本发明涉及一种基于dna四面体的atp检测试纸条及其制备和检测方法，属于生物检测。
背景技术：
1、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，atp)又称为“能量通货”，是一种生物体内不可或缺的小分子物质。atp不仅为各项生命活动供能，还在调节细胞代谢、信号传导以及多种细胞过程中发挥重要作用。细胞中总是含有atp，因此检测atp水平是评估活菌含量的一种常用方法。此外，生物体内的atp水平异常与流感、癌症、帕金森病等多种疾病相关，可以作为疾病严重程度的监测指标。因此，atp检测对于食品质量控制、环境分析、病理研究等领域具有重要意义。过去的几十年中，已经开发了多种atp检测方法，例如：高效液相色谱法、质谱法、基于荧光素/荧光素酶的生物发光法、荧光法、电化学法。然而，这些检测方法往往需要严格控制实验条件，成本较高，且对操作的专业性要求高，基本无法在日常生活中大量推广。因此，开发一种适用于多种应用场景、可在复杂的实际环境中使用的简易atp检测法是十分有必要的。
2、侧向流动分析是一种基于液体毛细作用的分析方法。液体样品侧向流动的过程中，靶标与适配体相互作用使得液体中的纳米颗粒停留在试纸上某一区域，累积的纳米颗粒达到一定数量，就会产生颜色深浅可测的条带。这种方法具有操作方便、可视化、成本低、耗时短、不需要特殊检测仪器等优点。然而，由于宏观显色需要大量纳米颗粒的积累，而且颜色强度的读取存在系统误差，侧向流动分析的检测限通常较高，不适用于微量样品的检测和严格的定量检测。针对侧向流动分析的这些弊端，人们已经开发了多种信号放大策略来提高侧向流动分析的信号强度，包括使用具有优良性质的金属纳米颗粒、与其他方法集成等。但这些方法常需要较复杂的纳米颗粒处理过程、更高的试纸制备成本，不符合实际商业推广需求。
3、dna是遗传信息的载体，在生物体内大量存在，具有优异的生物相容性。基于明确的碱基互补配对作用，dna的纳米结构具有高度可编辑性、可预测性。dna容易进行纳米级的修饰和功能化，从而可被赋予许多独特的物理、化学、生物性质。因此，dna非常适合用于各种功能结构和材料的组装。1980年nedrianseeman引入第一个核酸纳米结构，开辟了dna纳米技术的研究领域。此后，dna纳米技术领域受到广泛关注，人们已经能够创建从一维、二维、三维的复杂dna组装体，并将dna纳米结构应用于药物递送、纳米光子学和电子学、能量收集和转移等方面。四面体dna纳米结构(tetrahedral dna nanostructures，tdn)是dna纳米结构中研究较多的一种，由turberfield等人首次提出。tdn具有一定刚性、空间位阻可控、表面微扰弱等特点，比大多数一维、二维dna结构更稳定。人们已设计了多种尺寸的dna四面体，在实际应用中可根据具体需求选择合适的四面体大小，以获得最佳实验效果。在生化传感方面，这种三维的四面体结构往往可以使dna探针对靶标的亲和力大大提升，这为开发各种基于核酸的超灵敏生物传感器提供了巨大希望。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于dna四面体的atp检测试纸条及其制备和检测方法。
2、本发明的技术方案如下：
3、一种用于检测atp的dna四面体组合物，所述dna四面体组合物包括第一dna四面体和第二dna四面体；所述第一dna四面体由dna单链s1、s2、s3和s4组成；所述第二dna四面体由dna单链s1、s2、s3和s5组成；
4、所述s1的序列如seq id no.1所示；
5、所述s2的序列如seq id no.2所示；
6、所述s3的序列如seq id no.3所示；
7、所述s4的序列如seq id no.4所示；
8、所述s5的序列如seq id no.5所示。
9、根据本发明优选的，所述dna单链s1、s2、s3和s4的摩尔比为1：1：1：1；所述dna单链s1、s2、s3和s5的摩尔比为1：1：1：1。
10、根据本发明优选的，所述dna单链s1、s2、s3序列的5’端修饰有biotin。
11、根据本发明优选的，所述第一dna四面体和第二dna四面体按照如下方法制备：
12、按照1：1：1：1的摩尔比将dna单链s1、s2、s3和s4加入至tae-mg2+缓冲液中，然后在95℃下加热5min后自然冷却至室温，得到第一dna四面体；
13、按照1：1：1：1的摩尔比将dna单链s1、s2、s3和s5加入至tae-mg2+缓冲液中，然后在95℃下加热5min后自然冷却至室温，得到第二dna四面体；
14、所述tae-mg2+缓冲液的组分为：40mm tris，1.5mm mg(ch3coo)2，0.01mm edta，ph＝8.0。
15、一种基于dna四面体的atp检测试纸条，包含上述用于检测atp的dna四面体组合物。
16、根据本发明优选的，所述试纸条包括底板，以及依次衔接贴合于底板的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸。
17、根据本发明优选的，所述结合垫上喷涂有探针修饰的aunps；
18、所述探针的序列为：5'-tgcggaggaaggttttttt-sh-3'。
19、进一步优选的，所述探针修饰的aunps按照如下方法制备：
20、(1)将45ml超纯水加热至沸腾，然后一边剧烈搅拌一边向超纯水中加入5ml 10mm氯金酸，2min后迅速加入5ml 38.8mm柠檬酸钠溶液，加热沸腾10min；停止加热，在缓慢搅拌下使溶液冷却至室温；用0.22μm滤膜过滤冷却的溶液，得到纳米金粒子；
21、(2)将探针与tcep以1:50的摩尔比混合，孵育2小时，得到探针储备液；取1ml步骤(1)所得纳米金粒子溶液，加入20μl的探针储备液，避光缓慢搅拌16h后，加入盐溶液，继续避光缓慢搅拌溶液24h，将溶液在14000rpm、4℃的条件下离心30min，洗涤2次后，得到探针修饰的aunps；
22、其中，所述盐溶液的成分为：55mm tris，2.2m nacl，ph＝8.0；所述盐缓冲液分10次加入，每次加入的时间间隔40min，使tris终浓度为5mm、nacl终浓度为0.2m。
23、根据本发明优选的，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和对照线；所述检测线上固定有第一dna四面体；所述对照线上固定有第二dna四面体；
24、所述第一dna四面体、第二dna四面体的3个顶点分别修饰有生物素和链霉亲和素。
25、上述基于dna四面体的atp检测试纸条的制备方法，包括步骤如下：
26、样品垫剪裁为1.5cm宽的条状，在玻纤溶液中浸泡5min后烘干；用tris-hcl缓冲液稀释探针修饰的aunps溶液，在溶液中加入10％蔗糖，使用喷金滑膜仪以50nm的喷金浓度、3μl/cm喷金速度将探针修饰的aunps喷涂在结合垫上，在37℃下烘干4h以上，剪裁为约7mm的条状；用pbs缓冲液溶解链霉亲和素粉末，得到2mg/ml的链霉亲和素溶液；将第一dna四面体、第二dna四面体分别与链霉亲和素溶液以1：2的物质的量比混合，孵育1h；
27、将硝酸纤维素膜粘贴在底板上，使用喷金滑膜仪以0.4μl/cm的条件将孵育过的第一dna四面体、第二dna四面体喷涂在硝酸纤维素膜的检测线和对照线上，在37℃下烘干4h以上；在底板上依次粘贴结合垫、样品垫、吸收垫，各部分之间重合约2mm，以保证层析的顺利进行；将组装好的试纸剪裁为2mm，得到基于dna四面体的atp检测试纸条。
28、利用上述试纸条检测atp的方法，包括步骤如下：
29、将待测样品滴加至上述试纸条的样品垫上，在15min内得到试纸显色结果；
30、当检测线和对照线均显色时，待测样品中含有atp；当检测线不显色，对照线显色时，待测样品中不含有atp。
31、上述基于dna四面体的atp检测试纸条在检测细菌的存在、灭菌效果，以及餐具清洁度中的应用。
32、本发明的检测原理和技术特点：
33、如图1所示，本发明设计了2个dna四面体结构，分别固定在试纸的检测线(t)和对照线(c)处。dna四面体的3个顶点分别标记生物素，构成四面体的底面。底面生物素可以和链霉亲和素结合，支撑dna四面体结构直立在硝酸纤维素膜上。在dna四面体的拐点处增加了几个未参与杂交的核苷酸，以保证dna四面体结构有一定弯曲灵活性。dna四面体的顶端延伸出一段序列，作为探针与atp或aunps上修饰的序列结合。同时将一段巯基标记单链atp适配体作为探针修饰在aunps表面，得到探针修饰的aunps，将探针修饰的aunps喷涂在结合垫上。c线处dna四面体延伸出的dna序列与aunps上的探针序列互补配对，无论是否存在atp都可通过dna杂交捕获aunps。aunps表面的探针序列和t线上dna四面体序列构成atp的分裂适体，当存在atp时，这两段序列和atp以“探针-atp-探针”的“三明治”型结构结合，将aunps捕获在t线，t线和c线均显色，试纸呈阳性。当样品中不存在atp，则无上述相互作用，aunps离开t线，t线不显色c线显色，试纸呈阴性。
34、本发明的有益效果如下：
35、1、本发明提供了用于检测atp的dna四面体组合物，包括由dna单链s1、s2、s3和s4组成的第一dna四面体，以及由dna单链s1、s2、s3和s5组成的第二dna四面体。该dna四面体组合物作为探针可以与atp或aunps上修饰的序列结合，当存在atp时，这两段序列和atp以“探针-atp-探针”的“三明治”型结构结合，将aunps捕获在t线，实现了可视化的atp检测，可以仅用一个试纸条检测待测样品中是否含有atp。
36、2、本发明提供的基于dna四面体的atp检测试纸条在gtp、ctp、utp、ttp的干扰下依然能准确检测出atp，更加灵敏、抗干扰能力更强，且仍保持可视化等优点，因此易于在细菌检测等多种应用场景推广使用。
1.一种用于检测atp的dna四面体组合物，其特征在于，所述dna四面体组合物包括第一dna四面体和第二dna四面体；所述第一dna四面体由dna单链s1、s2、s3和s4组成；所述第二dna四面体由dna单链s1、s2、s3和s5组成；
2.如权利要求1所述的用于检测atp的dna四面体组合物，其特征在于，所述dna单链s1、s2、s3和s4的摩尔比为1：1：1：1；所述dna单链s1、s2、s3和s5的摩尔比为1：1：1：1；
3.如权利要求1所述的用于检测atp的dna四面体组合物，其特征在于，所述第一dna四面体和第二dna四面体按照如下方法制备：
4.一种基于dna四面体的atp检测试纸条，其特征在于，包含权利要求1所述用于检测atp的dna四面体组合物。
5.如权利要求4所述的基于dna四面体的atp检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括底板，以及依次衔接贴合于底板的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；
6.如权利要求5所述的基于dna四面体的atp检测试纸条，其特征在于，所述探针修饰的aunps按照如下方法制备：
7.如权利要求4所述的基于dna四面体的atp检测试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和对照线；所述检测线上固定有第一dna四面体；所述对照线上固定有第二dna四面体；
8.权利要求4所述的基于dna四面体的atp检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：
9.一种利用权利要求4所述试纸条检测atp的方法，其特征在于，包括步骤如下：
10.权利要求4所述基于dna四面体的atp检测试纸条在检测细菌的存在、灭菌效果，以及餐具清洁度中的应用。
