本发明属于合成生物，公开合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸重组菌、重组菌构建方法以及生产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中的应用。
背景技术：
1、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad+，辅酶ⅰ)是维生素b3的衍生物，存在于所有细胞中作为脱氢酶辅酶介导包括线粒体功能、能量代谢、细胞衰老和死亡等上千种生物催化过程。nad+还作为生物活性蛋白的共底物，通过修饰翻译后蛋白和修复损伤dna调控细胞周期，对延缓细胞衰老和维持机体正常功能具有重要的生物学意义。
2、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的化学合成法以烟酰胺单核苷酸(nmn)和腺嘌呤核糖核苷酸(amp)或它们的衍生物为原料偶联形成nad+，在磷酸根末端加上两个高能磷酸键，上述化学合成方法中采用的大量有机溶剂造成环保压力，同时副产物多且杂以及复杂工艺的低提纯收率造成nad+生产成本居高不下，限制其工业化生产应用。随着nad+生物合成途径的深入研究及其相关合成酶的解析，通过合成生物技术及代谢工程改造进行生物合成nad+成为研究热点。公开号为cn 116144719 a公开了一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的制备方法，利用粗酶液以nmn和1.25摩尔比的atp为底物合成nad+，8小时产量达到35.5g/l，摩尔转化率为97.64％；公开号为cn 105755019 a公开了一种烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶基因及其应用，以nmn和atp为底物通过精制酶粉合成nad+，2小时产量达到66g/l，摩尔转化率为99％。虽然以nmn和atp为底物的产量和转化率高且反应速率快，但物料成本高昂且atp底物不稳定，工业化推广难度高。因而，开发廉价原料的合成路线成为热点。现有技术中大多采用六偏磷酸钠和atp为共底物降低物料成本；公开号为cn 111154821 a公开了一种酶法制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，以六偏磷酸钠和atp为共底物，利用固定化酶转化腺苷和烟酰胺合成nad+，10小时产量达到39g/l，腺苷摩尔转化率95％；公开号为cn 117431284 a公开了一种合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法、突变体及其应用，也是以六偏磷酸钠和atp为共底物，利用无细胞提取液两步法转化核糖和烟酰胺合成nad+，虽然摩尔转化率达到95％，但产量只有13.4g/l。综上所述，现有的生物合成法无法同时实现高产量、高合成速率以及低物料成本，不利于大规模工业化生产应用。
3、因此，急需开发一种廉价原料合成路线，实现低成本、高转化率和合成速率的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸大规模工业化生产方法，满足急剧增长的市场需求。
技术实现思路
1、为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌及其构建方法，并将重组菌应用在nad+的生产中，使其以腺苷(ar)和烟酰胺核糖(nr)为底物合成nad+时，仅需添加六偏磷酸钠和5％摩尔比的单磷酸腺苷(amp)为磷酸供体，就能获得高浓度的nad+，实现nad+的高产量和ar/nr的高转化率，且该工艺所需原料性质稳定且成本低廉、生产周期短，易于产业化，极具市场竞争力。
2、本发明的技术方案如下：
3、本发明目的之一在于提供合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌，所述重组菌包括重组菌a和重组菌b组合使用的复合菌；所述重组菌a能够表达烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶编码基因，重组菌a能够在atp共底物条件下催化nr形成nad+；所述重组菌b能够表达腺苷激酶和多聚磷酸激酶编码基因，重组菌b能够在六偏磷酸钠和amp共底物条件下催化ar形成atp。
4、进一步地，所述烟酰胺核糖激酶(nrk)来源于乳酸克鲁维酵母，编码基因为a11-a13中的任一种dna分子：
5、a11、其核苷酸序列是seq id no.1所示的cdna分子或基因组dna；
6、a12、在严格条件下与a11限定的dna分子杂交且编码所述烟酰胺核糖激酶的cdna分子或基因组dna；
7、a13、与a11或a12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述烟酰胺核糖激酶的cdna分子或基因组dna。
8、所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶(nmnat)来源于沃氏甲烷球菌，编码基因为b11-b13中的任一种dna分子：
9、b11、其核苷酸序列是seq id no.2所示的cdna分子或基因组dna；
10、b12、在严格条件下与b11限定的dna分子杂交且编码所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的cdna分子或基因组dna；
11、b13、与b11或b12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的cdna分子或基因组dna。
12、所述焦磷酸水解酶(ippa)来源于劳恩甲烷暖球菌，编码基因为c11-c13中的任一种dna分子：
13、c11、其核苷酸序列是seq id no.3所示的cdna分子或基因组dna；
14、c12、在严格条件下与c11限定的dna分子杂交且编码所述焦磷酸水解酶的cdna分子或基因组dna；
15、c13、与c11或c12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述焦磷酸水解酶的cdna分子或基因组dna。
16、进一步地，所述腺苷激酶(adk)来源于库德里阿兹威酵母，编码基因为d11-d13中的任一种dna分子：
17、d11、其核苷酸序列是seq id no.4的cdna分子或基因组dna；
18、d12、在严格条件下与d11限定的dna分子杂交且编码所述腺苷激酶的cdna分子或基因组dna；
19、d13、与d11或d12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述腺苷激酶的cdna分子或基因组dna。
20、所述多聚磷酸激酶(ppk2)来源于丹毒丝菌，编码基因为e11-e13中的任一种dna分子：
21、e11、其核苷酸序列是seq id no.5的cdna分子或基因组dna；
22、e12、在严格条件下与e11限定的dna分子杂交且编码所述多聚磷酸激酶的cdna分子或基因组dna；
23、e13、与e11或e12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述多聚磷酸激酶的cdna分子或基因组dna。
24、其中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性；所使用的术语“同一性”是指当使用核苷酸或氨基酸残基序列比较算法或通过目视检查测量，以最大的对应性进行比较和比对时，它们是相同的或具有相同序列特定百分比数。也就是说，核苷酸或者氨基酸序列的同一性可以利用下述比例来定义，该比例是将两个或多个核苷酸或氨基酸序列按照一致的核苷酸或氨基酸数达到最大的方式，并根据需要加入空位来进行比对时一致的核苷酸数或氨基酸数，在比对部分的全部核苷酸或氨基酸数中的比例。
25、进一步地，所述重组菌a和重组菌b均由受体菌经基因改造获得，所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。
26、进一步地，所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述f1、g1或g2基因改造得到的野生型大肠杆菌的突变株：
27、f1、将嘌呤核苷磷酸化酶基因deod敲除或截短，该改造以“δdeod”表示；
28、g1、将amp核苷酶基因amn敲除或截短，该改造以“δamn”表示；
29、g2、将嘧啶核糖核苷水解酶基因rihc敲除或截短，该改造以“δrihc”表示；
30、所述嘌呤核苷磷酸化酶基因deod编码氨基酸序列seq id no.6所示的蛋白质，所述嘌呤核苷磷酸化酶基因deod核苷酸序列如seq id no.7所示。
31、所述amp核苷酶基因amn编码氨基酸序列seq id no.8所示的蛋白质；所述amp核苷酶基因amn核苷酸序列如seq id no.9所示。
32、所述嘧啶核糖核苷水解酶基因rihc编码氨基酸序列seq id no.10所示的蛋白质；所述嘧啶核糖核苷水解酶基因rihc核苷酸序列如seq id no.11所示。
33、进一步地，所述突变型大肠杆菌优选为对野生型大肠杆菌在进行f1基因改造的前提下再进行g1或/和g2基因改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变株。
34、本发明中，所述突变型大肠杆菌h1为对野生型大肠杆菌进行上述f1、g1和g2改造得到野生型大肠杆菌的突变株；具体可为将大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶基因deod、amp核苷酶基因amn和嘧啶核糖核苷水解酶基因rihc敲除或截短得到的大肠杆菌突变株；
35、所述突变型大肠杆菌h2为对野生型大肠杆菌进行上述f1和g1改造得到野生型大肠杆菌的突变株；具体可为将大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶基因deod和amp核苷酶基因amn敲除或截短得到的大肠杆菌突变株；
36、所述突变型大肠杆菌h3为对野生型大肠杆菌进行上述f1和g2改造得到野生型大肠杆菌的突变株；具体可为将大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶基因deod和嘧啶核糖核苷水解酶基因rihc敲除或截短得到的大肠杆菌突变株；
37、所述突变型大肠杆菌h4为对野生型大肠杆菌进行上述f1改造得到野生型大肠杆菌的突变株；具体可为将大肠杆菌的嘌呤核苷磷酸化酶基因deod敲除或截短得到的大肠杆菌突变株；
38、所述突变型大肠杆菌h5为对野生型大肠杆菌进行上述g1改造得到野生型大肠杆菌的突变株；具体可为将大肠杆菌的amp核苷酶基因amn敲除或截短得到的大肠杆菌突变株；
39、所述突变型大肠杆菌h6为对野生型大肠杆菌进行上述g2改造得到野生型大肠杆菌的突变株；具体可为将大肠杆菌的嘧啶核糖核苷水解酶基因rihc敲除或截短得到的大肠杆菌突变株；
40、其中，上述方法中嘌呤核苷磷酸化酶基因、amp核苷酶基因和嘧啶核糖核苷水解酶基因的敲除或截短均可通过同源重组实现。
41、本发明的目的之二在于提供合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸重组菌的构建方法，将烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶的编码基因通过重组载体a导入受体菌构建用于产烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌a；将腺苷激酶和多聚磷酸激酶的编码基因通过重组载体b导入受体菌构建用于产三磷酸腺苷的重组菌b，将重组菌a和重组菌b复合从而获得所述用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌；重组载体a含有烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶的编码基因；所述重组载体b含有腺苷激酶和多聚磷酸激酶的编码基因；
42、进一步地，所述重组载体a中启动烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶编码基因转录以及重组载体b中启动腺苷激酶和多聚磷酸激酶编码基因转录的启动子均是ara启动子；所述重组载体a中终止烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶基因转录以及重组载体b中终止腺苷激酶和多聚磷酸激酶基因转录的终止子均是rrnb终止子。
43、其中，所述重组载体a是通过将核苷酸序列为seq id no.2的dna分子替换载体pbad/myc-hisb的ncoi和xhoi识别位点间的片段、核苷酸序列为seq id no.1的dna分子替换载体pbad/myc-hisb的ecori和hindⅲ识别位点间的片段和核苷酸序列为seq id no.3的dna分子替换载体pbad/myc-hisb的bglii和psti识别位点间的片段得到的；所述重组载体b是通过将核苷酸序列为seq id no.4的dna分子替换载体pbad/myc-hisb的bglii和psti识别位点间的片段和核苷酸序列为seq id no.5的分子替换载体pbad/myc-hisb的ncoi和xhoi识别位点间的片段得到的。
44、本发明的目的之三在于提供将上述重组菌或者根据上述构建方法制得的重组菌应用在合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中。
45、本发明的目的之四在于提供一种合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，包括如下步骤：
46、(1)将上述重组菌a和重组菌b，或者按照上述方法构建重组菌a和重组菌b，经过阿拉伯糖诱导培养后得到诱导重组菌，低温离心收集重组菌；
47、(2)将步骤(1)中获得的两种重组菌重悬于平衡缓冲液中并进行高压均质破碎，然后加入烟酰胺核糖、腺苷、六偏磷酸钠和单磷酸腺苷进行酶反应，催化合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，得到转化液，具体如图1所示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的代谢合成途径；
48、所述平衡缓冲液中含有50-100mm mg2+，具体可为mgcl2或mgso4，优选为60mmmgcl2。
49、(4)转化液经离心除细胞碎片、膜过滤去除蛋白多肽、离子树脂纯化、纳滤浓缩、乙醇结晶、真空干燥等后处理后得到高纯度的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
50、相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
51、1、本发明构建了新型的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸高产重组菌，包括能够表达烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶编码基因的重组菌a，能够表达腺苷激酶和多聚磷酸激酶编码基因的重组菌b，本发明提供的复合菌直接以烟酰胺核糖和腺苷为底物，原料成本更为低廉且容易获得；通过将烟酰胺核糖合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的相关基因、焦磷酸降解基因以及三磷酸腺苷循环再生相关基因通过重组载体分别导入到突变型大肠杆菌中构建形成重组菌，重组菌能够在不干扰菌体生长的前提下最大限度弱化腺苷和烟酰胺核糖的分支途径，有效地提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的产量和高浓度烟酰胺核糖和腺苷的摩尔转化率。
52、2、本发明解决了多酶级联催化存在的合成速率、摩尔转化率及底物浓度低的问题，根据5个酶的可溶性表达量和比酶活力，使用pbad/myc质粒对其进行了分组串联表达，优化表达量及组合配比，重组菌组合简化为2株，在250mm底物浓度条件下，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸对烟酰胺核糖和腺苷的摩尔转化率≥96％，平均合成速率达到32.95mm/h。
53、3、本发明中将重组菌a和重组菌b的组合用于制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，重组菌经过阿拉伯糖诱导培养后得到诱导重组菌，诱导表达的重组菌以烟酰胺核糖、腺苷和六偏磷酸钠为原料，生物转化制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，转化6h后，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的产量达到130g/l以上，便于下游结晶精制，产品纯度和含量均在99.5％以上。利用本发明提供的重组菌组合制备烟酰胺腺嘌呤二核苷酸具有工艺简便、合成效率高且生产成本低的优势，具有良好的工业化应用前景。
1.合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌，其特征在于：所述重组菌包括重组菌a和重组菌b组合使用的复合菌；所述重组菌a表达烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶的编码基因，重组菌a在atp共底物条件下催化nr形成nad+；所述重组菌b表达腺苷激酶和多聚磷酸激酶的编码基因，重组菌b在六偏磷酸钠和amp共底物条件下催化ar形成atp。
2.根据权利要求1所述的合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌，其特征在于：所述烟酰胺核糖激酶来源于乳酸克鲁维酵母，编码基因为a11-a13中的任一种dna分子：
3.根据权利要求1所述的合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌，其特征在于：所述腺苷激酶来源于库德里阿兹威酵母，编码基因为d11-d13中的任一种dna分子：
4.根据权利要求1所述的合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌，其特征在于：所述重组菌a和重组菌b均由受体菌经基因改造获得，所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌。
5.根据权利要求4所述的合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌，其特征在于：所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述f1、g1或g2基因改造得到的野生型大肠杆菌的突变株：
6.根据权利要求5所述的合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌，其特征在于：所述突变型大肠杆菌优选为对野生型大肠杆菌在进行f1基因改造的前提下再进行g1或/和g2基因改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变株。
7.合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸重组菌的构建方法，其特征在于：如权利要求1所述重组菌a的构建是通过将烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶的编码基因通过重组载体a导入受体菌种；所述重组菌b的构建是通过将腺苷激酶和多聚磷酸激酶的编码基因通过重组载体b导入受体菌中，将重组菌a和重组菌b复合从而获得所述合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的重组菌；
8.根据权利要求7所述合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸重组菌的构建方法，其特征在于：所述重组载体a中启动烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶编码基因转录以及重组载体b中启动腺苷激酶和多聚磷酸激酶编码基因转录的启动子均是ara启动子；所述重组载体a中终止烟酰胺核糖激酶、烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶和焦磷酸水解酶基因转录以及重组载体b中终止腺苷激酶和多聚磷酸激酶基因转录的终止子均是rrnb终止子。
9.根据权利要求1至6任一所述重组菌或根据权利要求7至8构建方法制得的重组菌应用在合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸中。
10.一种合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
