本发明属于兽用疫苗领域，涉及一种牛副流感病毒3型病毒样颗粒二价疫苗及其制备方法。
背景技术：
1、牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3，bpiv-3)是副粘病毒科呼吸病毒属的一种有包膜的负链rna病毒，是导致牛呼吸道疾病综合征最重要的病毒之一，可引发牛肺炎和非典型间质性肺炎，增加继发性细菌感染的风险，给养牛业构成严重威胁。基于全基因组序列系统发育分析，bpiv-3分为a、b、c三种基因型，中国流行的优势血清型为c型，其次为a型。bpiv-3基因组编码六种结构蛋白，其中核蛋白(n)、磷蛋白(p)和大聚合酶蛋白(l)构成病毒核衣壳，基质蛋白(m)主要负责病毒自组装和释放，融合蛋白(f)和血凝素/神经氨酸酶(hn)是两种囊膜糖蛋白，在病毒的吸附、侵入和运输中起关键作用，同时也是中和抗体的主要靶标。
2、免疫接种是防控疾病的关键措施，目前市售的bpiv-3疫苗主要为灭活疫苗和弱毒疫苗，常与其它牛呼吸道病原制成联苗，免疫牛体后可获得有效保护。但近几年对牛血清学调查发现，长期使用bpiv-3a制成的单价疫苗，牛群中b与c型的患病率呈上升趋势。另一研究显示所选的bpiv-3c病毒对异源基因型bpiv-3的交叉反应性降低，这些结果表明不同基因型之间的抗原性存在差异。bpiv-3的很多新型疫苗正在研发中，如病毒活载体疫苗免疫后针对bpiv-3可诱导高效的免疫保护反应，但是存在毒力返强等安全隐患。亚单位疫苗更加安全，但免疫原性通常低于减毒活疫苗，不能诱导强烈且持久的免疫应答。病毒样颗粒(virus-like particles，vlps)则兼具安全与高效，以浓缩和密集方式展示的抗原表位更易被树突状细胞吞噬，激活适应性免疫应答并诱导强烈的细胞和体液免疫应答。此外，vlps不含病毒遗传物质和复制酶，确保了良好安全性，且生产周期短。vlps的这些优势使其成为当前疫苗研究的热点。
3、本实验室前期构建了由bpiv-3a的hn蛋白和m蛋白组装的vlps(cn 116656742a)，在豚鼠中能够诱导显著的体液免疫和细胞免疫反应，表现出良好的免疫原性。然而，该疫苗对于当前广泛流行的bpiv-3c毒株无交叉保护力。因此，本发明针对我国两种主要的基因型a型和c型开发二价疫苗，希望可以控制我国的bpiv-3流行。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种利用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备的牛副流感病毒3a型与c型病毒样颗粒二价疫苗，旨在提高疫苗的覆盖率，为同时预防bpiv-3a、bpiv-3c提供了一种新型候选疫苗。
2、为了实现上述目的，本发明使用了以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种由牛副流感病毒3a型与3c型病毒样颗粒组成的二价疫苗，所述3a型与3c型病毒样颗粒分别含有bpiv 3a m蛋白、hn蛋白和bpiv3c m蛋白、hn蛋白。
4、第二方面，本发明提供了一种制备所述病毒样颗粒二价疫苗的方法，包括以下步骤：
5、1)分别以bpiv3a、bpiv-3c的cdna为模板，用特异性引物扩增m和hn基因片段；
6、2)将bpiv3a、bpiv-3c的m和hn基因片段分别克隆到表达载体，转化感受态细胞，分别得到含有bpiv-3a m基因、bpiv-3a hn基因、bpiv-3c m基因、bpiv-3c hn基因的重组杆状病毒穿梭质粒；
7、3)用重组杆状病毒穿梭质粒分别转染昆虫细胞，拯救获得含有bpiv-3a m基因、bpiv-3ahn基因、bpiv-3c m基因、bpiv-3c hn基因的重组杆状病毒；
8、4)将含有bpiv-3a m基因的重组杆状病毒、含有bpiv-3a hn基因的重组杆状病毒共感染昆虫细胞；将含有bpiv-3c m基因的重组杆状病毒、含有bpiv-3c hn基因的重组杆状病毒共感染昆虫细胞，然后分离纯化获得含有目的蛋白的病毒样颗粒；
9、5)将含有bpiv3a m蛋白、hn蛋白的病毒样颗粒和含有bpiv3c m蛋白、hn蛋白的病毒样颗粒混合，加入佐剂制成病毒样颗粒二价疫苗。
10、其中，所述bpiv-3a m基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述bpiv-3a hn基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述bpiv-3c m基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述bpiv-3c hn基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
11、其中，用于扩增所述bpiv-3c m基因的引物序列如seq id no.5、seq id no.6所示；用于扩增所述bpiv-3c hn基因的引物序列如seq id no.7、seq id no.8所示。
12、所述昆虫细胞为sf9细胞。
13、所述表达载体为pfastbac1质粒。
14、所述佐剂为isa 201佐剂。
15、本发明的有益效果是：
16、a型和c型是bpiv-3在我国流行的主要的基因型，现有的疫苗对其缺乏交叉保护力，本发明利用杆状病毒昆虫细胞表达系统对bpiv-3中的关键抗原蛋白m和hn蛋白进行自组装，成功构建了bpiv-3a型和c型病毒样颗粒并制成二价疫苗，其中，hn蛋白作为bpiv-3主要结构蛋白，是中和抗体的主要靶点，而m蛋白是促使病毒颗粒形成的关键因素。本发明不仅可以有效控制我国的bpiv-3流行，同时还提高了疫苗的免疫保护效力，能更加高效地激发体液免疫和细胞免疫反应，降低动物体内组织的病毒载量。
1.一种病毒样颗粒二价疫苗，其特征在于，它由含有牛副流感病毒3a型(bpiv 3a)m蛋白、hn蛋白的病毒样颗粒和含有牛副流感病毒3c型(bpiv3c)m蛋白、hn蛋白的病毒样颗粒组成。
2.一种制备权利要求1所述病毒样颗粒二价疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述bpiv-3a m基因的核苷酸序列如seqid no.1所示；所述bpiv-3a hn基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述bpiv-3c m基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述bpiv-3c hn基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：用于扩增所述bpiv-3c m基因的引物序列如seq id no.5、seq id no.6所示；用于扩增所述bpiv-3c hn基因的引物序列如seq idno.7、seq id no.8所示。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述昆虫细胞为sf9细胞。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述表达载体为pfastbac1质粒。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述佐剂为isa 201佐剂。
