本发明涉及生物，具体而言，涉及一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液。
背景技术：
1、牛体外胚胎生产即“试管牛”技术，是将卵子体外受精与受精卵移植技术结合的产物，这一技术与人“试管婴儿”技术有极大的相似处，即用“试管婴儿”技术同样可以培育出“试管牛”，但与人“试管婴儿”技术最大的不同在于：人“试管婴儿”技术中所用于生产胚胎的绝大部分为体内成熟卵，而“试管牛”技术中所用于生产胚胎的几乎全部是未成熟的卵母细胞，后者需要通过模拟体内卵母细胞的成熟环境，使未成熟卵恢复减数分裂，完成成熟并进一步具有受精和发育到囊胚阶段的潜能，但体外成熟的卵母细胞成熟水平和受精胚胎的发育能力都显著低于体内成熟的卵母细胞，这就导致“试管牛”技术的效率及胚胎移植成功率明显低于“试管婴儿”。
2、卵母细胞的成熟涉及细胞核成熟和细胞质成熟两个过程，这两个过程缺一不可，只有二者都成熟的卵母细胞才能获得较好的受精及胚胎发育潜能，影响卵母细胞体外成熟效率的因素很多，主要包括体外培养时间、活性氧、光照、温度、培养液组成等，其中活性氧的变化是影响卵母细胞及胚胎发育的重要因素，适量的活性氧可以诱导卵母细胞成熟及胚胎发育，但过量的活性氧会导致卵母细胞及胚胎的氧化损伤，降低其发育能力，甚至导致胚胎死亡。
3、谷胱甘肽是一种重要的巯基还原物质，能保护细胞免受氧化损伤，卵母细胞中还原型谷胱甘肽水平浓度越高，越有助于卵母细胞细胞核、细胞质发育的同步性，半胱氨酸是一种重要的抗氧化物质，能很好的保护卵母细胞免受氧化损伤从而提高卵母细胞成熟率，进一步提高其受精能力及受精后胚胎的发育能力，胱氨酸是谷胱甘肽的合成底物，已有研究表明，牛、猪、水牛、绵羊、山羊等在卵母细胞体外成熟过程中添加半胱氨酸能促进胚胎发育水平，但是成熟液中同时添加半胱氨酸、胱氨酸对牛卵母细胞体外成熟的效果如何尚不清楚，且在牛卵母细胞成熟液中添加半胱氨酸的实验几乎都是利用屠宰场卵巢，尚未有活体采卵卵母细胞体外成熟的实验结果。
4、多年来，研究人员一直尝试使用无血清培养液来进行卵母细胞的体外成熟，且体外成熟的卵母细胞也可以经过受精发育到囊胚，但目前绝大多数研究者仍使用含血清的培养液来对卵母细胞进行体外成熟，究其原因在于，血清替代品对卵母细胞的成熟效果不如血清，但血清成分过于复杂，不同批次产品间差异大，因此，含血清成分的成熟液的配制面临的最大难题是标准化程度，因此，开发一种效率高且易标准化配制的成熟液成为牛体外胚胎生产标准化需要首先解决难题。
5、敲除血清替代物ksr是一种成分确定的合成蛋白源、无血清制剂，由有机小分子、微量元素和胰岛素、转铁蛋白、富脂白蛋白组成，不含有任何未定义的生长因子或促分化因子，通常用于体外培养干细胞和诱导多能干细胞分化，已有研究表明，在猪卵母细胞体外成熟液中使用ksr替代血清，能提高卵母细胞成熟率，因此，在牛卵母细胞体外成熟液中使用ksr取代血清是可行的。
技术实现思路
1、为了弥补以上不足，本发明提供了一种克服上述技术问题或至少部分地解决上述问题的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，在牛体外胚胎生产过程中，使用本发明提供的牛卵母细胞体外成熟液对采集的卵母细胞进行体外成熟，能获得较高的成熟率；对成熟后的卵母细胞使用商业化体外受精液、胚胎培养液进行体外胚胎培养，能获得较高的囊胚率；使用本发明所提供的体外成熟液培养出的囊胚进行胚胎移植，能获得较高的冷冻胚胎移植受胎率。
2、本发明是这样实现的：
3、本发明提供一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，包括体外成熟液；所述体外成熟液组成为储液a、储液b和工作液。
4、在一个优选的方案中，所述体外成熟液不含血清，所述体外成熟液使用敲除血清替代物代替成分复杂、不易标准化的成分，所述体外成熟液含有抗氧化剂。
5、在一个优选的方案中，所述体外成熟储液a为包含30mm半胱氨酸的水溶液。
6、在一个优选的方案中，所述体外成熟储液b为包含40mm胱氨酸的水溶液。
7、在一个优选的方案中，所述体外成熟液工作液为含10％ksr(v/v)、0.2mm丙酮酸钠、0.05mg/ml庆大霉素、10μg/mlfsh、10μg/mllh、0.1mm半胱氨酸、0.2mm胱氨酸的tcm199溶液。
8、在一个优选的方案中，所述体外成熟液配制所用试剂纯度均为细胞培养级别以上，所述体外成熟液各储液配制完成后可在-20度的环境中长时间保存，工作液配制完成后可在2-8度的环境中保存30天。
9、在一个优选的方案中，所述体外成熟液可用于活体采卵及屠宰场卵巢来源的卵母细胞，所述体外成熟液用于对含有三层以上颗粒细胞、胞质均匀的卵母细胞进行体外成熟，所述体外成熟液使用前需提前进行平衡。
10、在一个优选的方案中，所述体外成熟液培养牛卵母细胞的培养环境为38.5度、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境中，培养时间20-24小时，所述体外成熟液对牛卵进行成熟，培养时间20-24小时。
11、在一个优选的方案中，所述利用体外成熟液对活体采卵及屠宰场卵巢卵母细胞进行成熟培养，均能获得较高的成熟率，所述利用体外成熟液对卵母细胞进行成熟培养，进而生产体外胚胎，均能获得较高的囊胚率。
12、在一个优选的方案中，所述利用体外成熟液对卵母细胞进行成熟培养，进而生产体外胚胎，能获得较高的鲜胚及冻胚的移植受胎率，所述利用体外成熟液对卵母细胞进行成熟培养，能提高所生产胚胎的耐冻性。
13、本发明提供的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其有益效果包括有：
14、1、一种能提高牛精子体外受精能力的体外受精液。利用活体采卵及屠宰场卵巢上获得的卵母细胞进行体外胚胎生产及移植，能获得较高的囊胚率及相似的移植受胎率。同时，本发明中体外受精液所提供的各试剂简单易得且价格低廉，在保证牛体外胚胎生产效率的同时降低了生产成本。
15、2、一种高效、标准化的牛卵母细胞体外成熟液。在牛体外胚胎生产过程中，使用本发明提供的牛卵母细胞体外成熟液对采集的卵母细胞进行体外成熟，能获得较高的成熟率；对成熟后的卵母细胞使用商业化体外受精液、胚胎培养液进行体外胚胎培养，能获得较高的囊胚率；使用本发明所提供的体外成熟液培养出的囊胚进行胚胎移植，能获得较高的冷冻胚胎移植受胎率。
1.一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，包括体外成熟液，其特征在于；
2.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述体外成熟液不含血清，所述体外成熟液使用敲除血清替代物代替成分复杂、不易标准化的成分，所述体外成熟液含有抗氧化剂。
3.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述体外成熟储液a为包含30mm半胱氨酸的水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述体外成熟储液b为包含40mm胱氨酸的水溶液。
5.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述体外成熟液工作液为含10％ksr(v/v)、0.2mm丙酮酸钠、0.05mg/ml庆大霉素、10μg/mlfsh、10μg/mllh、0.1mm半胱氨酸、0.2mm胱氨酸的tcm199溶液。
6.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述体外成熟液配制所用试剂纯度均为细胞培养级别以上，所述体外成熟液各储液配制完成后可在-20度的环境中长时间保存，工作液配制完成后可在2-8度的环境中保存30天。
7.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述体外成熟液可用于活体采卵及屠宰场卵巢来源的卵母细胞，所述体外成熟液用于对含有三层以上颗粒细胞、胞质均匀的卵母细胞进行体外成熟，所述体外成熟液使用前需提前进行平衡。
8.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述体外成熟液培养牛卵母细胞的培养环境为38.5度、5-7％二氧化碳的饱和湿度环境中，培养时间20-24小时，所述体外成熟液对牛卵进行成熟，培养时间20-24小时。
9.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述利用体外成熟液对活体采卵及屠宰场卵巢卵母细胞进行成熟培养，均能获得较高的成熟率，所述利用体外成熟液对卵母细胞进行成熟培养，进而生产体外胚胎，均能获得较高的囊胚率。
10.根据权利要求1所述的一种高效、标准化的无血清牛卵母细胞体外成熟液，其特征在于，所述利用体外成熟液对卵母细胞进行成熟培养，进而生产体外胚胎，能获得较高的鲜胚及冻胚的移植受胎率，所述利用体外成熟液对卵母细胞进行成熟培养，能提高所生产胚胎的耐冻性。
