本发明涉及化学分析检测，尤其涉及一种吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：
1、生物硫醇是人体必需的活性硫物种，通常在生理和病理过程中发挥关键作用，如经历可逆氧化、调节氧化应激、失活活性自由基、信号转导和螯合有害金属离子。细胞内最有效的非蛋白生物巯基还原型谷胱甘肽(gsh)可使半胱氨酸(cys)和同型半胱氨酸(hcy)在蛋白质上保持平衡，而gsh水平异常可引起高血压、白细胞丢失、银屑病、肝损害和癌症。半胱氨酸是还原型谷胱甘肽的前体，在解毒、蛋白质代谢和合成等许多生理过程中发挥重要作用。据报道，cys是肥胖、毛发色素脱失、儿童生长缓慢、皮损、水肿、嗜睡、肌肉丧失和肝损害的危险因素。此外，hcy是cys的前体，hcy缺乏与许多疾病相关，包括心血管疾病、出生缺陷、叶酸和钴胺缺乏以及老年人的认知障碍。因此，选择性检测这三种生物硫醇在生物系统中具有重要意义。
2、真核细胞中含有许多细胞器，大多数生物事件发生在特定的细胞器内，如线粒体、溶酶体、内质网、脂滴、高尔基体等。这些组织良好的细胞器在细胞生长、分裂、融合、信号转导和凋亡等基本代谢过程中发挥着关键作用。溶酶体ph值为弱酸性(4.5～5.5)，含有60多种水解酶，主要用于分解和代谢细胞内的蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。硫醇通过还原二硫键与溶酶体内蛋白水解密切相关。例如，gsh是肾溶酶体中白蛋白水解的有效刺激物，cys可以有效刺激肝溶酶体中白蛋白的降解。为了更好地了解溶酶体硫醇的作用，对溶酶体中硫醇的有效监测和检测具有重要意义。
3、由于生物硫醇与多种疾病密切相关，许多研究都集中在开发不同的方法来监测它们在体外和体内的存在及浓度。检测生物硫醇的常规方法包括紫外-可见吸收光谱法、毛细管电泳法、电化学检测法、高效液相色谱法和质谱法。与上述检测技术相比，荧光探针具有一些特定的优点，如低成本、快速响应、高灵敏度，相对操作简单以及实时和无损成像。目前报道的生物硫醇荧光探针的设计主要依赖于bodipy、罗丹明、四苯基乙烯、香豆素和萘二甲酰亚胺等荧光团，并通过迈克尔加成、裂解反应、与醛的环化、亲核取代、共轭加成环化、金属络合物取代配位等传感机制实现对生物硫醇的检测。而吡唑啉衍生物作为一类重要的含氮五元杂环化合物，具有显著的蓝光发射、高荧光量子产率、窄发射波长和特殊的色纯度等优点。
4、因此，开发一种基于吡唑啉衍生物的溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针，用于检测半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽，具有重要的应用价值。
技术实现思路
1、本发明的目的在于为了克服现有技术的不足而提供一种吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针及其制备方法和应用。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针，生物硫醇荧光探针的结构式为：
4、
5、本发明还提供了所述的吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针的制备方法，包含如下步骤：
6、将化合物1、2-氯-3,5-二硝基吡啶、碱和有机溶剂混合后进行反应，得到吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针；
7、所述化合物1的结构式为：
8、
9、作为优选，所述碱为醋酸钠、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、三乙胺或醋酸铵。
10、作为优选，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。
11、作为优选，所述反应的温度为25～100℃，反应的时间为2～12h。
12、作为优选，化合物1、2-氯-3,5-二硝基吡啶和碱的摩尔比为1：1～2：0.6～1.2；化合物1和有机溶剂的摩尔体积比为1mol：20～40ml。
13、作为优选，反应完成后得到的产物顺次进行萃取、洗涤、干燥、减压浓缩、硅胶柱色谱法纯化，得到吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针。
14、本发明还提供了所述的吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针在制备检测生物硫醇产品中的应用。
15、本发明的有益效果包括：
16、1)本发明在吡唑啉为结构母核的基础上进行衍生化，引入溶酶体靶向的吗啉基团，合成一种溶酶体靶向的新型蓝色荧光染料。同时，引入对生物硫醇具有特异性反应的识别基团，借助光诱导电子转移(pet)机制，构建一种吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针。本发明的荧光探针由于2-氯-3,5-二硝基吡啶具有很强的吸电子性，导致光诱导电子转移(pet)效应开启，荧光探针本身不具有荧光性质，而当探针经生物硫醇处理后，由于生物硫醇具有很强亲核性，可以与探针分子立即发生亲核取代反应，导致荧光淬灭剂移除的同时伴随着蓝色荧光团的释放，从而引起荧光信号的变化，在470nm处观察到蓝色通道中的强荧光，实现对生物硫醇的定性检测及定量分析。
17、2)本发明通过分子设计得到一种可以特异性检测生物硫醇，且靶向溶酶体的有机小分子结构，可通过荧光成像实时监测活细胞溶酶体内cys、hcy、gsh的浓度波动，具有高选择性、高灵敏度和快速响应等优点。本发明的荧光探针对cys、hcy、gsh的检测浓度为1～200μmol/l，检测限分别为16.5nmol/l(cys)、16.8nmol/l(hcy)、21.3nmol/l(gsh)，良好的选择性和低细胞毒性使其成为同时检测cys、hcy和gsh的理想工具。
18、3)本发明的荧光探针具有良好的细胞膜渗透性，能够对活hela细胞中内源性及外源性生物硫醇进行成像，且该探针已成功应用于hela细胞溶酶体中生物硫醇的共聚焦成像。因此，本发明的荧光探针可用作水溶液及复杂生物体系中生物硫醇的检测，是用于研究生理过程中cys、hcy和gsh的功能及协同作用的具有前景的分子工具。
1.一种吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针，其特征在于，生物硫醇荧光探针的结构式为：
2.权利要求1所述的吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述碱为醋酸钠、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、三乙胺或醋酸铵。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、四氢呋喃或n,n-二甲基甲酰胺。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为25～100℃，反应的时间为2～12h。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，化合物1、2-氯-3,5-二硝基吡啶和碱的摩尔比为1：1～2：0.6～1.2；化合物1和有机溶剂的摩尔体积比为1mol：20～40ml。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，反应完成后得到的产物顺次进行萃取、洗涤、干燥、减压浓缩、硅胶柱色谱法纯化，得到吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针。
8.权利要求1所述的吡唑啉衍生物类溶酶体靶向的生物硫醇荧光探针在制备检测生物硫醇产品中的应用。
