基因omt基因。
9.根据权利要求5所述的重组拟无枝酸菌，其特征在于所述o-甲基转移酶基因omt是在启动子sp44的作用下启动的，启动子sp44核苷酸序列如seq id no:19所示。
10.权利要求5-9中任一项权利要求所述的重组拟无枝酸菌在以葡萄糖为底物发酵产香兰素的应用。
