本发明属于病原微生物检测，涉及一种基于聚集诱导发光组装体和crispr/cas12a的副溶血性弧菌检测方法。
背景技术：
1、食源性致病菌普遍存在于多样化的环境和食品之中，可引发如骨髓炎、心内膜炎、菌血症等多种感染性疾病，严重影响着食品安全以及人类健康。副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)作为一种嗜盐性的革兰氏阴性菌，广泛存在于各种海洋以及河口环境中，食用受其污染的海产品可能引起严重的胃肠道疾病，甚至危及生命。因此，开发一种快速且灵敏的检测技术，用于检测食品中的副溶血性弧菌，对于确保食品安全和保障人们健康至关重要。
2、常见的传统的副溶血性弧菌的检测方法有平板菌落技术法、聚合酶链式反应(pcr)、酶联免疫吸附试验(elisa)、荧光检测等。但是传统的菌落计数法所需检测时间长，通常需两天时间才能获得检测结果；pcr和荧光检测等需要昂贵的仪器设备以及专业的操作人员，限制了其在实际中的广泛应用，因此，开发快速灵敏的副溶血性弧菌的检测方法具有重要意义。
3、簇状规则间隔短回文重复序列(crispr)系统作为一种新型基因编辑技术，由于其高度特异性的目标识别特性，在生物传感方面得到广泛应用。crispr/cas12a系统作为crispr中应用最为广泛的系统之一，cas12a蛋白在crrna的引导下识别富含t的原型间隔区相邻(pam)序列后，可以快速顺式切割目标双链dna，并可以通过反式切割活性高效无差别的切割单链dna,使得基于该系统的检测策略具有高灵敏、高特异性的优点。
4、目前已开发的基于crispr/cas12a的检测策略中，荧光技术因具有稳定性好、响应速度快等优点，被认为是经典的信号输出方法。然而，目前许多crispr/cas12a荧光生物传感器主要依赖于单一的荧光信号变化，如荧光增强或猝灭，来指示目标的存在。这种依赖单一信号的策略可能会因为外部环境或检测设备的不同条件而受到影响，对检测结果的准确性造成一定的干扰。比率型荧光生物传感器可以通过两个荧光信号实现自我校准，以消除来自不均匀激发和发射、背景光散射和光漂白等外界因素干扰，以实现更准确的检测结果，被广泛的应用于生物传感领域。
5、聚集诱导发光(aie)材料因其独特的光学性质，在生物传感领域显示出巨大的潜力。与传统的有机发光材料不同，aie材料在聚集时不会发生荧光淬灭(acq)，反而能够通过分子内部的自我调整机制增强荧光信号。这一特性使得aie材料在生物传感领域得到了广泛应用。aie材料的结构稳定性为它们与分子染料的结合提供了可能。在聚集状态下，aie材料可以通过荧光共振能量转移(fret)机制激发与之结合的染料分子，产生荧光信号。通过将aie材料与分子染料结合，可以开发出能够对特定靶标产生双色比率荧光输出信号的生物传感器。这种双色比率信号可以同时反映多个参数的变化，从而减少单一荧光信号可能受到的干扰，提供更精确的检测结果。
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种基于聚集诱导发光组装体和crispr/cas12a的副溶血性弧菌检测方法。具体是聚集诱导发光组装体为发光材料，以cy3.5-ssdna作为荧光探针，以副溶血性弧菌的特异性基因片段不耐热溶血素tlh作为靶标序列，构建了一种双色比率荧光生物传感器，可用于食品中副溶血性弧菌的检测，具有低背景、高灵敏度、强特异性等优点。
2、为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
3、本发明第一方面提供一种用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，包括cas12a蛋白、crrna、单链荧光探针、聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液、缓冲溶液和无酶水。
4、根据本发明优选的，所述cas12a蛋白识别的靶标为副溶血性弧菌的特异性基因片段不耐热溶血素tlh。
5、进一步优选的，所述副溶血性弧菌的特异性基因片段不耐热溶血素tlh的核苷酸序列为：
6、5’-agcaacgacgcagcaatgcagccagatcaaat-3’，
7、5’-atttgatctggctgcattgctgcgtcgttgct-3’。
8、根据本发明优选的，所述crrna的核苷酸序列为：
9、5’-uaauuucuacuaaguguagauaucuggcugcauugcugcgu-3’。
10、根据本发明优选的，所述单链荧光探针为cy3.5-ssdna荧光探针，是在ssdna的3’端修饰cy3.5荧光基团，核苷酸序列如下：
11、5’-gacgtaaacggccacaagttc-cy3.5-3’。
12、根据本发明优选的，所述聚集诱导发光材料为4,7-双[4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基]苯并-2,1,3,-噻二唑(btpetd)，其结构如式(ⅰ)所示：
13、
14、所述两亲性聚合物为聚苯乙烯-马来酸酐共聚物(psma)，其结构如式(ⅱ)所示：
15、
16、进一步优选的，所述聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液按照如下方法制备：
17、将btpetd与psma分别溶解于四氢呋喃(thf)中，得到浓度为1mg/ml的btpetd溶液和浓度为2mg/ml的psma溶液；然后将btpetd溶液和psma溶液依次加入至dmso溶液中，得到聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液；
18、所述聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液中btpetd的终浓度为16μg/ml，psma终浓度为8μg/ml。
19、本发明试剂盒中的btpetd的发射光谱与cy3.5荧光基团的激发光谱有效重叠，当两者距离足够近时可产生fret效应。
20、根据本发明优选的，所述缓冲溶液的组成为：40mm hepes，100mm nacl，20mmmgcl2，ph＝7.4。
21、一种利用上述试剂盒检测副溶血性弧菌的方法，包括步骤如下：
22、(1)提取待测样本的基因组；
23、(2)向待测样本的基因组中加入无酶水、缓冲溶液、cas12a蛋白、crrna和单链荧光探针构建检测体系，将检测体系混合均匀后在37℃下孵育45～75min；
24、(3)向孵育后的检测体系中加入聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液和缓冲溶液，在25℃下孵育8～12min后，利用荧光光谱仪记录在425nm的激发波长下分别记录530nm处btpetd的荧光信号和610nm处cy3.5荧光基团的荧光信号，并计算fcy3.5/fbtpetd的值，当fcy3.5/fbtpetd的值大于0.6时，认为待测样品中有副溶血性弧菌的存在。
25、根据本发明优选的，步骤(1)中，采用常规现有方法提取待测样本的基因组。
26、根据本发明优选的，步骤(2)中，所述检测体系中cas12a的蛋白终浓度为35～45nm，crrna的终浓度为45～50nm，单链荧光探针的终浓度为750～850nm，总体积为45～55μl。
27、进一步优选的，步骤(2)中，所述检测体系中cas12a的蛋白终浓度为40nm，crrna的终浓度为48nm，单链荧光探针的终浓度为800nm，总体积为50μl。
28、根据本发明优选的，步骤(3)中，加入聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液和缓冲溶液后，btpetd的终浓度为0.15～0.25μg/ml，psma的终浓度为0.05～0.15μg/ml，总体积为180～220μl。
29、进一步优选的，加入聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液和缓冲溶液后，btpetd的终浓度为0.2μg/ml，psma的终浓度为0.1μg/ml，总体积为200μl。
30、本发明的检测原理：
31、如图1所示，若待测样本中含有副溶血性弧菌时，cas12a/crrna能够特异性识别副溶血性弧菌中的tlh序列，激活cas12a的反式剪切活性，对cy3.5-ssdna荧光探针进行剪切；因此在检测体系中加入btpetd/psma储备液后，btpetd、psma以及剪切后的cy3.5标记的荧光探针在疏水作用下共组装到一起形成聚集诱导发光组装体，cy3.5荧光团与btpetd之间产生fret，在btpetd的激发波长下产生cy3.5的荧光信号。若待测样本中不含有副溶血性弧菌时，不能激活cas12a的反式切割活性，cy3.5-ssdna荧光探针保持完整，在静电斥力的作用下不能与btpetd产生fret，在btpetd的激发波长下产生btpetd自身的荧光信号。
32、本发明的技术特点及有益效果：
33、1、本发明提供了一种基于聚集诱导发光组装体和crispr/cas12a的副溶血性弧菌检测试剂盒，是在crrna的介导下，cas12a蛋白可特异性识别副溶血性弧菌的特异性基因片段不耐热溶血素tlh，对cy3.5-ssdna荧光探针进行剪切，btpetd、psma以及剪切后的cy3.5标记的荧光探针在疏水作用下共组装到一起形成聚集诱导发光组装体，cy3.5荧光团与btpetd之间产生fret，在btpetd的激发波长下产生cy3.5的荧光信号，由此实现对于副溶血性弧菌的检测。该方法操作简单便携，不依赖大型仪器设备，且灵敏度高、特异性强，具有一定的应用前景。
34、2、本发明提供的基于聚集诱导发光组装体和crispr/cas12a的副溶血性弧菌检测方法检测速度快，采用聚集诱导发光材料代替传统有机染料，克服了传统有机染料由于聚集而引起的淬灭现象，与传统的检测方法相对比特异性更强、检测限更低、灵敏度更高。
35、3、本发明提供的基于聚集诱导发光组装体和crispr/cas12a的副溶血性弧菌检测方法采用双色比率荧光信号输出方式，克服单发射荧光信号易受周围环境、仪器波动、探针浓度等因素的影响，实现更准确的实验结果。
1.一种用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于，包括cas12a蛋白、crrna、单链荧光探针、聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液、缓冲溶液和无酶水。
2.如权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述cas12a蛋白识别的靶标为副溶血性弧菌的特异性基因片段不耐热溶血素tlh；
3.如权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述crrna的核苷酸序列为：5’-uaauuucuacuaaguguagauaucuggcugcauugcugcgu-3’。
4.如权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述单链荧光探针为cy3.5-ssdna荧光探针，是在ssdna的3’端修饰cy3.5荧光基团，核苷酸序列如下：5’-gacgtaaacggccacaagttc-cy3.5-3’。
5.如权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述聚集诱导发光材料为4,7-双[4-(1,2,2-三苯基乙烯基)苯基]苯并-2,1,3,-噻二唑(btpetd)，其结构如式(ⅰ)所示：
6.如权利要求1所述的用于检测副溶血性弧菌的试剂盒，其特征在于，所述聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液按照如下方法制备：
7.一种利用权利要求1所述试剂盒检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括步骤如下：
8.如权利要求1所述检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用常规现有方法提取待测样本的基因组。
9.如权利要求7所述检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述检测体系中cas12a的蛋白终浓度为35～45nm，crrna的终浓度为45～50nm，单链荧光探针的终浓度为750～850nm，总体积为45～55μl；
10.如权利要求7所述检测副溶血性弧菌的方法，其特征在于，步骤(3)中，加入聚集诱导发光材料/两性聚合物储备液和缓冲溶液后，btpetd的终浓度为0.15～0.25μg/ml，psma的终浓度为0.05～0.15μg/ml，总体积为180～220μl；
