本发明属于生物工程领域，涉及fc-lamp2b-rbd融合蛋白及其制备方法和其应用。
背景技术：
1、
2、开发粘膜疫苗显得尤为重要，粘膜疫苗可激活呼吸道粘膜反应，在粘膜部位产生iga和trm，可诱导机体免疫将病毒消灭在粘膜部位，或可实现阻断病毒的传播，最终达到终结疫情大流行的目的。然而，呼吸道非侵入式的接种方式使抗原递送变得尤为困难，简单将注射式疫苗改为肺部接种缺乏可行性。目前为止，仅有一款鼻内疫苗和一款病毒载体吸入疫苗获批，尚未有非病毒载体吸入式疫苗上市。但上述文献公开的疫苗治疗效果不佳，临床继续更高效、更高全的吸入式疫苗。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种fc-lamp2b-rbd融合蛋白，所述融合蛋白包括与seqid no.1的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％、仍更优选至少99％、更优选100％的氨基酸序列同一性。
2、本发明优选的技术方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为如seq id no.1所示。
3、本发明的另一目的在于提供一种编码本发明所述融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸。
4、本发明优选的技术方案中，所述核苷酸包括与seq id no.2的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％、仍更优选至少99％、更优选100％的核苷酸序列同一性。
5、本发明优选的技术方案中，所述核苷酸序列为如seq id no.2。
6、本发明的另一目的在于提供一种含有本发明所述核苷酸的载体。
7、本发明优选的技术方案中，插入核苷酸前的载体为pcdna3.1。
8、本发明优选的技术方案中，所述载体为重组质粒fc-lamp2b-rbd，氨基酸序列：seqid no.1。
9、本发明的另一目的在于提供一种重组质粒fc-lamp2b-rbd的制备方法，包括如下步骤：将fc段碱基序列，通过酶切连接的方式加载于载体上，再选择lamp2b序列、rbd序列，在各序列之间加入柔性linker序列，即得。
10、本发明优选的技术方案中，所述fc段碱基序列为genbank:ky053479.1。
11、本发明优选的技术方案中，所述rbd序列为r319-f541 genbank:op912878.1。
12、本发明优选的技术方案中，所述lamp2b序列为genbank:ak304405.1。
13、本发明优选的技术方案中，所述柔性linker的序列如seq id no.3所示。
14、本发明优选的技术方案中，所述质粒载体为pcdna3.1。
15、本发明的目的在于提供一种lamp2b-rbd融合蛋白，所述融合蛋白包括与seq idno.8的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％、仍更优选至少99％、更优选100％的氨基酸序列同一性。
16、本发明优选的技术方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列为如seq id no.4所示。
17、本发明的另一目的在于提供一种编码本发明所述融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸。
18、本发明优选的技术方案中，所述核苷酸包括与seq id no.9的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％、仍更优选至少99％、更优选100％的核苷酸序列同一性。
19、本发明优选的技术方案中，所述核苷酸序列为如seq id no.5。
20、本发明的另一目的在于提供一种含有本发明所述核苷酸的载体。
21、本发明优选的技术方案中，插入核苷酸前的载体为pcdna3.1。
22、本发明优选的技术方案中，所述载体为重组质粒lamp2b-rbd，氨基酸序列：seq idno.4。
23、本发明的另一目的在于提供一种重组质粒lamp2b-rbd的制备方法，包括如下步骤：选择lamp2b序列、rbd序列，在各序列之间加入柔性linker序列，形成lamp2b-rbd重组序列，插入至pcdna3.1质粒载体中，即得。
24、本发明优选的技术方案中，所述rbd序列为r319-f541 genbank:op912878.1。
25、本发明优选的技术方案中，所述lamp2b序列为genbank:ak304405.1。
26、本发明优选的技术方案中，所述柔性linker的序列如seq id no.3所示。
27、本发明优选的技术方案中，所述质粒载体为pcdna3.1。
28、本发明的目的在于提供一种重组外泌体，所述外泌体的制备方法包括如下步骤：
29、(1)将重组质粒转染至dc2.4细胞中，当dc2.4细胞生长密度达到80％-90％时，用pbs冲洗2-3次，加入不含血清和青霉素/链霉素的dmem培养基，48-72小时后，300-500g下离心10-15min，离心收集上清液；1000-2500g下离心10-15min，离心取上清；10000-15000g下离心30-15min离心取上清液；
30、(2)将步骤(1)离心的上清液转入10kda的超滤管，3500-4000rpm下超滤15-20min，收集超滤后的外泌体悬液，150000-200000g下离心90-100min，除去上清，用pbs收集底部提取物，即得。
31、本发明优选的技术方案中，每106个的dc2.4细胞中需要加入1.5-2.0μg/ml质粒。
32、本发明优选的技术方案中，所述pbs重悬时还加入25mm海藻糖收集外泌体。
33、本发明优选的技术方案中，所述重组质粒为重组质粒fc-lamp2b-rbd或重组质粒lamp2b-rbd。
34、本发明优选的技术方案中，所述外泌体粒径为100-200nm，优选为110-150nm。
35、本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，包括本发明所述的融合蛋白、核苷酸、载体、外泌体中的任一种或组合。
36、本发明的优选技术方案中，所述药物组合物还任选地包括药学上可接受的载体。
37、本发明的优选技术方案中，所述药学上可接受载体的用量或其种类根据组合物中有效成分的理化性质和含量、制剂类型、制剂的溶出及生物利用度等因素而定。
38、本发明的优选技术方案中，本发明的药物组合物可为本领域的各种剂型，并可采用本领域的制剂技术制备得到。
39、本发明的优选技术方案中，所述药物组合物选自冻干剂、凝胶剂、鼻喷剂、膏剂、霜剂、乳剂、液体敷料、注射剂、栓剂、口服制剂的任一种。
40、本发明的优选技术方案中，所述药物组合物的给药方式选自涂抹、滚针、微针、按摩、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、穴位注射、腰椎穿刺及口服的任一种或其组合。
41、本发明的另一目的在于提供本发明所述的本发明所述的融合蛋白、核苷酸、载体、外泌体、药物组合物在制备预防冠状病毒疫苗中的应用。
42、本发明的另一目的在于提供包含本发明所述的本发明所述的融合蛋白、核苷酸、载体、外泌体、药物组合物的冠状病毒疫苗。
43、本发明优选的技术方案中，所述疫苗为粘膜疫苗，优选为鼻粘膜疫苗。
44、本发明优选的技术方案中，所述疫苗为吸入式疫苗。
45、除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
46、除非另有说明，本发明采用如下方法测定：
47、(1)透射电子显微镜观察取少量稀释于pbs中的外泌体溶液，各吸取10μl滴加于铜网膜上，室温沉降1min，后用吸水纸小心吸去铜网周边液体后滴加10μl醋酸双氧铀于铜网上进行复染，室温染色10min后放置干燥，采用透射电子显微镜对各组样品形态进行观察，加速电压为80kv。外泌体胶体金标记免疫透射电镜可取工程化外泌体原液200μl，与igg h&l(6nm gold)预吸附的二抗直接在4℃冰箱孵育过夜，10000g超速离心30min后去除未结合抗体，200μlpbs重悬后在电镜下染色并观察。
48、(2)融合蛋白与外泌体表面marker表征
49、对转染不同质粒后的dc2.4细胞或超速离心后的外泌体通过ripa裂解液提取得到总蛋白，使用anti-cd9、anti-cd63、anti-ali和anti-gm130表征外泌体表面marker情况，使用anti-ddddk tag对外泌体或dc2.4细胞进行免疫蛋白质印迹分析。对于提取得到的外泌体，用ripa高效裂解液或dpbs收集外泌体，利用纳米粒径追踪仪中测定外泌体粒子数的方法分析外泌体粒子数情况。参照使用sars-cov-2(2019-ncov)spike rbd elisa kit，并对相应粒子数下的外泌体所包含的rbd蛋白浓度进行检测，最终根据融合蛋白的分子量大小计算每个外泌体上所携带的rbd蛋白个数。
50、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
51、1.本发明通过构建lamp2b-rbd融合蛋白、fc-lamp2b-rbd融合蛋白，得到包含lamp2b-rbd融合蛋白、fc-lamp2b-rbd融合蛋白的外泌体，当通过气管给药时，本发明的外泌体能有效诱导黏膜和全身免疫应答，具有良好的稳定性和抗原负载能力。此外，其在肺内的滞留时间延长，分布能力良好，是一种更先进的黏膜递送系统。
52、2.本发明的疫苗采用肺吸方式，相比传统的注射式的疫苗，能够在病毒发病的起始部位就能启到强大的粘膜免疫反应，起效更快，操作简单，有利于工业化生产。
1.一种fc-lamp2b-rbd融合蛋白，所述融合蛋白包括与seq id no.1的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％、仍更优选至少99％、更优选100％的氨基酸序列同一性。
2.一种编码本发明如权利要求1所述的融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸，优选地，所述核苷酸包括与seq id no.2的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％、仍更优选至少99％、更优选100％的核苷酸序列同一性。
3.一种含有如权利要求2所述的核苷酸的载体，优选地所述载体为重组质粒fc-lamp2b-rbd，氨基酸序列：seq id no.1。
4.一种重组质粒fc-lamp2b-rbd的制备方法，包括如下步骤：将fc段碱基序列，通过酶切连接的方式加载于载体上，再选择lamp2b序列、rbd序列，在各序列之间加入柔性linker序列，即得，
5.一种lamp2b-rbd融合蛋白，所述融合蛋白包括与seq id no.4的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％、仍更优选至少99％、更优选100％的氨基酸序列同一性。
6.一种编码本发明如权利要求5所述的融合蛋白的氨基酸序列的核苷酸，优选地，所述核苷酸包括与seq id no.5的至少85％、优选至少90％、更优选至少95％、甚至更优选至少98％、仍更优选至少99％、更优选100％的核苷酸序列同一性。
7.含有如权利要求6所述的所述核苷酸的载体，优选地，所述载体为重组质粒lamp2b-rbd，氨基酸序列：seq id no.4。
8.一种重组质粒lamp2b-rbd的制备方法，包括如下步骤：选择lamp2b序列、rbd序列，在各序列之间加入柔性linker序列，形成lamp2b-rbd重组序列，插入至pcdna3.1质粒载体中，即得。
9.一种重组外泌体，所述外泌体的制备方法包括如下步骤：
10.如权利要求1和5所述的融合蛋白、如权利要求2和6所述的核苷酸、如权利要求3和7所述的载体、如权利要求9所述的外泌体在制备预防冠状病毒疫苗中的应用。
