本发明涉及生物，特别涉及一种样本常温保存及质谱检测方法在代谢组学中的应用。
背景技术：
1、代谢组学作为一种新兴的系统生物学方法，能够实时反映生命系统的代谢状态。血清是体内小分子的主要载体，在运输气体、营养物质、激素和代谢废物方面起着至关重要的作用。血清的代谢状态受病理状况和器官功能障碍的调控，内源性代谢物的变化为体外诊断提供了新的见解。与核磁共振波谱(nmr)等其他方法相比，基于质谱技术的代谢分析在临床应用的敏感性和可重复性方面显示出独特的优势。然而生物体液中代谢物的丰度相对较低，样品复杂度高，传统的质谱方法仍依赖于繁琐的样品预处理。由于大量的高丰度蛋白会掩蔽代谢物信号，在复杂血清样品中进行代谢指纹谱的直接检测十分困难。此外，样本采集及运输过程中血清代谢组的组成及相对丰度会发生显著变化，导致原始血清代谢信息的严重失真，进而影响在临床疾病研究中的应用。新鲜采集的血清样本处于活跃的新陈代谢状态，其代谢组分会迅速被血清中代谢酶降解；同时，样品储存过程中血清代谢组分会被代谢酶进一步降解，从而导致代谢谱的显著变化。通常情况下，从全血中分离的血清样品需储存在-80℃或更低的温度中直至代谢检测。然而，受限于超低温设备的普及覆盖面及长途运输距离，在大多数情况下难以实现样品的超低温运输。因此，血清样品采集后的原始代谢信息储存是现今代谢组学研究中的重大挑战。
2、maldi-ms具有选择性好、样品制备简单、实际应用通量高等特点，在生物检测领域应用广泛。然而，传统有机基质的使用通常会产生背景信号，干扰低分子量范围内代谢物的检测。因此，研究者们相继开发了多种免基质ldi-ms技术，如dios-ms、saldi-ms和nims。这些技术利用无机纳米材料在解吸/电离过程中进行能量和电荷传递，从而显著降低了背景信号。然而，蛋白质和其他生物分子的共存会显著影响ldi效率，因此真实生物体液分析仍需要复杂的样品预处理程序。与磁性金属氧化物纳米颗粒、石墨烯、碳纳米管等代谢物富集材料相比，多孔硅(psi)材料的尺寸和孔径易于调节，规则的孔道结构可以高效捕获复杂体液中的低丰度代谢物，并将生物样本中的高丰度蛋白排阻在孔道外。同时，得益于多孔硅规则的孔道结构、较大的比表面积以及良好的紫外光吸收能力，多孔硅孔道内富集的小分子代谢物可以在激光轰击下直接解吸电离，无需传统有机基质的辅助。
3、肝细胞癌(hcc)是最常见的侵袭性恶性肿瘤之一，是导致慢性肝病患者死亡的主要原因。甲胎蛋白(afp)在20世纪70年代首次被发现，已被广泛认为是hcc诊断和预后的临床指标。然而，afp对hcc临床诊断和临床前预测的敏感性仅有65％和<40％。肝活检是目前临床诊断afp阴性的hcc患者的金标准，但作为一种侵入性诊断方法存在许多局限性。开发可靠的生物标志物来实现高危人群中早期hcc筛查迫在眉睫，如慢性乙型肝炎(chronichepatitis b，chb)和肝硬化(liver cirrhosis，lc)人群，血清代谢组学具有很大潜力，但符合实际应用需求的灵敏度高、样品前处理简单、检测速度快的代谢检测方法尚未解决。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明提供的一种样本常温保存及质谱检测方法在代谢组学中的应用，只需微量血清即可进行高通量检测，免提取、免预处理、免基质，只需简单稀释，操作简便，且样品可常温运输、抗盐性能好。本技术通过非靶向血清代谢组学分析以发现失调代谢物作为生物标志物，提出的免处理血清代谢组学质谱技术不仅可以在代谢水平上洞察hcc发病的途径，并且有望实现高危人群中的大规模hcc筛查。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了标志物，包括间甲酚、丁二酸、龙胆酸、组氨酸、庚二酸和咖啡酸。
4、本发明还提供了标志物在如下任一项中的应用：
5、(1)、鉴定慢性乙型肝炎或肝硬化；
6、(2)、制备鉴定慢性乙型肝炎或肝硬化的试剂或试剂盒。
7、在本发明的一些具体实施方案中，上述标志物还包括尿嘧啶、黄嘌呤和l-二氢乳清酸。
8、本发明还提供了标志物在如下任一项中的应用：
9、(1)、区分肝细胞癌高危人群或肝细胞癌患者；
10、(2)、制备区分肝癌高危人群或肝细胞癌患者的试剂或试剂盒。
11、在本发明的一些具体实施方案中，上述标志物还包括三乙基胺、α-氨基丁酸、丝氨酸、对苯二酚、半胱氨酸、牛磺酸、焦谷氨酸、腺嘌呤、水苏碱、辛酸、醛赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、鸟嘌呤、肉碱、苯丙氨酸、8-羟基鸟嘌呤、磺基丙氨酸、n-乙酰谷氨酸、马尿酸、酪氨酸、色氨酸、5-十四碳烯酸和硬脂酸。
12、在本发明的一些具体实施方案中，上述标志物还包括甲胎蛋白。
13、本发明还提供了标志物在如下任一项中的应用：
14、(1)、区分肝细胞癌高危人群、肝细胞癌患者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者；
15、(2)、制备区分肝细胞癌高危人群、肝细胞癌患者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者的试剂或试剂盒。
16、本发明还提供了筛查肝细胞癌高危人群、肝细胞癌患者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者的方法，其基于上述标志物筛查。
17、本发明还提供了基于多孔硅颗粒的质谱检测方法，其基于以3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的多孔硅进行质谱检测。
18、在本发明的一些具体实施方案中，上述质谱检测方法包括如下步骤：
19、步骤(1)：采集待测样本；
20、步骤(2)：等体积混合所述待测样本和多孔硅微粒悬浮液，获得混合样品悬浮液；
21、步骤(3)：将所述混合样品悬浮液振荡孵育5min，室温密封保存；
22、步骤(4)：移取1μl步骤(3)所述混合样品悬浮液于质谱靶板上，干燥；
23、步骤(5)：对步骤(4)干燥后的所述质谱靶板进行质谱检测；
24、所述多孔硅颗粒包括以3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的多孔硅颗粒。
25、在本发明的一些具体实施方案中，上述质谱检测方法中所述多孔硅微粒悬浮液包括多孔硅颗粒和缓冲溶液。
26、在本发明的一些具体实施方案中，上述质谱检测方法中所述缓冲溶液包括超纯水和乙醇。
27、在本发明的一些具体实施方案中，上述质谱检测方法中所述超纯水和所述乙醇的体积比例包括1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1；
28、所述多孔硅颗粒在所述多孔硅微粒悬浮液中的浓度包括0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml、1mg/ml、1.1mg/ml、1.2mg/ml、1.3mg/ml、1.4mg/ml、1.5mg/ml、1.6mg/ml、1.7mg/ml、1.8mg/ml、1.9mg/ml或2.0mg/ml。
29、在本发明的一些具体实施方案中，上述质谱检测方法中所述常温包括10℃、15℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃或40℃。
30、在本发明的一些具体实施方案中，上述质谱检测方法的检测项目包括上述标志物。
31、本发明还提供了常温保存血清代谢信息的方法，包括取血清与aptes-psi混合的步骤；
32、所述aptes-psi为以3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的多孔硅。
33、本发明的方法有如下效果：
34、得益于多孔硅规则的孔道结构、较大的比表面积以及良好的紫外光吸收能力，多孔硅孔道内富集的小分子代谢物可以在激光轰击下直接解吸电离，无需传统有机基质的辅助；提出了基于psi微粒的免预处理ldi-ms技术，囊括代谢物富集、原始代谢信息储存以及代谢物检测；aptes-psi在复杂样品分析中具有良好的耐盐和耐蛋白性能；非靶向血清代谢组学分析以发现失调代谢物作为生物标志物。
1.标志物，其特征在于，包括间甲酚、丁二酸、龙胆酸、组氨酸、庚二酸和咖啡酸。
2.如权利要求1所述的标志物在制备鉴定慢性乙型肝炎或肝硬化的试剂或试剂盒中的应用。
3.如权利要求1所述的标志物，其特征在于，还包括尿嘧啶、黄嘌呤和l-二氢乳清酸。
4.如权利要求3所述的标志物在制备区分肝癌高危人群或肝细胞癌患者的试剂或试剂盒中的应用。
5.如权利要求3所述的标志物，其特征在于，还包括三乙基胺、α-氨基丁酸、丝氨酸、对苯二酚、半胱氨酸、牛磺酸、焦谷氨酸、腺嘌呤、水苏碱、辛酸、醛赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、鸟嘌呤、肉碱、苯丙氨酸、8-羟基鸟嘌呤、磺基丙氨酸、n-乙酰谷氨酸、马尿酸、酪氨酸、色氨酸、5-十四碳烯酸和硬脂酸。
6.如权利要求5所述的标志物，其特征在于，还包括甲胎蛋白。
7.如权利要求5或6所述的标志物在制备区分肝细胞癌高危人群、肝细胞癌患者、慢性乙型肝炎患者或肝硬化患者的试剂或试剂盒中的应用。
8.基于多孔硅颗粒的质谱检测方法，其特征在于，基于以3-氨丙基三乙氧基硅烷修饰的多孔硅进行质谱检测。
9.如权利要求8所述的质谱检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.如权利要求8或9所述的质谱检测方法，其特征在于，其检测项目包括如权利要求1、3、5或6任一项所述的标志物。
