本发明涉及病原体核酸检测，尤其是涉及一种脱脚病病毒和小鼠腺病毒假病毒、制备方法及其应用。
背景技术：
1、单克隆抗体药物是生物医药重要领域，目前在肿瘤、自身免疫疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病的治疗均有应用。鼠源单克隆抗体作为单克隆抗体技术中重要的一部分，目前也有多种鼠源和人鼠嵌合单抗在使用。但是鼠源单克隆抗体制品会有潜在的鼠源病毒污染风险，主要有以下几种病毒影响较大。
2、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，lcmv)，会引起人和多种动物患病，人感染后主要表现为流感样症状和脑膜炎，在自然条件下该病毒仅感染啮齿类动物中的小鼠科和仓鼠科动物。汉坦病毒(hanta virus，hv)，会引起流行性出血热，又称出血热病毒(viral hemorrhagic fevers，vhfs)，病发症状为短期发热，热退后相继发生休克、肾功能衰竭和严重出血倾向等危险症候群，鼠为主要传染源，可通过呼吸道消化道等多种途径传播。鼠痘病毒，以四肢、尾和头部肿胀、溃烂、坏死甚至脚趾脱落为特征，故又称脱脚病病毒(ectromelia virus，ev)，主要通过接触病鼠的渗出物、分泌物及其污染的物品传播。仙台病毒(sendai virus，sev)，主要感染啮齿类动物，引起动物的呼吸系统类疾病，是一种具有血凝性和细胞融合性的呼吸道疾病。小鼠肺炎病毒(pneumoniavirus of mice，pvm)，会导致间质性肺炎和急性非化脓性多病灶血管炎，通过气溶胶和接触呼吸道分泌物在啮齿类动物间进行传播。小鼠腺病毒((murine adenoviruses，madv)，在小鼠中多呈隐性感染，但也可引起致死性疾病，主要经粪便和尿液接触传播。鼠白血病病毒(murine leukemia virus，mulv)，可以在老鼠中引起白血病，一些mulv可能会感染其他脊椎动物。
3、常见的鼠源病毒检测方法多为基于动物感染的抗体产生试验或是elisa的方法，主要针对病毒的抗原部分，当病毒载量过低时，检出率低。而基于荧光定量pcr的分子检测方法时检测病毒的核酸，即使病毒载量极低，也有较好的检出率。
4、假病毒是一种重组病毒，它的基因通常被改变或修饰，具有与目标病毒相似的物理结构和特异性核酸序列的病毒样粒子，其分析特性与真实病毒相似，但不具备自我复制和感染的能力，能够参与到病毒检测从提取到扩增的全过程。假病毒具有生物安全性的同时可作为测量标准，可用于病毒核酸定性和定量测量方法的验证评价以及实验室的质量控制。
5、根据《中国药典》四部，鼠源性病毒检查法，鼠源性单克隆抗体制品具有潜在病毒污染，如出血热病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒、ⅲ型呼肠孤病毒、仙台病毒、脱脚病病毒、小鼠腺病毒、小鼠肺炎病毒、逆转录病毒等。其中前4种病毒属i组，为能够感染人与灵长类动物的病毒；后4种属ⅱ组，为目前尚无迹象表明感染人的病毒，但能在体外培养的人、猿和猴源性细胞中进行复制，对人类具有潜在危险性，这些病毒应作为重点进行检测。《中国药典》三部“生物制品通则”的“生物制品生产用动物细胞基质制备及质量控制”的公示稿，种属特异性外源病毒因子的检测中，鼠源的细胞系，可采用小鼠、大鼠和仓鼠抗体产生试验(map、rap及hap)或经验证的分子生物学方法检测其种属特异性病毒，增加了可使用分子生物学的方法。相比于动物试验，分子生物学方法具有灵敏度高、速度快、成本低等优势。
6、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明针对现有技术的ev/madv病毒的qpcr检测方法中缺少阳性对照病毒的不足，提供一种可替代ev/madv病毒的假病毒的构建方法，及其qpcr检测领域的应用。
2、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
3、本发明提供了一种ev/madv假病毒，所述假病毒内含有如下独立的ev病毒和madv病毒的保守基因扩增序列；包括，
4、ev病毒保守基因扩增序列，如seq id no.1所示；
5、madv病毒保守基因扩增序列，如seq id no.3所示。
6、进一步的，所述假病毒内含有如下独立的ev病毒和madv病毒的保守基因序列；包括，
7、ev病毒保守基因序列，如seq id no.2所示；
8、madv病毒保守基因序列，如seq id no.4所示。
9、进一步的，所述独立的ev病毒和madv病毒的保守基因序列为融合基因。
10、进一步的，在所述融合基因的3’和5’端插入不小于6bp的额外碱基序列。
11、进一步的，使用腺相关病毒载体骨架，优选为paav-gfp。
12、进一步的，所述插入位置为腺相关病毒载体的saci至hindiii序列之间。
13、进一步的，所述假病毒包括如seq id no.5所示的序列。
14、本发明还提供了上述的ev/madv假病毒的制备方法，包括将上述的假病毒质粒转染到工程细胞中，培养所述工程细胞后，收集细胞裂解上清，得到所述ev/madv假病毒。
15、本发明还提供了上述的ev/madv假病毒或采用上述的制备方法制备得到的ev/madv假病毒在制备诊断脱脚病病毒和小鼠腺病毒的阳性对照品中应用。
16、此外，本发明还提供了诊断脱脚病病毒和小鼠腺病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述的ev/madv假病毒或采用上述的制备方法制备得到的ev/madv假病毒。
17、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
18、本发明的ev/madv假病毒能够检测样本中两种药典规定必须检查的鼠源dna病毒核酸序列，覆盖药典规定中两种dna病毒的所有序列。同时，本发明的多重鼠源dna假病毒在qpcr检测的实际应用可用于鼠源病毒dna在实验动物模型中的定量分析，也适用于生物制品生产用动物细胞基质及检定用动物细胞进行鼠源病毒因子检查，对于生物制品的安全性具有重要作用。
1.一种ev/madv假病毒，其特征在于，所述假病毒内含有如下独立的ev病毒和madv病毒的保守基因扩增序列；包括，
2.根据权利要求1所述的ev/madv假病毒，其特征在于，所述假病毒内含有如下独立的ev病毒和madv病毒的保守基因序列；包括，
3.根据权利要求2所述的ev/madv假病毒，其特征在于，所述独立的ev病毒和madv病毒的保守基因序列为融合基因。
4.根据权利要求3所述的ev/madv假病毒，其特征在于，在所述融合基因的3’和5’端插入不小于6bp的额外碱基序列。
5.根据权利要求4所述的ev/madv假病毒，其特征在于，使用腺相关病毒载体骨架，优选为paav-gfp。
6.根据权利要求5所述的ev/madv假病毒，其特征在于，所述插入位置为腺相关病毒载体的saci至hindiii序列之间。
7.根据权利要求1～6任一项所述的ev/madv假病毒，其特征在于，所述假病毒包括如seq id no.5所示的序列。
8.权利要求1～7任一项所述的ev/madv假病毒的制备方法，其特征在于，包括将权利要求1～7任一项所述的假病毒质粒转染到工程细胞中，培养所述工程细胞后，收集细胞裂解上清，得到所述ev/madv假病毒。
9.权利要求1～7任一项所述的ev/madv假病毒或采用权利要求8所述的制备方法制备得到的ev/madv假病毒在制备诊断脱脚病病毒和小鼠腺病毒的阳性对照品中应用。
10.诊断脱脚病病毒和小鼠腺病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～7任一项所述的ev/madv假病毒或采用权利要求8所述的制备方法制备得到的ev/madv假病毒。
