本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原及制备和应用。
背景技术：
1、幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种革兰阴性、螺杆状、微需氧菌，可以在胃、黏膜和十二指肠上皮持续存在。1982年澳大利亚学者marshall和warren首次报道了从慢性胃炎和胃溃疡患者的胃黏膜中分离出幽门螺旋杆菌，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。已有大量研究证实，hp是胃肠道疾病的常见病原体，是慢性b型胃炎、胃和十二指肠溃疡的主要病因。hp也是胃肠癌、胃黏膜淋巴组织淋巴癌的关键病因，通过对细胞内信号的调控引起胃上皮细胞的遗传不稳定，影响dna损伤修复系统，促进了胃上皮细胞的肿瘤转化。1994年国际癌症研究中心就将其列为首要i类胃癌的致癌因子。2017年世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单显示，幽门螺杆菌属于i类致癌物，可诱发胃癌和淋巴增生性胃淋巴瘤等肿瘤。
2、尿素酶(urase)是一种镍依赖性酶，催化尿素水解成氨和碳酸，是幽门螺杆菌在细胞内和细胞膜上表达的最丰富的蛋白质，占总hp蛋白质的5％-10％。脲酶分解尿素产生氨，通过中和胃酸帮助细菌在胃中定植，并为细菌蛋白质合成提供氨。脲酶在细菌表面和内部均有分布，由urea和ureb两个亚基购成。在hp的致病机制方面，尿素酶主要通过水解尿素产生氨和二氧化碳,调节细菌细胞周围的ph值，是hp在高强度胃酸中得以生存和定植的关键，同时尿素酶是hp重要的定植因子和毒力因子。不同地区的hp菌株具有多样性和易变异等特点，但不同hp菌株间ureb的核酸序列具有高度的保守性和同源性，且分子量大，特异性强，能有效地诱导机体产生稳定的免疫保护作用，与urea相比，ureb具有更好的免疫保护作用。因此，ureb被列为最有前景的候选抗原之一。在所有被hp感染的患者中，尤其是在那些具有明显症状的患者中，都可以检测到尿素酶b抗体，并且该抗体水平在一定程度上与疾病状况的严重性有关。
3、人体黏膜免疫系统(human mucosal immune system，hmis)主要由弥散分布于呼吸道、生殖泌尿道及消化道等处的黏膜及黏膜下的淋巴细胞构成，是人体最大的一个器官，其表面积大于皮肤表面积。其中，肠道黏膜是人体最主要的黏膜部位。人类肠道具有约400cm2的表面积。在肠道黏膜系统中，存在着独特的淋巴组织以及其他大量的淋巴细胞，其通过其固有免疫和后天性免疫识别并抵抗外来危险病原，从而维持机体免疫稳态。在肠道黏膜部位，由于存在丰富的免疫细胞，抗原通过免疫细胞的摄取和呈递既能诱导全身的体液免疫和细胞免疫应答，如产生针对该抗原的抗体(主要是siga)和相应的细胞毒性t细胞(ctl)。同时，由于激活的抗原特异性淋巴细胞归巢至远程黏膜效应部位，也能诱导黏膜局部的免疫应答。因此肠黏膜免疫具有实现全身或局部免疫治疗的巨大潜力。肠道黏膜疫苗接种也是目前认为防御肠道致病菌的唯一途径。
4、细菌dna是toll样受体9的天然配体，含有非甲基化cpg序列的合成寡聚脱氧核苷酸(odns)可以模拟细菌dna结构并引发类似的活性。cpg odns可以触发表达tlr9的免疫细胞(包括人浆细胞样树突细胞和b细胞)，产生th1免疫及其相关细胞因子为特征的固有免疫反应。cpg odns用作疫苗佐剂时，可提高专职的抗原提呈细胞的功能，并促进抗原特异性的体液和细胞免疫反应。根据结构和生物功能，含cpg的序列可分为三大类：cpg-a类、cpg-b类和cpg-c类，其中cpg-b级分子是临床疫苗研究中最常用的。cpg-odn的结构和功能密切相关。事实上，分子的高级结构决定了cpg-odn是在细胞内定位于早期还是晚期溶酶体，这些溶酶体与不同的信号通路相关。多聚体cpg-a odn主要定位于早期溶酶体，在浆细胞样树突状细胞中，它们导致ifn-α的强烈诱导。单体cpg-b odns集中在晚期内体区室，可以促进浆细胞样树突状细胞和b细胞的细胞成熟。cpg-c odn定位于两个区室，诱导ifn-α的产生和细胞成熟。影响含cpg序列生物效应的其他结构修饰包括通过非核苷化学连接体连接两个或多个短的硫代磷酸酯骨架cpg odn，以产生线性嵌合免疫调节化合物和/或含cpg纳米颗粒化合物的制剂。1018是一种合成的cpg-b类寡核苷酸，具有硫代磷酸酯骨架和序列第一个cpg基序(下划线)是对小鼠tlr-9有活性的序列，而第二个cpg基序(下划双线)对人类和非人灵长类tlr-9具有活性。cpg 1018已被用作heplisav-b(一种改良的hbv疫苗)的佐剂，可用于成人(年龄>18岁)。尽管还有其它hbv疫苗已被广泛使用，但它们通常是以三剂方案给药，而heplisav-b提供了一种两剂方案。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原及制备和应用，解决现有技术中ureb蛋白纯化难度大，口服重组蛋白疫苗耐受性和抗原被稀释、降解甚至变性失活的技术问题。
2、为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
3、本发明提供的一种口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原，所述抗原为ureb，氨基酸序列如seq id no：1所示，融合蛋白his-gst-ureb的氨基酸序列如seq id no：2所示，融合蛋白his-gst-ureb编码核苷酸序列如seq id no:3所示。
4、本发明提供了一种口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，包括以下步骤：
5、s1、质粒构建，蛋白表达：将核苷酸序列如seq id no:3所示的his-gst-ureb基因链接在表达载体中，构建好的表达载体转入重组工程菌中进行诱导表达；
6、s2、发酵；
7、s3、纯化；
8、s31、菌体重悬；将菌体与a液按照质量比1:10加入a液进行稀释、重悬，至菌体均匀重悬于a液中；
9、s32、菌体破碎，离心过滤收集上清液；
10、s33、ni-ff1层析：采用a液平衡、上样、a液复平衡、7.5％b液洗杂、30％b液洗脱步骤收集样品；
11、s34、g25换液：采用c液平衡、上样、c液洗脱步骤收集样品；
12、s35、酶切：蛋白和pp酶按照v/v＝20:1的比例加入pp酶，轻微搅拌混合均匀，2-8℃进行静置过夜酶切；过滤，取样检测；
13、s36、ni-ff2层析:采用c液平衡、上样、c液复平衡、4％d液洗脱、50％d液洗杂步骤收集样品；
14、s37、q hp层析:平衡：f液平衡1-2cv，e液平衡1-5cv；上样；复平衡2-3cv；0-100％f液，10cv洗脱收集洗脱峰；
15、s8、超滤换液、除菌过滤得到ureb原液。
16、进一步的，所述s1中表达载体为pet-29b(+)，重组工程菌为pet-ureb/bl21。
17、进一步的，所述s2包括以下子步骤：
18、s21、菌种开启：pet29-ureb/bl21种子菌的第四代以1：600v/v的比例接种于三角瓶中，所述三角瓶中有lb培养基，在36.0-38.0℃、200-240rpm、4-8h培养得到一代生产菌种；
19、s22、种子罐培养：一代生产菌种按照0.5-2.0％，v/v的接种量比例接种于种子罐，罐内装lb培养基，在深层通气：10.0-50.0l/分钟、36.0-38.0℃、50～300rpm、ph6.70～7.30培养3.0-8.0h，得到二代生产菌种；
20、s23、发酵罐培养：二代生产菌种按照8％-12％的接种量接种发酵罐，在36.0～38.0℃、深层通气50.0～350.0l/分钟、100～500rpm、ph6.70～7.30培养3.0～7.0小时，菌种扩增结束；
21、s24、诱导培养：温度：29.0～31.0℃；深层通气：50.0～350.0l/分钟；转速：100～500rpm；ph：6.70～7.30；诱导时间4.0小时；
22、s25、离心收集菌体沉淀。
23、进一步的，所述s21、s22、s24结束后取菌液样品做纯菌检查和镜检，细菌为革兰氏阴性杆菌，s21、s22、s23、s25结束后菌液od600值分别为大于1.50、大于1.50、20.00、不超过1.00；所述s23菌液od600在10.00时开始以0.015l/分钟补加甘油，直到诱导结束；所述s24诱导开始时以0.02l/分钟补加含有酵母提取物24.0g/l，胰蛋白胨12.0g/l的培养基。
24、进一步的，所述s32具体为：将重悬的菌体进行剪切均质：2～8℃条件下均质，700-900bar，3次；均质后的液体于12000g离心力下离心30min；收集上清，使用0.6-0.8μm深层滤板进行澄清过滤，再使用0.65μm滤芯进行澄清过滤。
25、进一步的，所述s33中平衡2-3cv；上样；复平衡3-5cv；洗杂：7.5％b，2-5cv；洗脱：30％b，2-5cv；所述a液为50mm tris+0.15m nacl+0.5％tween-80，ph 8.0，所述b液为50mmtris+0.15m nacl+0.5m咪唑+0.5％tween-80，ph 8.0。
26、进一步的，所述c液为50mm tris+0.15m nacl,ph 8.0，所述s36中平衡2-3cv；上样；复平衡2-5cv；洗脱条件：4％d液，20mm咪唑，3-5cv；洗杂：50％ d液，250mm咪唑，1-3cv，所述d液为50mm tris+0.15m nacl+500mm咪唑,ph8.0。
27、进一步的，所述s37中e液为20mm tris+1mm dtt，ph 7.5，f液为20mm tris+0.5ml-arg+1mm dtt；所述s38中超滤换液为用30kd膜包进行超滤浓缩处理三步层析样液，浓缩至原来体积的1/5-1倍，等体积补加g液，连续洗滤5-10个体积，透析结束浓缩样品至三步层析样品液体积的1/2-2倍；所述g液为20mm pb+5mm l-cys·hcl+5％甘露醇，ph 8.0。
28、本发明还提供了一种口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原ureb在预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途。
29、进一步的，所述药物为疫苗。
30、基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
31、(1)本发明提供的重组蛋白抗原ureb，在ureb蛋白上增加了组氨酸(his)和谷胱甘肽转移酶(gst)蛋白，表达为his-gst-ureb融合蛋白，通过纯化后ureb蛋白纯度达到95％，每升发酵液的产率可以获得122mg蛋白。
32、(2)本发明提供的重组蛋白抗原ureb，单独使用ureb时小鼠攻毒保护率30％，ureb+cpg小鼠攻毒保护率60％。
1. 一种口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原，其特征在于，所述抗原为ureb，氨基酸序列如seq id no：1所示，融合蛋白his-gst-ureb的氨基酸序列如seq id no：2所示，融合蛋白his-gst-ureb编码核苷酸序列如seq id no:3所示。
2.根据权利要求1所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
3.根据权利要求2所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，所述s1中表达载体为pet-29b（+），重组工程菌为pet-ureb/bl21。
4.根据权利要求2所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，所述s2包括以下子步骤：
5. 根据权利要求3所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，所述s21、s22、s24结束后取菌液样品做纯菌检查和镜检，细菌为革兰氏阴性杆菌，s21、s22、s23、s25结束后菌液od600值分别为大于1.50、大于1.50、20.00、不超过1.00；所述s23菌液od600在10.00时开始以0.015 l/分钟补加甘油，直到诱导结束；所述s24诱导开始时以0.02 l/分钟补加含有酵母提取物24.0 g/l，胰蛋白胨12.0 g/l的培养基。
6.根据权利要求2所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，所述s32具体为：将重悬的菌体进行剪切均质：2~8℃条件下均质，700-900bar，3次；均质后的液体于12000g离心力下离心30min；收集上清，使用0.6-0.8μm深层滤板进行澄清过滤，再使用0.65μm滤芯进行澄清过滤。
7.根据权利要求2所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，所述s33中平衡2-3cv；上样；复平衡3-5cv；洗杂：7.5%b液，2-5cv；洗脱：30%b液，2-5cv。
8. 根据权利要求2所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，所述s36中平衡2-3cv；上样；复平衡2-5cv；洗脱条件：4%d液，20mm咪唑，3-5cv；洗杂：50%d液，250mm咪唑，1-3cv。
9. 根据权利要求2所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原的制备方法，其特征在于，所述s38中超滤换液为用30kd膜包进行超滤浓缩处理三步层析样液，浓缩至原来体积的1/5-1倍，等体积补加g液，连续洗滤5-10个体积，透析结束浓缩样品至三步层析样品液体积的1/2-2倍；所述g液为20mm pb+ 5mm l-cys·hcl + 5%甘露醇，ph 8.0。
10.根据权利要求1所述的口服幽门螺杆菌疫苗重组蛋白抗原在制备预防或治疗幽门螺杆菌感染药物中的用途。
