本发明属于生物检测，尤其涉及一种基于万古霉素功能化磁珠结合氨基肽酶试纸检测革兰氏阴性菌的方法。
背景技术：
1、奶牛乳房炎 (bovine mastitis) 是影响乳制品行业的最常见和最普遍的疾病之一，微生物感染是导致奶牛乳房炎的主要原因。目前，抗生素是治疗奶牛乳房炎的首选方案，然而，在未确定致病菌的情况下，盲目使用抗生素治疗奶牛乳房炎，可能会导致治疗效果不佳，同时也会造成耐药性增加和药物残留问题的加剧。奶牛乳房炎病原菌检测方法如分离培养、elisa、lamp等，这些方法大都费时耗力，对操作人员和实验仪器有较高需求。因此，针对奶牛乳房炎的早期诊断，开发快速、可靠检测病原菌的方法，对于正确、快速选择治疗用抗生素具有重要意义。
2、近年来，利用抗体、杆菌肽、抗生素等生物识别元件，结合磁性微粒、光学传感器等材料作为检测手段已受到越来越多的关注。在抗生素来源的识别分子中，万古霉素属于糖肽类抗生素，可以与革兰氏阳性细菌细胞壁中的d-丙氨酰-d-丙氨酸 (d-alanyl-d-alanine，d-ala-d-ala) 二肽部分通过五个氢键强烈结合，从而抑制细菌细胞壁的生物合成发挥对革兰氏阳性菌的抗菌作用。而革兰氏阴性菌在肽聚糖层之上有一层外膜，万古霉素难以穿透这层外膜，因而限制了万古霉素与d-ala-d-ala的结合，致万古霉素对革兰氏阴性菌无效。
技术实现思路
1、本发明目的在于提供一种基于万古霉素功能化磁珠结合氨基肽酶试纸检测革兰氏阴性菌的方法，以解决上述背景技术中存在的技术问题。
2、为解决上述技术问题，本发明采取的具体技术方案如下：
3、本发明的第一方面提供一种基于万古霉素功能化磁珠结合氨基肽酶试纸检测革兰氏阴性菌的方法，所述方法包括：利用制备得到的van-mbs识别并分离待测样品中的革兰氏阳性菌，接着利用氨基肽酶试纸检测待测样品上清液中的革兰氏阴性菌。
4、根据本发明的实施例，利用制备得到的van-mbs识别并分离待测样品中的革兰氏阳性菌的流程包括：
5、取100 μl待测样品与100 μlvan-mbs加入到震荡培养箱中，在37℃、200rpm下孵育55min，然后在外磁场的作用下进行磁分离5min，以分离上清液和沉淀，最后丢弃沉淀，保留待测样品上清液备用。
6、根据本发明的实施例，利用氨基肽酶试纸检测待测样品上清液中的革兰氏阴性菌的流程包括：
7、吸取待测样品上清液与氨基肽酶试纸在37℃下孵育30min后观察试纸颜色，若试纸变黄，则待测样品中存在革兰氏阴性菌。
8、根据本发明的实施例，所述van-mbs的制备方法包括以下步骤：
9、（1）取粒径为300nm，浓度为10mg/ml的羧基化磁珠（mbs）进行磁富集，随后用pbs溶液磁分离洗涤3次后重悬于1ml pbs溶液中，接着加入0.32mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）、0.35mgn-羟基琥珀酰亚胺（nhs）以及3μl用来提高磁珠分散性的吐温-20，室温置于震荡混匀仪上1h，以活化mbs表面的羧基；将活化后的mbs进行磁分离洗涤3次后，重悬于1ml pbs溶液中。
10、（2）向步骤（1）的溶液中加入25mgbsa和4μl吐温-20，室温置于震荡混匀仪上反应2h，使bsa被偶联到羧基化磁珠（mbs）上；待反应结束后，对混合物进行磁分离洗涤3次，除去未结合的bsa，重悬于1ml pbs中。
11、（3）取万古霉素100mg溶于1ml pbs溶液中，并加入169.3mgedc、47.98mgnhs，在室温避光活化10min后得到活化后的van；向步骤（2）的溶液中加入活化后的van和4μl吐温-20后置于震荡混匀仪上，在室温避光的条件下进行偶联反应6h，偶联结束后磁分离洗涤3次，洗去未偶联的van，并重悬于1ml pbs溶液中，使万古霉素与bsa上的氨基结合得到万古霉素功能化磁珠（van-mbs），其浓度为1mg/ml，在4℃保存备用。
12、根据本发明的实施例，所述氨基肽酶试纸的制备方法包括以下步骤：
13、将浓度为10mg l-丙氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐溶于1 ml pbs溶液中，随后吸取100μl溶液滴于无菌滤纸上，晾干备用。
14、本发明的第二方面还提供一种利用万古霉素功能化磁珠结合氨基肽酶试纸检测革兰氏阴性菌的试剂盒或试纸，包括所述van-mbs和所述氨基肽酶试纸。
15、本发明的基于万古霉素功能化磁珠结合氨基肽酶试纸检测革兰氏阴性菌的方法具有以下优点：
16、本发明提供的基于万古霉素功能化磁珠结合氨基肽酶试纸检测革兰氏阴性菌的方法，首先利用该万古霉素功能化磁珠可以识别待测样品的革兰氏阳性菌，然后在外加磁场的作用下捕获革兰氏阳性菌，而将可能存在的革兰氏阴性菌留在上清液中，最后用氨基肽酶法检测上清液，若有革兰氏阴性菌存在，试纸就会变黄。该方法的建立适用于短期内对奶牛乳房炎病原菌进行早期临床可视化检测，方法简单便捷，成本低廉，对快速确定奶牛乳房炎主要病原菌类型，提供合理快速选择治疗用抗生素具有重要意义；此外，也为临床生乳样品中细菌的快速检测试纸条/试剂盒研发奠定基础。
1.一种基于万古霉素功能化磁珠结合氨基肽酶试纸检测革兰氏阴性菌的方法，其特征在于，所述方法包括：利用制备得到的van-mbs识别并分离待测样品中的革兰氏阳性菌，接着利用氨基肽酶试纸检测待测样品上清液中的革兰氏阴性菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用制备得到的van-mbs识别并分离待测样品中的革兰氏阳性菌的流程包括：
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待测样品与van-mbs为等体积添加到震荡培养箱中，所述孵育时间为55min，所述磁分离时间为5min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用氨基肽酶试纸检测待测样品上清液中的革兰氏阴性菌的流程包括：
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述van-mbs的制备方法包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羧基化磁珠的粒径为300nm，浓度为10mg/ml，所述制备的van-mbs，其表面万古霉素的量为197.20 µg/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氨基肽酶试纸的制备方法包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述l-丙氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐的浓度为10mg/ml，所述混合溶液的体积为100μl。
9.一种利用万古霉素功能化磁珠结合氨基肽酶试纸检测革兰氏阴性菌的试剂盒或试纸，其特征在于，包括权利要求5或6所述的方法制备得到的所述的van-mbs和权利要求7或8所述的方法制备得到的所述氨基肽酶试纸。
