本申请涉及疫苗领域，尤其涉及一种四价重组手足口病疫苗及其制备方法。
背景技术：
1、手足口病是一种由肠道病毒引起的急性传染病，具有相当高的发病率和死亡率，多发生在5岁以下的婴幼儿身上，主要特征是发烧和手、脚和口腔的疱疹或疱疹性咽喉炎，甚至造成中枢神经系统损伤和心肺衰竭。手足口病暴发的主要病原体是肠道病毒a71(eva71)和柯萨奇病毒a16(cva16)。近年来，由柯萨奇病毒a6(cva6)和柯萨奇病毒a10(cva10)引起的手足口病越来越常见[4]。目前还无特异性治疗手段。疫苗是预防手足口病较为有效的措施。虽然中国已有多个针对eva71的上市灭活疫苗(yi,e.j.etal.enterovirus71infection and vaccines.clin.exp.vaccin.res.6,4–14(2017).)，但eva71灭活疫苗对其他主要病原体cva16、cva10和cva6等病毒引起的手足口病并不能提供有效交叉保护。因此，亟需开发多价手足口疫苗来提供更加广泛和有效的免疫保护。
技术实现思路
1、基于上述现有技术的缺陷，本申请将不同剂量的cva6、cva10、cva16和eva71病毒样颗粒(virus-like particles，vlp)与不同剂量的铝佐剂进行配伍，将制备的四价重组手足口病疫苗制剂免疫小鼠进行免疫原性评价，以确定免疫原剂量、配伍比例及铝佐剂添加的必要性及用量。免疫实验结果显示，四价重组手足口病疫苗中各型vlp剂量为1～20μg可诱导良好的中和抗体，优选剂量为5～20μg，且各型别免疫原剂量在5～20μg范围内变化时诱导的中和抗体水平无明显差异。此外，四价重组手足口病疫苗中铝佐剂添加0～750μg时均可诱导针对cva6、cva10、cva16和eva71四种病毒的中和抗体，较优剂量为250～750μg，因此，铝佐剂添加对四价重组手足口病疫苗来说是必要的，本申请为四价重组手足口病疫苗临床研究提供了依据。
2、因此本申请第一方面提供一种四价重组手足口病疫苗，包括cva6 vlp、cva10vlp、cva16 vlp、eva71 vlp和铝佐剂。在单剂量疫苗中，按干重计，所述cva6 vlp、cva10vlp、cva16 vlp、eva71 vlp的含量均为1～20μg，所述铝佐剂为氢氧化铝，所述铝佐剂的含量以al3+含量计为0～750μg。
3、本申请第二方面提供一种四价重组手足口病疫苗的制备方法，包括以下步骤：
4、s1)获取cva6 vlp、cva10 vlp、cva16 vlp、eva71 vlp原液；
5、s2)在单剂量疫苗中，以干重计，按照上述各vlp的含量均为1～20μg，铝佐剂的含量以al3+含量计为0～750μg的比例，将s1)中的各vlp原液和铝佐剂混合。
6、本申请第三方面提供一种由上述第二方面的制备方法制备得到的四价重组手足口病疫苗。
7、本申请第四方面提供上述第一方面的四价重组手足口病疫苗、上述第二方面的制备方法、上述第三方面的四价重组手足口病疫苗在制备预防和/或治疗手足口病药物中的用途。
8、本申请的有益效果在于：本申请提供了最优的免疫原剂量和铝佐剂使用剂量，通过本申请的四价重组手足口病疫苗的配伍制备的疫苗，安全性良好，可诱导较好的免疫反应，各抗原组分之间无明显免疫干扰，可以同时诱导较高水平滴度的针对cva6、cva10、cva16和eva71病毒的中和抗体，提供更好的保护效果，为四价重组手足口病疫苗临床研究提供了依据。
1.一种四价重组手足口病疫苗，包括cva6 vlp、cva10 vlp、cva16 vlp、eva71 vlp和铝佐剂。
2.根据权利要求1所述的四价重组手足口病疫苗，其特征在于，在单剂量疫苗中，以干重计，所述cva6 vlp、cva10 vlp、cva16 vlp、eva71 vlp的含量均为1～20μg，优选的，所述cva6 vlp、cva10 vlp、cva16 vlp、eva71 vlp的含量均为5～20μg。
3.根据权利要求2所述的四价重组手足口病疫苗，其特征在于，所述铝佐剂为氢氧化铝，所述铝佐剂的含量以al3+含量计为0～750μg，优选的，所述铝佐剂的含量以al3+含量计为250～750μg。
4.根据权利要求2所述的四价重组口病疫苗，其特征在于，所述cva6 vlp、cva10 vlp、cva16 vlp、eva71 vlp在疫苗中的质量比为(5～20)：(5～20)：(5～20)：(5～20)。
5.根据权利要求2-3任一项所述的四价重组手足口病疫苗，其特征在于，所述cva6vlp、cva10 vlp、cva16 vlp、eva71 vlp的使用浓度均为2～40μg/ml，所述铝佐剂的使用浓度以al3+含量计为0～1500μg/ml。
6.一种四价重组手足口病疫苗的制备方法，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s1)中，通过培养毕赤酵母工程菌并诱导蛋白表达，经蛋白释放、层析、超滤换液获取cva6 vlp、cva10 vlp、cva16 vlp、eva71vlp原液。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤s2)中，还包括先将铝佐剂与稀释液混合后，再与vlp原液混合，通过搅拌进行蛋白吸附；优选的，所述搅拌的速度为100～600rpm，所述搅拌的时间为0.5～3h。
9.根据权利要求6-8任一项所述的制备方法制备得到的四价重组手足口病疫苗。
10.如权利要求1-5任一项所述的四价重组手足口病疫苗、或权利要求6-8任一项所述的制备方法、或权利要求9所述的四价重组手足口病疫苗在制备预防和/或治疗手足口病的药物中的用途。
