本发明属于生物，具体涉及一种基因编辑牛的制备方法。
背景技术：
1、转基因动物生物反应器是指从转基因动物体液或血液中收获目标产物的生命系统，其原理是将编码活性蛋白的基因导入动物的细胞内，然后通过体细胞核移植的方式制备转基因动物，并使外源基因在动物体内(乳汁或血液等)进行高效表达，然后提取目的产物。利用转基因动物(家畜)生物反应器来生产药物，是一种全新的生产模式，与以往的制药技术相比，具有不可比拟的优越性。转基因动物的乳腺或血液中可以源源不断地提供目的基因的产物(药物蛋白质)，不但产量高，而且表达的产物经过生物体充分的修饰和加工，具有稳定的生物活性。作为生物反应器的转基因动物又可无限繁殖，故具有成本低、产量高和生物活性好的优点。
2、虽然动物生物反应器制药技术具有诸多优点，但其目前也存在一定的问题，其中动物源性产品中存在a-gal抗原的免疫源性风险是制约其大规模应用的阻碍之一。α-gal抗原，即α-半乳糖基抗原(α-1,3-galactosyle，α-gal)，本质上就是一组糖蛋白或糖脂类物质，其糖链末端含有galα1-3galβ1-4glcnac结构。从哺乳动物组织中分离出的很多糖脂，如鞘糖脂上都发现了α-gal抗原的存在。糖蛋白如甲状腺球蛋白、纤维蛋白、免疫球蛋白及层粘连蛋白的糖链末端也都含有α-gal抗原。在于猪、牛、马等哺乳动物体内广泛存在。人体、类人猿和旧世纪猴的半乳糖苷转移酶基因有2个碱基错位变异而不表达gal抗原，但人类血清中存在高滴度的抗α-gal抗体(占总血清球蛋白的1％～3％)，因此当人体接受含有gal抗原的异种器官移植或生物材料植入时会导致超急性或慢性的免疫排斥反应。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种不表达α-半乳糖基抗原的编码基因的低免疫原性的基因编辑牛的制备方法。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
2、为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种基因编辑牛的制备方法，包括如下步骤：敲除待编辑牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因，得到基因编辑牛；所述待编辑牛为含有所述α-1,3-半乳糖基转移酶基因的牛。
4、在某些实施方案中，所述α-1,3-半乳糖基转移酶为下述任一种蛋白质：
5、a1)氨基酸序列是seq id no.1的蛋白质；
6、a2)将a1)所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与其所示的蛋白质具有85％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
7、a3)在a1)或a2)所示的氨基酸的n端和/或c端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
8、上文中所述标签蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、hi s6标签蛋白(his-tag)、mbp(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、flag标签蛋白、sumo标签蛋白、ha标签蛋白、myc标签蛋白、egfp(增强型绿色荧光蛋白)、ecfp(增强型青色荧光蛋白)、eyfp(增强型黄绿色荧光蛋白)、mcherry(单体红色荧光蛋白)或avitag标签蛋白。
9、本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质α-1,3-半乳糖基转移酶的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质α-1,3-半乳糖基转移酶的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质α-1,3-半乳糖基转移酶且具有蛋白质α-1,3-半乳糖基转移酶功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
10、上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
11、本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
12、本文中，所述85％以上的同一性可为至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
13、在某些实施方案中，所述α-1,3-半乳糖基转移酶基因为编码α-1,3-半乳糖基转移酶的dna分子。
14、在某些实施方案中，所述编码α-1,3-半乳糖基转移酶的dna分子或所述编码基因的核苷酸序列为seq id no.2。
15、在某些实施方案中，所述敲除通过引导编辑系统(prime editor,pe)实现，所述引导编辑系统包括pegrna组合物，所述pegrna组合物由pegrna1和pegrna2这两个pegrna组成；所述pegrna1和所述pegrna2均包括single-guide rna(sgrna)、引物结合位点(primebinding site，pbs)和含有靶向位点编辑序列的反转录模板(rt templet with edit)；所述pegrna1(seq id no.3)的反转录模板中的靶向位点编辑序列的核苷酸序列为seq idno.3的第106到134位核苷酸，所述引物结合位点的核苷酸序列seq id no.3的第135到145位核苷酸，与seq id no.7的第450到460位核苷酸反向互补；所述pegrna2(seq id no.4)的反转录模板中的靶向位点编辑序列的核苷酸序列为seq id no.4的第106到124位核苷酸，所述引物结合位点的核苷酸序列为seq id no.4的第125到138位核苷酸，与seq id no.7的第481到494位核苷酸相同。
16、在本发明的一个实施例中，pegrna1是通过含有pegrna1的重组载体导入牛胎儿成纤维细胞，所述含有pegrna1的重组载体是将pegrna1替代pcrispr-sg6质粒的bbsi酶切识别位点之间的小片段(即pcrispr-sg6质粒的第1545-1799位核苷酸)且保持其他核苷酸序列不变得到的重组载体。
17、在本发明的一个实施例中，pegrna2是通过含有pegrna2的重组载体导入牛胎儿成纤维细胞，所述含有pegrna2的重组载体是将pegrna2替代pcrispr-sg6质粒的bbsi酶切识别位点之间的小片段(即pcrispr-sg6质粒的第1545-1799位核苷酸)且保持其他核苷酸序列不变得到的重组载体。
18、在某些实施方案中，所述引导编辑系统还包括nick sgrna组合物，所述nicksgrna组合物包括nick sgrna1和nick sgrna2，所述nick sgrna1的核苷酸序列为seq idno.5，所述nick sgrna2的核苷酸序列为seq id no.6。
19、在本发明的一个实施例中，nick sgrna1是通过含有nick sgrna1的重组载体导入牛胎儿成纤维细胞，所述含有nick sgrna1的重组载体是将nick sgrna1替代pcrispr-sg6质粒的bbsi酶切识别位点之间的小片段(即pcrispr-sg6质粒的第1545-1799位核苷酸)且保持其他核苷酸序列不变得到的重组载体。
20、在本发明的一个实施例中，nick sgrna2是通过含有nick sgrna2的重组载体导入牛胎儿成纤维细胞，所述含有nick sgrna2的重组载体是将nick sgrna2替代pcrispr-sg6质粒的bbsi酶切识别位点之间的小片段(即pcrispr-sg6质粒的第1545-1799位核苷酸)且保持其他很核苷酸序列不变得到的重组载体。
21、在某些实施方案中，所述敲除牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因包括将表达所述pegrna组合物的重组载体、表达所述nick sgrna组合物的重组载体和表达由ncas9(h840a)和逆转录酶(rt)形成的融合蛋白的重组载体导入牛的细胞。
22、在本发明的一个实施例中，所述表达所述pegrna组合物的重组载体为含有pegrna1的重组载体和含有pegrna2的重组载体。所述表达所述nick sgrna组合物的重组载体为含有nick sgrna1的重组载体和含有nick sgrna2的重组载体。
23、在本发明的一个实施例中，所述表达由ncas9(h840a)和逆转录酶(rt)形成的融合蛋白的重组载体为pcmv-pe2，所述pcmv-pe2的核苷酸序列的第715到4815位核苷酸编码ncas9(h840a)蛋白，其中第4915到6945位核苷酸编码逆转录酶(rt)。
24、在某些实施方案中，所述待编辑牛的细胞为牛胎儿成纤维细胞。
25、在本发明的一个实施例中，所述牛胎儿成纤维细胞为以牛胎儿组织培养的成纤维细胞系。
26、在本发明的一个实施例中，所述牛胎儿组织为牛的45日胎龄的牛胎儿组织。
27、所述牛胎儿通过如下方法得到：以荷斯坦奶牛母牛为母本，待其发情之时，以西门塔尔公牛冻精对其进行人工授精，待荷斯坦奶牛母牛怀孕至45日龄收集牛胎儿。
28、第二方面，本发还提供了一种重组牛细胞，所述重组牛细胞不含α-1,3-半乳糖基转移酶基因，所述重组牛细胞为敲除含有α-1,3-半乳糖基转移酶基因的牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因得到的重组牛细胞。
29、在某些实施方案中，所述含有α-1,3-半乳糖基转移酶基因的牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因得到的重组细胞通过如下步骤制备：敲除待编辑的牛细胞的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因，得到重组牛细胞。
30、在某些实施方案中，所述牛细胞可不包括牛的生殖细胞、受精卵和胚胎干细胞，如可为体细胞或细胞系。
31、在本发明的一个实施例中，所述敲除待编辑的牛细胞的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因得到重组牛细胞通过如下方法实现：向待编辑的牛细胞中共转染表达所述pegrna组合物的重组载体、表达所述nick sgrna组合物的重组载体和表达由ncas9(h840a)和逆转录酶(rt)形成的融合蛋白的重组载体，获得重组牛细胞。
32、在本发明的一个实施例中，所述表达所述pegrna组合物的重组载体包括前述含有pegrna1的重组载体和含有pegrna2的重组载体；所述表达所述nick sgrna组合物的重组载体包括前述含有nick sgrna1的重组载体和含有nick sgrna2的重组载体；所述表达由ncas9(h840a)和逆转录酶(rt)形成的融合蛋白的重组载体即为前述pcmv-pe2；所述待编辑的牛细胞为前述成纤维细胞系。
33、第三方面，本发明还提供了一种对牛胎儿成纤维细胞进行编辑的方法，所述方法包括如下步骤：将前述载体导入牛胎儿成纤维细胞中进行基因编辑。
34、前述方法中所述载体包括表达所述pegrna组合物的重组载体、表达所述nicksgrna组合物的重组载体和表达由ncas9(h840a)和逆转录酶(rt)形成的融合蛋白的重组载体。
35、第四方面，本发明提供了上述方法在下述任一项中的应用：
36、b1)制备不含有α-半乳糖基抗原的血液制品；
37、b2)培育可生产不含有α-半乳糖基抗原的血液制品的牛。
38、第五方面，本发明提供了成套载体，所述成套载体包括前述的表达所述pegrna组合物的重组载体、表达所述nick sgrna组合物的重组载体和表达由ncas9(h840a)和逆转录酶(rt)形成的融合蛋白的重组载体。
39、第六方面，上述成套载体在如下任一种中的应用：
40、b1)制备不含有α-半乳糖基抗原的血液制品；
41、b2)培育可生产不含有α-半乳糖基抗原的血液制品的牛。
42、第七方面，本发明提供了一种基因编辑牛，所述基因编辑牛通过包括如下步骤的方法得到：敲除待编辑牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因，得到基因编辑牛；所述待编辑牛为含有所述α-1,3-半乳糖基转移酶基因的牛。
43、在某些实施方案中，所述α-1,3-半乳糖基转移酶的氨基酸序列为seq id no.1。
44、在某些实施方案中，所述编码α-1,3-半乳糖基转移酶的dna分子或编码基因的核苷酸序列为seq id no.2。
45、在某些实施方案中，所述敲除通过向待编辑牛的细胞中引导编辑系统(primeedito r,pe)实现，所述引导编辑系统包括pegrna组合物，所述pegrna组合物由pegrn a1和pegrna2这两个pegrna组成；所述pegrna1和所述pegrna2均包括single-guide rna(sgrna)、引物结合位点(prime binding site，pbs)和含有靶向位点编辑序列的反转录模板(rt templet with edit)；所述pegrna1(seq id no.3)的反转录模板中的靶向位点编辑序列的核苷酸序列为seq id no.3的第106到134位核苷酸，所述引物结合位点的核苷酸序列seq id no.3的第135到145位核苷酸，与seq id no.7的第450到460位核苷酸反向互补；所述pegrna2(seq id no.4)的反转录模板中的靶向位点编辑序列的核苷酸序列为seq idno.4的第106到124位核苷酸，所述引物结合位点的核苷酸序列为seq id no.4的第125到138位核苷酸，与seq id no.7的第481到494位核苷酸相同。
46、在本发明的一个实施例中，pegrna1是通过含有pegrna1的重组载体导入牛胎儿成纤维细胞，pegrna2是通过含有pegrna2的重组载体导入牛胎儿成纤维细胞，nick sgrna1是通过含有nick sgrna1的重组载体导入牛胎儿成纤维细胞，nick sg rna2是通过含有nicksgrna2的重组载体导入牛胎儿成纤维细胞。
47、在本发明的一个实施例中，所述表达所述pegrna组合物的重组载体为含有pegrna1的重组载体和含有pegrna2的重组载体。所述表达所述nick sgrna组合物的重组载体为含有nick sgrna1的重组载体和含有nick sgrna2的重组载体。
48、在某些实施方案中，所述敲除牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因包括将表达所述pegrna组合物的重组载体、表达所述nick sgrna组合物的重组载体和表达由ncas9(h840a)和逆转录酶(rt)形成的融合蛋白的重组载体导入待编辑牛的细胞。
49、在某些实施方案中，所述待编辑牛的细胞为牛胎儿成纤维细胞。
50、在本发明的一个实施例中，所述牛胎儿成纤维细胞为以牛胎儿组织培养的成纤维细胞系。
51、在本发明的一个实施例中，所述牛胎儿组织为牛的45日胎龄的牛胎儿组织。
52、所述牛胎儿通过如下方法得到：以荷斯坦奶牛母牛为母本，待其发情之时，以西门塔尔公牛冻精对其进行人工授精，待荷斯坦奶牛母牛怀孕至45日龄收集牛胎儿。
53、本发明通过引入导入引导编辑系统(prime editor,pe)，实现了牛基因组上α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因的精准编辑，进行精确修饰敲除，以达到去除其α-ga l抗原的目的。通过本发明提供的制备方法获得的基因编辑牛，可以作为生物反应器制药的工具牛，通过转基因的方式在其基因组中整合人源抗体类药物蛋白基因，利用其乳腺系统或血液系统表达人源抗体类蛋白药物，其表达产物中将不存在a-gal抗原，因此具有更低的免疫原性。
1.一种基因编辑牛的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：敲除待编辑牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因，得到基因编辑牛；所述待编辑牛为含有所述α-1,3-半乳糖基转移酶基因的牛；
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述敲除通过引导编辑系统实现，所述引导编辑系统包括pegrna组合物，所述pegrna组合物由pegrna1和pegrna2这两个pegrna组成；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述引导编辑系统包括nick sgrna组合物，所述nick sgrna组合物包括nick sgrna1和nick sgrna2，所述nick sgrna1的核苷酸序列为seq id no.5，所述nick sgrna2的核苷酸序列为seq id no.6。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述敲除牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因包括将表达所述pegrna组合物的重组载体、表达所述nick sgrna组合物的重组载体和表达由ncas9(h840a)和逆转录酶形成的融合蛋白的重组载体导入牛的细胞。
5.重组牛细胞，其特征在于，所述重组牛细胞不含α-1,3-半乳糖基转移酶基因，所述重组牛细胞为敲除含有α-1,3-半乳糖基转移酶基因的牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因得到的重组牛细胞。
6.权利要求1-4任意一项所述的制备方法在下述任一项中的应用：
7.一种对牛胎儿成纤维细胞进行编辑的方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求2-4中任一项所述的载体导入牛胎儿成纤维细胞中进行基因编辑。
8.权利要求7所述的方法在下述任一项中的应用：
9.成套载体，其特征在于，所述成套载体包括权利要求4所述的载体。
10.基因编辑牛，其特征在于，所述基因编辑牛通过包括如下步骤的方法得到：敲除待编辑牛的基因组中α-1,3-半乳糖基转移酶基因的编码基因，得到基因编辑牛；所述待编辑牛为含有所述α-1,3-半乳糖基转移酶基因的牛。
