本发明涉及一种聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体及其在肿瘤治疗中的应用，属于基因工程。
背景技术：
1、原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是常见的恶性肿瘤之一，是一种起源于肝细胞的恶性肿瘤，死亡率高，治疗肿瘤的常用方法是化学疗法，通常在杀死肿瘤细胞的同时对正常细胞造成极大损害。因此急需寻求一种治疗肿瘤的新方法，可特异性治疗肿瘤而不损伤正常细胞。hcc 细胞被证实由于缺少 ass 而不能自身合成精氨酸，需要从外界环境中摄取精氨酸用于生长和增殖，所以可以利用这个特性使用精氨酸降解酶降解内环境中的精氨酸从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。精氨酸脱亚胺酶(argininedeiminase，adi，ec3.5.3.6)能将l-精氨酸不可逆地水解为l-瓜氨酸和氨，是一种治疗精氨酸营养缺陷型癌症的蛋白质药物。
2、但对于临床应用而言，将微生物来源的adi直接应用于人体会产生中和抗体，造成半衰期短、活性下将及免疫反应等不良后果。聚乙二醇(peg)是一种生物相溶性极好的高分子聚合物，具有中性无毒的特点和高度的亲水性。peg 是极少数经过 fda 批准的可以作为体内注射药物的合成聚合物之一。当peg修饰剂偶联到蛋白质分子或药物表面时，可以在其药物周围产生空间屏障作用，降低药物的免疫降解和酶解作用，延长药物的循环半衰期，降低药物在肾脏中的代谢速率，同时降低免疫原性。因此，研究人员采用聚乙二醇(peg)对来源于支原体的 adi 进行化学修饰，修饰后的分子很好地保持了酶的活性，同时封闭了抗原表位，中和抗体产生的水平也显著下降。
3、但是，在采用聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶时，由于同时含有多个peg，在adi-peg储存、运输过程中容易出现形成高聚体、酶活性降低、解聚、peg脱落等影响药效的因素。通常研究人员会从制剂的角度，通过配置保护剂、筛选合适的缓冲液等，以达到提高稳定性的效果，但是该方法并不能较好的解决该问题，受到条件的影响较大。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明精氨酸脱亚胺酶为出发酶，采用基因工程对精氨酸脱亚胺酶的酶学性质进行改造，结合聚乙二醇修饰，制备得到一种受条件影响较小的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶。
2、本发明的目的是提供一种聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体，所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体是采用聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶突变体，其中，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的精氨酸脱亚胺酶的第70位异亮氨酸突变为赖氨酸，第208位赖氨酸突变为精氨酸，第258位组氨酸突变为赖氨酸，并将第318位亮氨酸突变为苯丙氨酸；或所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的精氨酸脱亚胺酶的第70位异亮氨酸突变为赖氨酸，第84位谷氨酸突变为赖氨酸，第208位赖氨酸突变为精氨酸，第258位组氨酸突变为赖氨酸，并将第318位亮氨酸突变为苯丙氨酸。
3、进一步地，所述聚乙二醇的分子量为5~40k。
4、进一步地，在聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶突变体时，聚乙二醇与精氨酸脱亚胺酶突变体的质量比为10~30:1。
5、本发明的第二个目的是提供一种编码所述精氨酸脱亚胺酶突变体的核苷酸序列。
6、本发明的第三个目的是提供一种携带所述核苷酸序列的表达载体。
7、本发明的第四个目的是提供一种表达所述精氨酸脱亚胺酶突变体的重组菌。
8、本发明的第五个目的是提供所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
9、进一步地，所述肿瘤为肝癌或黑色素瘤。
10、有益效果
11、本发明提供的聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体，在不同ph条件下，peg不易脱落，且均能保持相对较为稳定的活性，尤其是i70k/k208r/ h258k/ l318f在peg修饰时，对酶活的影响较小，还能保持较高的酶活和稳定性。
1.一种聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体是采用聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶突变体，其中，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的精氨酸脱亚胺酶的第70位异亮氨酸突变为赖氨酸，第208位赖氨酸突变为精氨酸，第258位组氨酸突变为赖氨酸，并将第318位亮氨酸突变为苯丙氨酸；或所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的精氨酸脱亚胺酶的第70位异亮氨酸突变为赖氨酸，第84位谷氨酸突变为赖氨酸，第208位赖氨酸突变为精氨酸，第258位组氨酸突变为赖氨酸，并将第318位亮氨酸突变为苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为5~40k。
3.根据权利要求1所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，在聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶突变体时，聚乙二醇与精氨酸脱亚胺酶突变体的质量比为10~30:1。
4.一种编码权利要求1所述精氨酸脱亚胺酶突变体的核苷酸序列。
5.一种携带权利要求4所述核苷酸序列的表达载体。
6.一种表达权利要求1所述精氨酸脱亚胺酶突变体的重组菌。
7.权利要求1所述聚乙二醇化精氨酸脱亚胺酶突变体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌或黑色素瘤。
