本发明属于双氯芬酸检测，尤其涉及一种检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器及利用其检测双氯芬酸的方法。
背景技术：
1、双氯芬酸(diclofenac，简写dcf)是一种非甾体抗炎药(nsaid)，广泛用于治疗各种轻至中度疼痛、炎症和发热。自问世以来，因其良好的疗效和相对较低的副作用，双氯芬酸已成为全球使用最广泛的药物之一。然而，随着其广泛应用，双氯芬酸在某些环境中的残留问题逐渐显现，尤其是在水体和土壤中，其残留可能对生态系统和人类健康构成潜在风险。
2、双氯芬酸因其化学结构的稳定性，使得其在环境中的降解变得困难。传统的双氯芬酸检测方法，如高效液相色谱法(hplc)、气相色谱-质谱联用法(gc-ms)等，虽然灵敏度高、准确性好，但操作复杂、成本高、耗时长，难以适用于现场快速检测和大量样品的筛查。因此，开发一种简单、快速、成本低廉的双氯芬酸检测技术显得尤为重要。
3、近年来，基于抗体的免疫分析方法在药物残留检测中展现出巨大的潜力。其中，荧光免疫分析分析检测方法因其成本低、操作简便、响应快、稳定性高等优点，被广泛应用于靶标物质的测定。其中，荧光共振能量转移(fret， resonance energy transfer)作为一种非辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量转移到受体激发态，在荧光探针检测技术中被广泛应用。在荧光免疫分析方法中，金纳米簇(goldnanoclusters,auncs)是一种被广泛使用的新型超小粒径荧光纳米材料，一般由数十个原子组成，粒径约为0.2-3.0nm，常常被用于检测重金属、毒素残留、农药残留、抗生素残留等，在传感、成像与催化等领域都表现出广阔的应用前景。羟基氧化钴纳米片(coooh)作为一种二维过渡金属纳米材料，因其独特的物化性质而备受科研学者关注。它是一种新型的超薄纳米材料，其水平尺寸可以达到几百纳米或几微米，但厚度只有几纳米甚至更小。目前，尚没有将auncs与coooh结合以构建荧光免疫生物传感器用于检测双氯芬酸。
技术实现思路
1、针对上述技术问题，本发明提供一种检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器及利用其检测双氯芬酸的方法，本发明提高了检测灵敏度，实现了对双氯芬酸的快速、准确检测。
2、注意，这些目的的记载并不妨碍其他目的的存在。本发明的一个方式并不需要实现所有上述目的。可以从说明书、附图、权利要求书的记载中抽取上述目的以外的目的。
3、本发明所述金纳米簇(auncs)具有独特的光学性质、生物相容性好、高比表面积、强光致发光、低毒性、易于表面功能化特性。羟基氧化钴纳米片(coooh)具有六方晶系的结构，并因其超薄的结构而具有高达1000m2/g的比表面积，同时表面存在很多褶皱，这极大地提高了它与其他物质的接触面积和反应活性。相较于其他二维纳米材料，coooh纳米片的主要优势在于其制备过程的高效性和低成本。具体来说，它能够在温和条件下实现快速制备，无需借助昂贵或复杂的仪器设备。此外，coooh纳米片的生物相容性好，含有丰富的co-o键和co-oh键，这些键的存在使得它具有优异的电催化性能。coooh纳米材料具备宽广的吸收光谱，这一特性使其成为荧光淬灭剂的关键因素。
4、本发明是通过以下技术手段实现上述技术目的的。
5、一种利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，包括制备auncs-coooh荧光免疫生物传感器，所述制备auncs-coooh荧光免疫生物传感器包括以下步骤：
6、建立双氯芬酸的免疫识别体系：包括制备完全抗原和制备单克隆抗体，制备完全抗原是将双氯芬酸半抗原通过活化酯法偶联蛋白质分别制备免疫原和包被原；制备单克隆抗体是用免疫原免疫小鼠，通过ic-elisa法检测筛选，进行细胞融合，得到双氯芬酸单克隆抗体；
7、合成荧光体系相关材料：包括合成羟基氧化钴(coooh)纳米片，合成金纳米簇(auncs)，将羟基氧化钴(coooh)纳米片和金纳米簇(auncs)合成auncs-coooh；
8、建立荧光信号响应平台：得到检测碱性磷酸酶(alp)的标准曲线；
9、建立检测双氯芬酸荧光免疫生物传感器：使用ic-elisa方法，其中引入auncs-coooh发光底物和碱性磷酸酶(alp)、l-抗坏血酸-2-磷酸(aap)酶促反应物，在此基础上，将荧光信号响应平台结合双氯芬酸的免疫识别体系，建立检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器；
10、检测双氯芬酸：将检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸。
11、上述方案中，所述制备完全抗原是将所述双氯芬酸半抗原通过活化酯法偶联牛血清白蛋白制备免疫原，将半抗原通过活化酯法偶联鸡卵白蛋白制备包被原，具体为：
12、将双氯芬酸半抗原溶解于二甲基甲酰胺中，加入n-羟基琥珀酰亚胺nhs和1-乙基碳二亚胺盐酸盐edc，室温反应进行活化，得到已经活化的双氯芬酸半抗原；将牛血清白蛋白bsa和鸡卵清白蛋白ova分别溶解于碳酸盐缓冲液cbs中，将所述已经活化的双氯芬酸半抗原逐滴加到牛血清白蛋白bsa和鸡卵清白蛋白ova溶液中，室温反应，用磷酸盐缓冲pbs透析，分别得到免疫原和包被原。
13、上述方案中，在所述双氯芬酸半抗原的活化过程中，所述双氯芬酸半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺nhs和1-乙基碳二亚胺盐酸盐edc的用量摩尔比为1：(2～3)：(2～3)。
14、上述方案中，在所述免疫原和包被原的制备过程中，所述牛血清白蛋白bsa、鸡卵清白蛋白ova和双氯芬酸半抗原的用量摩尔比为(20～40)：(20～40)：1。
15、上述方案中，所述合成羟基氧化钴(coooh)纳米片具体为：将naoh与cocl2混匀，超声1min，再加入0.9mol/l的naclo，超声10min，随后离心洗涤，得到羟基氧化钴(coooh)纳米片。
16、上述方案中，所述合成金纳米簇(auncs)具体为：将10mm haucl4·4h2o和50mg/ml牛血清白蛋白混匀，在混合溶液中逐滴滴加1m naoh调ph，在37℃下搅拌12小时，透析，得到金纳米簇(auncs)。
17、上述方案中，所述合成auncs-coooh具体为：将羟基氧化钴(coooh)溶液和金纳米簇(auncs)溶液等体积混匀超声，离心，沉淀用超纯水溶解即得到auncs-coooh nfs复合物。
18、上述方案中，所述建立荧光信号响应平台包括：分析不同浓度的coooh对auncs-coooh荧光强度的影响，观察荧光光谱；分析抗坏血酸(aa)对auncs-coooh的还原效果，记录荧光光谱和紫外-可见吸收光谱；分析抗坏血酸(aa)与碱性磷酸酶(alp)对auncs-cooohnfs的影响，记录溶液的荧光光谱和紫外-可见吸收光谱；进行碱性磷酸酶的定量检测验证荧光信号响应平台的可行性，得到检测alp的标准曲线；falp/falp0＝1.42105+0.19591log[alp]，(r2＝0.9904)。
19、优选的，分析不同浓度的coooh对auncs-coooh荧光强度的影响，即coooh的淬灭效率：使用一系列不同浓度的coooh合成auncs-coooh，观察物质的荧光光谱。
20、优选的，分析抗坏血酸(aa)对auncs-coooh的荧光强度的影响：使用不同浓度的aa与auncs-coooh反应，观察紫外光谱和荧光光谱，通过观察auncs-coooh的荧光变化探究抗坏血酸对coooh的还原效果。
21、优选的，分析抗坏血酸(aa)与碱性磷酸酶(alp)对auncs-coooh nfs的影响:分别将不同浓度的aa和alp与auncs-coooh反应，观察紫外光谱和荧光光谱。
22、优选的，碱性磷酸酶的定量检测：往0.5mg/ml的aap的溶液中加入不同浓度的碱性磷酸酶，37℃下孵育30分钟，再加入auncs-coooh nfs溶液，37℃下孵育10min。观察紫外光谱和荧光光谱。
23、本发明羟基氧化钴淬灭金纳米簇自身的荧光，同时，利用碱性磷酸酶alp催化l-抗坏血酸-2-磷酸aap转化为强还原性的抗坏血酸aa，抗坏血酸aa进而将coooh nfs还原为co2+，从而恢复荧光，在此基础上，结合双氯芬酸的免疫识别体系，建立荧光免疫分析方法检测双氯芬酸，将荧光响应平台与双氯芬酸抗原抗体免疫识别体系相融合，通过引入竞争反应机制，实现对目标物质的有效识别。在此过程中，利用荧光信号的激发与淬灭过程，构建了一个直观且定量的检测方法用于检测双氯芬酸。
24、上述方案中，所述检测双氯芬酸具体为：
25、将双氯芬酸包被原稀释加入酶标板孔中，置于培养箱温育；
26、用pbst(磷酸缓冲液)洗板，甩干洗液后，加入封闭液，置于培养箱；
27、洗板，甩干洗液后，每孔加入双氯芬酸抗体和不同浓度的双氯芬酸标准品，孵育；
28、洗板，甩干洗液后，加入适宜浓度的alp标记的二抗，孵育；
29、将孔板中的每个孔的液体转移到一个全新的孔板中，在新板中每孔加入aap反应；
30、在新板中继续加入auncs-coooh nfs，反应，记录荧光信号，得到检测双氯芬酸的标准曲线方程，计算待测样品中双氯芬酸的浓度。
31、上述方案中，所述检测双氯芬酸的标准曲线方程为y＝260.95207-66.1465/(1+(x/0.05733)1.09027)，ic50值为0.05733ng/ml，线性范围0.00764～0.20445ng/ml。
32、一种检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器，根据所述利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法中制备得到的。
33、本发明的auncs具备出色的荧光发光稳定性，而coooh nfs能够通过荧光共振能量转移(fret)机制有效猝灭auncs的荧光。当coooh nfs被还原为co2+时，auncs的荧光得以恢复。此途径结合了荧光共振能量转移效应与aap还原aa的氧化还原反应，荧光共振能量转移效应负责荧光信号的转移和放大，而氧化反应则负责触发荧光信号的生成，这种组合不仅提高了荧光信号的强度和稳定性，还使得检测出方法更加灵活可控。本发明在检测灵敏度上有了显著提升，为双氯芬酸在食品和环境中的残留量检测提供了一种更为高效、准确的技术手段。
34、与现有技术相比，本发明的有益效果是：
35、1.本发明构建了一个检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器用于直观且定量的检测双氯芬酸，通过本发明合成的auncs-coooh nfs复合物，作为荧光信号稳定的荧光底物，基于本检测方法，双氯芬酸的标准曲线方程为y＝260.95207-66.1465/(1+(x/0.05733)1.09027)，ic50值为0.05733ng/ml，线性范围为0.00764～0.20445ng/ml，相较于常规的elisa方法，本发明在检测灵敏度上有了显著提升，为双氯芬酸在食品和环境中的残留量检测提供了一种更为高效、准确的技术手段。
36、2.通过对自来水和果蔬样品进行双氯芬酸的加标检测，在这些样品中，分别添加了0.01、1ng/ml、10ng/ml和100ng/ml的双氯芬酸标准溶液，以模拟不同浓度的污染情况，结果显示，无论是低浓度的自来水样品还是高浓度的果蔬样品，本发明检测方法均展现了良好的回收率，具体来说，实际样品中双氯芬酸的回收率在91.3-96.6％范围内，变异系数均小于10％，这些实验结果表明，本发明方法可以适用于各种复杂基质中的双氯芬酸检测。
37、3.本发明在常规ic-elisa方法的基础上进一步结合alp酶的高选择性和auncs-coooh nfs的良好荧光性能，开发了一种更为灵敏的双氯芬酸荧光免疫分析检测方法，该方法将常规酶联免疫吸附方法中的显色底物更换为荧光强度变化信号，从而实现了检测信号向高灵敏荧光信号的转变，有效降低了体系中的背景干扰，使得极低浓度的目标物检测成为可能。
38、注意，这些效果的记载不妨碍其他效果的存在。本发明的一个方式并不一定必须具有所有上述效果。可以从说明书、附图、权利要求书等的记载显而易见地看出并抽出上述以外的效果。
1.一种利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，其特征在于，包括制备检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器，所述制备检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，其特征在于，所述制备完全抗原是将所述双氯芬酸半抗原通过活化酯法偶联牛血清白蛋白制备免疫原，将半抗原通过活化酯法偶联鸡卵白蛋白制备包被原，具体为：
3.根据权利要求2所述的利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，其特征在于，在所述双氯芬酸半抗原的活化过程中，所述双氯芬酸半抗原、n-羟基琥珀酰亚胺nhs和1-乙基碳二亚胺盐酸盐edc的用量摩尔比为1：(2～3)：(2～3)；
4.根据权利要求1所述的利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，其特征在于，所述合成羟基氧化钴coooh纳米片具体为：将naoh与cocl2混匀，超声1min，再加入0.9mol/l的naclo，超声10min，随后离心洗涤，得到羟基氧化钴coooh纳米片。
5.根据权利要求1所述的利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，其特征在于，所述合成金纳米簇auncs具体为：将10mm haucl4·4h2o和50mg/ml牛血清白蛋白混匀，在混合溶液中逐滴滴加1m naoh调ph，在37℃下搅拌12小时，透析，得到金纳米簇auncs。
6.根据权利要求1所述的利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，其特征在于，所述合成auncs-coooh具体为：将羟基氧化钴coooh溶液和金纳米簇auncs溶液等体积混匀超声，离心，沉淀用超纯水溶解即得到auncs-coooh nfs复合物。
7.根据权利要求1所述的基于auncs-coooh荧光免疫生物传感器的双氯芬酸检测方法，其特征在于，所述建立荧光信号响应平台包括：分析不同浓度的coooh对auncs-coooh荧光强度的影响，观察荧光光谱；分析抗坏血酸aa对auncs-coooh的还原效果，记录荧光光谱和紫外光谱；分析抗坏血酸aa与碱性磷酸酶alp对auncs-coooh nfs的影响，记录溶液的荧光光谱和紫外光谱；进行碱性磷酸酶的定量检测验证荧光信号响应平台的可行性，得到检测alp的标准曲线；falp/falp0＝1.42105+0.19591log[alp]，(r2＝0.9904)。
8.根据权利要求1所述的利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，其特征在于，所述检测双氯芬酸具体为：
9.根据权利要求1所述的利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法，其特征在于，所述检测双氯芬酸的标准曲线方程为y＝260.95207-66.1465/(1+(x/0.05733)1.09027)，ic50值为0.05733ng/ml，线性范围0.00764～0.20445ng/ml。
10.一种检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器，其特征在于，根据权利要求1-9任意一项所述利用检测双氯芬酸的auncs-coooh荧光免疫生物传感器检测双氯芬酸的方法中制备得到的。
