本发明属于材料合成，具体涉及一种ru(bpy)32+不同电势发光促进剂及其制备方法与应用。
背景技术：
1、电位分辨ecl策略是一种通过电化学可以转化为光能，并结合了电化学和化学发光的优点的检测方法，仅使用简单的电位扫描就可以实现同一工作区域的多信号输出。电位分辨ecl策略具有优越的时间和空间分辨能力，且具有选择性好，设备简单、小体量的检测迅速，背景信号低、灵敏度高，动态范围广和通用性广等特点。但由于一些外部环境的变化，单信号ecl测量可能会产生一些假阳性结果。因此，有必要创建一个“双信号”ecl测量系统。
2、目前通过”双信号“ecl进行检测的体系主要依据能量共振转移策略、内参比策略和共反应物竞争策略。但这些策略均存在一定的缺陷，例如，能量共振转移策略难以需要寻找到波长合适的供体和受体；使用内参比方法往往需通过双信号自校准ecl测量系统，虽然可以有效避免环境误差，如生物特征识别过程中的干扰等，但构建的传感界面复杂，易引起相互串扰。与其他ecl策略相比，共反应物促进剂因为其多样、简单、高效、稳定而显示出独特的优势。然现有共反应物竞争策略反应过程中，体系中的共反应物多采用h2o2，h2o2往往需要较大浓度才能更好地促进发光，而高浓度的共反应物会干扰目标的检测；并且h2o2性质不稳定，易于在环境温度下分解为oh·自由基，从而造成ecl信号的改变。因此，寻找性能稳定的共反应物对构建双信号测量系统格外重要。
3、贵金属配合物三联吡啶钌(ii)ru(bpy)32+是目前使用最为广泛的发光体，其发光效率高、稳定性好并可循环利用，得到了人们的关注。同时，其拥有在不同相应共反应物促进时，可显示出电势分辨的发光性能，可以作为单发光体多共反应物体系的发光体选择。然而，目前ru(bpy)32+的性能稳定的发光体较少，已知的gsh、h2o2、过硫酸钠等共反应物均存在性质不稳定的问题。因此，需要寻找更合适的共反应物促进剂来提高ecl发光效果。
4、现有技术中，cn115414930a专利公开了一种ru(bpy)32+阳极或阴极共反应物及其制备方法，该ru(bpy)32+阳极或阴极共反应物均为au-rgo复合物，阳极共反应物中的au纳米粒子的粒径为10-15nm；阴极共反应物中的au纳米粒子的粒径为2-4nm。cn109490285b专利公开了一种基于ru(bpy)32+和bi纳米棒自增强体系的唾液酸可再生电致化学发光传感器，其采用bi nrs作为ru(bpy)32+的共反应试剂，构成自增强ru(bpy)32+-bi纳米棒体系，将其固定在金红石二氧化钛介晶表面，制备了一种高效的ecl探针用于sa检测。
技术实现思路
1、有鉴于此，针对现有ru(bpy)32+发光体的共反应物所存在的难以寻找、性能不稳定等缺陷，本发明提出了两种n掺杂石墨烯/镍纳米颗粒的复合物(ni/ng-1和ni/ng-2)，其中ni/ng-1可以有效促进ru(bpy)32+阴极发光，ni/ng-2可以有效促进ru(bpy)32+阳极发光。
2、本发明的目的之一在于提供一种ru(bpy)32+不同电势发光促进剂。
3、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
4、ru(bpy)32+不同电势发光促进剂，所述ru(bpy)32+不同电势发光促进剂包括ru(bpy)32+阳极发光促进剂和/或ru(bpy)32+阴极发光促进剂；所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂和所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂均为ni/ng复合物，所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂中含有ni 111晶面和ni 200晶面；所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂中含有ni 110晶面。
5、本发明中，ru(bpy)32+阳极发光促进剂即为ni/ng-2，ru(bpy)32+阴极发光促进剂即为ni/ng-1。本发明从两个方面探索和阐述了ecl的阳极/阴极发光机制。一方面，ni/ng-1和ni/ng-2促进ru(bpy)3 2+阳极/阴极发光中与orr/oer反应息息相关。研究发现，ni/ng-1促进ru(bpy)32+阴极发光是源于其2电子转移路径和对orr反应的弱催化作用，催化作用产生的源源不断的o2·-和h2o2，具有强氧化性且存在时间较长，进而产生良好的阴极发光。而ni/ng-2能够有效促进阳极发光，主要是因为其oer产物·oh的作用与自身的基团都能作为共反应物最终生成ru(bpy)3 2+*并在1.2v产生阳极电化学发光；并且其本身的大表面缺陷和大面积金属位点为促进电化学反应电子转移的速率和快速产生稳定持久的发光提供条件。另一方面，粒径效应中晶面改变对催化性能具有较大影响。本发明利用dft计算与原位红外技术明确了金属纳米粒子催化剂晶面结构与orr、oer催化性能间的偶联关系，研究证实，含有ni(1 1 0)晶面的ni/ng-1，orr能力较弱，oer催化能力强，可有效促进ru(bpy)32+阳极ecl发光；而含有ni(1 1 1)晶面和ni(2 0 0)晶面的ni/ng-2，orr能力更强，oer催化能力较弱，反应体系产生的·oh-促进了ru(bpy)32+阴极ecl发光。
6、进一步，所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂中ninps的直径为85-95nm，所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂中ninps的直径为1.5-2.5nm。
7、作为优选，所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂中ninps的直径为87.1nm，所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂中ninps的直径为1.9nm。
8、进一步，所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂中镍含量为13％-18％，所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂中镍含量为0.1％-0.3％。
9、作为优选，所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂中镍含量为0.19％，ru(bpy)32+阳极发光促进剂中镍含量为15.43％。
10、本发明的目的之二在于提供一种ru(bpy)32+不同电势发光促进剂的制备方法。
11、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
12、ru(bpy)32+不同电势发光促进剂的制备方法，包括如下步骤：
13、(1)ru(bpy)32+阴极发光促进剂的制备：取氧化石墨烯分散液加入ni(no3)3溶液进行反应，得反应液一；向所述反应液一中加入柠檬酸钠进行反应，得反应液二；向所述反应液二中加入吡咯进行反应，制得所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂；
14、(2)ru(bpy)32+阳极发光促进剂的制备：取氧化石墨烯分散液加入吡咯、硝酸镍水溶液、乙二醇和水合肼进行反应，制得所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂。
15、进一步，所述氧化石墨烯分散液的浓度为2mg/ml。
16、进一步，所述氧化石墨烯分散液是将氧化石墨烯溶解在超纯水中制得。
17、进一步，氧化石墨烯是以天然石墨粉为原料，采用hummers法氧化合成后改性制得。
18、作为优选，氧化石墨烯的制备方法如下：
19、1)将石墨粉与h2so4混合后，在冰浴中搅拌，同时加入kmno4，使悬浮液温度保持在20℃以下；将反应体系依次转移到40℃的油浴中，剧烈搅拌约30分钟，得到反应液；
20、2)向步骤1)所得反应液加入水，95℃搅拌15分钟；然后加入水和h2o2，使溶液的颜色从深棕色变成黄色；过滤并用hcl水溶液清洗；所得固体干燥、稀释，得到水性氧化石墨水分散体；
21、3)将步骤2)所得水性氧化石墨水分散体进行透析纯化，所得氧化石墨水分散液稀释后搅拌过夜；超声30分钟，使其脱落为氧化石墨烯；将go分散体离心，去除未剥离的石墨，得到氧化石墨烯。
22、作为更优选，所述hcl水溶液中，hcl和水的体积比为1：10。
23、进一步，步骤(1)中，氧化石墨烯分散液、ni(no3)3溶液、柠檬酸钠和吡咯的体积比为1800-2200：2-15：20-30：5-15，优选为2000：7.5：25：8。
24、进一步，步骤(1)中，ni(no3)3溶液分三次加入，每次添加后超声10分钟，并在室温下搅拌2小时。
25、进一步，步骤(1)中，加入柠檬酸钠后，搅拌15min，超声5min。
26、进一步，步骤(1)中，加入吡咯后，搅拌30min；然后以12000rpm离心2h；取沉淀重悬，得到ru(bpy)32+阴极发光促进剂。
27、作为优选，所述ni(no3)3溶液的浓度为3mm。
28、作为优选，所述柠檬酸钠的浓度为0.01m。
29、进一步，步骤(2)中，氧化石墨烯分散液、吡咯、硝酸镍水溶液、乙二醇和水合肼的体积比为1.5-2.5：0.2-0.6：0.3-0.8：0.5-1.5：0.1-0.3，优选为2：0.4：0.5：1：0.125。
30、进一步，步骤(2)中，反应在衬聚四氟乙烯的不锈钢高压反应釜中进行。
31、进一步，步骤(2)中，反应条件为120℃下油浴加热12h。
32、进一步，步骤(2)反应结束后，所得反应液以10000prm离心10min，除去上清液，并用超纯水分散沉淀物，重复该过程两次，得到悬浊液；然后使用匀浆机分散悬浊液1h，超声20min，得到所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂。
33、本发明的目的之三在于提供一种含有前述ru(bpy)32+不同电势发光促进剂的免疫传感器。
34、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
35、含有前述ru(bpy)32+不同电势发光促进剂的免疫传感器。
36、进一步，所述免疫传感器为比率型ecl免疫传感器；所述比率型ecl免疫传感器采用ru(bpy)32+作为单一发光体；以gce为基底电极，在基底电极上修饰ru(bpy)32+阳极发光促进剂和ru(bpy)32+阴极发光促进剂制得。
37、进一步，所述免疫传感器采用如下方法进行制备：
38、将ni/ng-1滴于清洗后的gce上，室温干燥；用edc/nhs溶液在37℃下活化ni/ng-1的含氧基团30min；超纯水洗涤，将ceaab1在修饰电极上37℃孵育1h；pbs洗涤，在修饰电极上浸取bsa；在修饰后的电极上加入不同浓度cea(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7ng/ml)，37℃孵育1h；超纯水清洗后，加入ni/ng-2-cea-ab2在修饰电极上37℃孵育1h，pbs溶液洗脱，制得所述比率型ecl免疫传感器。
39、作为优选，所述ni/ng-2-cea-ab2的制备方法为：将ni/ng-2加入到edc(0.01mol/l)/nhs(0.002mol/l)中，再加入10ug/ml ab2，4℃恒温振荡10h；离心，pbs洗涤；用1％ bsa溶液4℃孵育2h；离心，pbs洗涤重悬，即得。
40、作为更优选，所述ni/ng-2、edc/nhs、ab2的体积比为1:1:1。
41、本发明的目的之四在于提供一种检测肿瘤标志物cea的方法。
42、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
43、检测肿瘤标志物cea的方法，所述方法为非疾病诊断目的的检测方法；所述方法是利用权利要求7所述的免疫传感器检测对待测样本进行检测，根据测得的ecl信号测得肿瘤标志物cea的含量。
44、本发明的目的之五在于提供一种ni/ng复合物在作为ru(bpy)32+不同电势发光促进剂中的应用。
45、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
46、ni/ng复合物在作为ru(bpy)32+不同电势发光促进剂中的应用，所述ni/ng复合物包括含有ni110晶面的ni/ng-1和含有ni 111晶面、ni 200晶面的ni/ng-2；所述ni/ng-2和ni/ng-1分别作为单一发光体ru(bpy)32+的阳极发光促进剂和阴极发光促进剂。
47、进一步，所述ru(bpy)32+、ni/ng-1和ni/ng-2共同组成单发光体多信号输出体系，其中，ni/ng-1作为阴极发光促进剂，ni/ng-2作为阳极发光促进剂，ru(bpy)32+作为单一发光体，在ni/ng-1和ni/ng-2的作用下有效增强ru(bpy)32+阳极和阴极发光。
48、本发明的有益效果在于：
49、1.本发明深入探索了两种ni/ng复合物的orr/oer催化能力，并利用dft计算与原位红外技术明确金属纳米粒子催化剂晶面结构与orr、oer催化性能间的偶联关系，为多信号ecl发光促进剂的设计与合成提供了新思路。本发明克服了现有ru(bpy)32+发光体的共反应物所存在的难以寻找、性能不稳定等缺陷，成功设计了制备过程简便、性能稳定且相互关联的阴极、阳极发光优异的共反应物，为ecl传感器的开发提供了基础。
50、2.本发明利用电化学发光高效、灵敏的特点，提出了两种ru(bpy)32+发光体的共反应物促进剂ni/ng-1和ni/ng-2。其中ni/ng-1含有ni(1 1 0)晶面具有更强的oer催化能力，可有效促进ru(bpy)32+阳极ecl发光；ni/ng-2含有ni(1 1 1)晶面、ni(2 0 0)晶面具有更强的orr能力，可有效促进ru(bpy)32+阴极ecl发光。该两种ni/ng复合物性能稳定，可以促进ru(bpy)32+的高效发光，且合成方法简单、快速，易操作。
51、3.本发明将两种ru(bpy)32+共反应物用于设计体系简单的免疫传感器，仅使用一种发光体，两种发光性能优异的共反应物促进剂，达到直接而清晰的肿瘤标志物的检测发光效果，实现了可靠、直观且具有高灵敏度的检测，大大提高了ecl的检测效率。
1.ru(bpy)32+不同电势发光促进剂，其特征在于，所述ru(bpy)32+不同电势发光促进剂包括ru(bpy)32+阳极发光促进剂和/或ru(bpy)32+阴极发光促进剂；所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂和所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂均为ni/ng复合物，所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂中含有ni111晶面和ni 200晶面；所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂中含有ni 110晶面。
2.根据权利要求1所述的ru(bpy)32+不同电势发光促进剂，其特征在于，所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂中ninps的直径为85-95nm，所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂中ninps的直径为1.5-2.5nm。
3.根据权利要求1所述的ru(bpy)32+不同电势发光促进剂，其特征在于，所述ru(bpy)32+阳极发光促进剂中镍含量为13％-18％，所述ru(bpy)32+阴极发光促进剂中镍含量为0.1％-0.3％。
4.权利要求1-3任一项所述的ru(bpy)32+不同电势发光促进剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，氧化石墨烯分散液、ni(no3)3溶液、柠檬酸钠和吡咯的体积比为1800-2200：2-15：20-30：5-15。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，氧化石墨烯分散液、吡咯、硝酸镍水溶液、乙二醇和水合肼的体积比为1.5-2.5：0.2-0.6：0.3-0.8：0.5-1.5：0.1-0.3。
7.含有权利要求1-3任一项所述的ru(bpy)32+不同电势发光促进剂的免疫传感器。
8.根据权利要求7所述的免疫传感器，其特征在于，所述免疫传感器为比率型ecl免疫传感器；所述比率型ecl免疫传感器采用ru(bpy)32+作为单一发光体；以gce为基底电极，在基底电极上修饰ru(bpy)32+阳极发光促进剂和ru(bpy)32+阴极发光促进剂制得。
9.检测肿瘤标志物cea的方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断目的的检测方法；所述方法是利用权利要求7所述的免疫传感器检测对待测样本进行检测，根据测得的ecl信号测得肿瘤标志物cea的含量。
10.ni/ng复合物在作为ru(bpy)32+不同电势发光促进剂中的应用，其特征在于，所述ni/ng复合物包括含有ni 110晶面的ni/ng-1和含有ni 111晶面、ni 200晶面的ni/ng-2；所述ni/ng-2和ni/ng-1分别作为单一发光体ru(bpy)32+的阳极发光促进剂和阴极发光促进剂。
