本发明属于药物合成，涉及一种多功能甾体羟化酶及其应用。
背景技术：
1、甾体药物是仅次于抗生素的第二大类药物，被誉为“生命的钥匙”，具有多种重要的生物活性。甾体类化合物在结构上有很大的不同，包括植物甾醇(也称固醇)、性激素、胆汁酸、c21甾类、强心苷、蟾毒配基、昆虫激素、甾体生物碱等，在维持生命活力、抗癌、抗肿瘤、抗炎和免疫调节等方面发挥重要作用。例如，胆固醇是细胞膜的重要组成部分，是维持生命的重要组成部分；甾体激素能调节性功能、影响神经系统疾病受体、治疗骨质疏松；蟾蜍内酯类化合物具有强心、抗肿瘤、免疫调节作用等生理作用。
2、甾体化合物广泛存在于动植物、真菌及个别细菌体内，其基本骨架是由17个碳原子组成的环戊烷骈多氢菲结构，结构复杂、构型精巧，很难通过化学全合成来生产，当前主要以天然甾体皂素或甾醇为原料，通过化学与生物转化相结合的半合成法获得。甾体化合物结构的微小变化会严重影响它们的生物活性，对甾体药物进行结构修饰，在甾体母核上引入不同位置或不同构型的羟基是决定甾体衍生物药效的关键。甾体化合物的羟基化可能会导致生物活性、溶解性、吸收和作用时间等物理化学和药学性质发生深刻变化，是甾体功能化的最重要反应之一。因此，对甾体化合物进行结构修饰，从而获得活性更好的化合物是甾体化合物研究的热点。甾体母核或侧链上的羟基化是甾体功能化反应中最重要的反应，羟基化后的甾体衍生物作为重要的药用中间体有着巨大的市场需求。
3、由于甾体结构的复杂性，用传统的化学方法合成高氧化态骨架的甾体类药物，特别是氧化不活泼的c-h键，对于化学合成来说仍然是一项非常具有挑战性的任务，目前甾体化合物的羟基化衍生物主要是通过微生物转化和酶催化甾体底物获得，例如，cn114196641a公开了一种甾体c14α羟化酶、表达载体和工程菌及其应用，通过重组酵母菌突变体甾体转化实验，获得了c14α羟化酶突变体库，其中突变体i111a和v124a对底物黄体酮的转化特异性显著高于基因野生型菌株，但是所述方法获得的羟化酶催化羟基化的位置单一，功能性差。
4、综上所述，目前甾体羟化酶存在区域选择性差，难以实现某些特定区域高效专一羟基化等问题。如何提供一种多功能甾体羟化酶，实现甾体骨架特定区域的高选择性氧化，已成为目前药物合成技术领域亟待解决的问题之一。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明挖掘到了一种来源于中华大蟾蜍(bufobufo gargarizans cantor)的多功能甾体羟化酶、表达多功能甾体羟化酶的重组酵母工程菌及利用重组酵母工程菌制备不同位置羟化的甾体化合物的方法，本发明解决了部分甾体化合物在甾体骨架特定位置氧化困难的技术问题。
2、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供了一种多功能甾体羟化酶，所述多功能甾体羟化酶的氨基酸序列包括：
4、(1)如seq id no.1所示的氨基酸序列，或，
5、(2)由(1)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且功能相同或相似的氨基酸序列，或，
6、(3)与(1)或(2)所述的氨基酸序列具有至少80％序列同源性，且功能相同或相似的氨基酸序列，或，
7、(4)在(1)、(2)或(3)中所述的任一氨基酸序列的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白的氨基酸序列。
8、本发明挖掘到了一种来源于中华大蟾蜍(bufo bufo gargarizans cantor)的新型多功能甾体羟化酶，将其命名为cyp7462，构建了重组表达载体ppicza-duet-cyp7462-cprcs，以毕赤酵母km71h为表达宿主，实现多功能甾体羟化酶的异源表达，且成功实现了对不同甾体化合物c6β、c7β、c12α、c14α、c7β、c15α、c15β羟基化的高效转化，为甾体化合物进一步的工业化应用奠定了基础。
9、seq id no.1：
10、mallvpillallasvlgglymlgvfrkrkpneppldkgtipwlgyaldfrrntaeflkkmqkkhgdiftvqiggyyftfvtdplsfgpivkearskldfeqfamelvarvfgyhsgtndhkllekastkhlmgdglvlmtqammenlqnlmlhsvgsgdgekkwqqdglfnysynivfragmlalfgneaaksqgslekakkfdrdhseelfgefrkydklfprlayavlppkdkleaerlkrlfwnmlsikrtlqkdnisgwimeqfqyraengmpehmqdrfmflllwasqgntgpacfwlllylmkhpeameavrgeaervlkengqevkpggalinltrdmllktpildsaveetlrltaapvliravkedlnlkmstgkeyairkgdrvalfpytavqldpevhpepekfkynrflnedgtkkseffkggkrlkyctmpwgagsticpgrffainelkqfvflmfsyfdfelvnpkeeiptidpnrwgfgtmqpthdiqfryrlry。
11、第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子含有第一方面所述的多功能甾体羟化酶的编码序列。
12、优选地，所述核酸分子的核苷酸序列包括经毕赤酵母密码子偏好性优化后如seqid no.2所示的核酸序列。
13、seq id no.2：
14、atggctttgttggttccaatcttgttagctttgttggcttctgtcttgggtggtttgtacatgttgggtgttttcagaaagagaaagcctaacgaacctccattggacaagggtactatcccatggttgggttatgctttggacttcagaagaaacaccgctgaattcttgaagaagatgcagaagaagcacggtgatatcttcactgttcagatcggtggttattacttcactttcgttaccgatccattatctttcggtccaattgttaaggaagctagatccaagttggactttgaacaattcgctatggaattggttgctagagttttcggttaccactctggtactaacgaccacaagttgctggaaaaggcttctactaagcacttgatgggtgatggtttggttttgatgactcaggctatgatggaaaacttgcagaacttgatgttgcactctgttggttctggtgatggtgagaagaagtggcaacaggatggtttgtttaactactcttacaacatcgttttcagagctggtatgttggccttgtttggtaacgaagctgctaagtcccaaggttctttggaaaaggctaagaagttcgacagagaccattctgaagaattgtttggtgaattcagaaagtatgacaagttattcccaagattggcttacgctgtcttgccacctaaggataagttggaagctgaaagattgaagagacttttctggaacatgttgtccatcaagagaacattgcagaaggataatatctctggttggattatggaacagttccaatacagagctgaaaacggtatgccagaacacatgcaagatagattcatgttcttgttgctgtgggcttctcagggtaacactggtccagcttgtttctggttgttgttgtatttgatgaagcacccagaagctatggaagctgttagaggtgaagctgaaagagttttgaaggagaatggtcaagaagttaagccaggtggtgctttgatcaatttgactagagatatgttgttgaagactccaattttggactctgctgttgaagaaactttgagattgactgctgctccagttttgattagagctgttaaggaagacttgaacttgaagatgtctactggtaaggaatacgctatcagaaagggtgacagagttgctttgtttccatacactgctgtgcaactggacccagaagttcacccagaacctgaaaagttcaagtacaacagattcttgaacgaagatggtactaagaagtctgaattcttcaagggtggtaagagattgaagtactgcactatgccatggggtgctggttctactatatgtccaggtagattcttcgctatcaacgaattgaagcaattcgttttcttgatgttctcttacttcgacttcgaattagttaacccaaaggaagaaatccccactatcgacccaaacagatggggtttcggtactatgcaaccaactcacgacatccaattcagatacagattgagatactaa。
15、第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。
16、优选地，所述重组载体的出发载体包括ppicza。
17、优选地，所述重组载体包括细胞色素p450还原酶cprcs的编码序列。
18、优选地，所述细胞色素p450还原酶cprcs的氨基酸序列包括：
19、(1’)如seq id no.3所示的氨基酸序列，或，
20、(2’)由(1’)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且功能相同或相似的氨基酸序列，或，
21、(3’)与(1’)或(2’)所述的氨基酸序列具有至少80％序列同源性，且功能相同或相似的氨基酸序列，或，
22、(4’)在(1’)、(2’)或(3’)中所述的任一氨基酸序列的n端和/或c端连接标签后得到的融合蛋白的氨基酸序列。
23、seq id no.3：
24、madscvnqdechteegssvaeeamfsmadmfllslivglltywfffrkkkeetiefkvqtpvassssressfvekmkktgknivvfygsqtgtgeefanrlakdahrygmrgmsadpeefemvdlgrlkdienslavfcmatygegdptdnaqdfydwlqeadvdlsglkfavfglgnktyehfnamgkyldkrleelgaerifelgmgdddgnleedfitwreqfwpavcehfgveatgdessirqyelvvftdenmnkvytgemgrlksyeiqkppfdaknpflsnvtanrklneggerhlmhlelditgskiryesgdhvavypanessivnklgellgvdldtvislnnldeesnkkhpfpcptsyrtaltyylditnpprtnvlyelaqyatdpkeqenlrkmassssdgkalylnwvlearrnilailedmpslrppldhlcellprlqaryysiassskvhsnsihicavvveyetktgrfnkgvttnwlrnkqptdnghkssvpmyvrksqfrlpfkpttpvimigpgtgiapfvgfiqerewlkqqgkevgetvlyygcrhehedylykeelakfhkdgvltqlhvafsrdqkekvyvqhllkknkeniwklineenghiyvcgdarnmardvhntfydiveeygkmdhsqavdyikklmtkgrysqdvws。
25、第四方面，本发明提供了一种同时表达多功能甾体羟化酶和细胞色素p450还原酶的基因工程菌株，所述基因工程菌株含有第三方面所述的重组载体。
26、优选地，所述基因工程菌株包括毕赤酵母菌株。
27、优选地，所述毕赤酵母菌株包括毕赤酵母km71h菌株。
28、本发明中，重组毕赤酵母工程菌是在毕赤酵母菌株基因组中插入中华大蟾蜍来源的多功能甾体羟化酶基因和细胞色素p450还原酶cprcs基因，所述多功能甾体羟化酶的氨基酸序列如seq id no.1所示，核苷酸序列如seq id no.2所示，所述细胞色素p450还原酶cprcs的氨基酸序列如seq id no.3所示，核苷酸序列如seq id no.4所示。
29、seq id no.4：
30、atggctgattcttgtgttaaccaagatgagtgccatactgaagaaggttcttcagttgctgaagaagcaatgttttctatggcagatatgtttttattgtctttgatcgttggtcttttgacttactggttcttcttcagaaagaagaaggaagagactattgagtttaaagttcaaaccccagttgcatcttcctcttcaagagaatcttcatttgttgaaaagatgaagaagactggtaaaaacatcgttgttttctacggttctcaaacaggtactggtgaagaatttgctaacagattggctaaggatgctcatagatacggtatgagaggtatgtctgctgatccagaagaatttgaaatggttgatttgggtagattgaaggatatcgaaaactctttggctgttttctgcatggctacttacggtgaaggtgaccctactgataacgctcaagatttctatgattggttgcaagaagctgatgttgatttgtctggtctgaagtttgctgtttttggtcttggaaacaagacatacgaacattttaacgctatgggcaaatacttggataagagattggaagaattgggtgccgaaagaatttttgaattgggaatgggagatgatgatggcaacttggaagaagatttcatcacttggagagaacaattttggccagctgtttgcgaacattttggtgttgaagctactggagatgaatccagtatcagacagtatgaattggttgtgttcactgatgaaaatatgaacaaggtttacacaggagaaatgggcagattgaagtcttatgagattcaaaaaccaccatttgatgctaagaacccattcctgtctaatgttactgctaacagaaaacttaacgaaggtggagaaagacatttgatgcatttggaattggatatcactggctcaaaaatcagatacgagtctggagatcatgttgctgtttacccagctaacgaatcttcaatcgttaacaaattgggagaacttctgggagttgacttggacactgtgatttctttgaacaatttggatgaggaatctaacaagaagcatccattcccatgtcctacctcttacagaacagctttaacttattacttggatatcactaatccacctcgtactaatgttttgtacgagttggcccaatacgctactgatccaaaggaacaagagaatttgagaaaaatggcttcttcatcatctgatggcaaggcattgtatctgaattgggttttggaagctagaagaaatatcctggccattttggaagatatgccatctttgagaccaccacttgatcatttgtgtgagttattgccacgtttgcaggcccgttactactcaattgcttcttcttcaaaggttcattctaattctatccatatctgcgctgttgtagttgaatacgagactaagactggacgattcaacaagggtgttacaactaactggttgagaaacaaacagccaactgacaatgggcataagtcatctgttccaatgtacgttagaaaatctcaattcagattgccattcaaaccaactactccagttatcatgattgggcctggcactggtattgccccatttgtgggattcatccaagagagagagtggttgaagcaacaaggtaaggaagttggagagactgtcctgtattacggctgcagacatgaacatgaagattacttgtacaaggaagaattggctaaatttcataaggatggcgttttgacccaactgcatgttgctttctctagagaccagaaggagaaggtttatgttcaacatcttctgaagaagaacaaggaaaatatttggaagctgataaatgaagagaacggtcacatctatgtgtgcggtgatgctagaaatatggctagagacgtgcataacactttctatgatatcgttgaagagtatggcaagatggatcactctcaagcagttgattacatcaagaagttgatgaccaagggccgttactctcaagatgtttggagttaa。
31、优选地，所述重组毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：
32、(1)以酵母表达载体ppicza为模板构建酵母双目的基因共表达载体ppicza-duet；
33、(2)将中华大蟾蜍来源的多功能甾体羟化酶基因和细胞色素p450还原酶cprcs基因插入到ppicza-duet中，得到重组表达载体ppicza-duet-cyp7462-cprcs；
34、(3)将所述重组表达载体电转化至毕赤酵母，经过筛选得到阳性的重组毕赤酵母工程菌。
35、本发明所述的多功能甾体羟化酶包括但不限于在毕赤酵母等宿主细胞内表达。
36、第五方面，本发明提供了第四方面所述基因工程菌株的制备方法，所述制备方法包括：将第三方面所述的重组载体转导至毕赤酵母细胞，即得所述基因工程菌株。
37、第六方面，本发明提供了第一方面所述的多功能甾体羟化酶在催化甾体化合物羟基化中的应用。
38、优选地，所述羟基化的位置包括c6β、c7β、c12α、c14α、c7β、c15α或c15β中任意一种或至少两种的组合。
39、优选地，所述甾体化合物为具有如下结构通式的化合物：
40、
41、其中，r2-r7各自独立地为-h、-oh或酮基中任意一种；r1为-oh或酮基；r8为-oh、酮基、烷基、取代烷基、氧代甲基、五元内酯环、双不饱和六元内酯环或含羧酸的侧链中任意一种。
42、优选地，所述甾体化合物包括孕酮类化合物、蟾蜍内酯类化合物或胆酸类化合物中任意一种或至少两种的组合。
43、优选地，所述孕酮类化合物包括黄体酮和/或羟孕酮。
44、优选地，所述蟾蜍内酯类化合物包括蟾毒灵和/或7β-羟基蟾毒灵。
45、优选地，所述胆酸类化合物包括石胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸、猪去氧胆酸或奥贝胆酸中任意一种或至少两种的组合。
46、优选地，所述甾类化合物包括其骨架a、b、c和d环被其他修饰的甾体化合物。
47、优选地，所述甾类化合物的取代基除六元二烯内酯环、烷基、取代烷基外，可以有其他基团取代，也包含其甾体骨架a、b、c和d环同时被其他修饰。
48、第七方面，本发明提供了一种催化甾体化合物羟基化的方法，所述方法包括：
49、发酵培养第四方面所述的基因工程菌株，喂养甾体化合物，进行催化反应。作为优选的技术方案，所述催化甾体化合物羟基化的方法包括以下步骤：
50、(1)将第四方面所述的基因工程菌株于含25-100μg/ml的盐酸博莱霉素的ypd液体培养基中，25-32℃，150-260rpm，振荡培养12-36h，获得一级种子液；
51、(2)将一级种子液按2-15％转接量转接至ypd液体培养基中，25-32℃，150-260rpm，振荡培养至od600值为6-7，获得二级种子液；
52、(3)将二级种子液按2-15％转接量转接至mgy甘油培养基，25-32℃，150-260rpm，振荡培养12-48h，得到发酵液；
53、(4)将(3)中的发酵液离心得到菌体，用mmh甲醇培养基重悬菌体，将甾体化合物用mmh甲醇培养基体积0.1-5％的甲醇溶解后与mmh甲醇培养基混合，25-30℃，150-260rpm，转化0.5-5天，每4-24h补加mmh甲醇培养基体积0.2-1％的甲醇，获得甾体羟化产物。
54、上述25-100中的具体点值可以选择25、26、27、28、30、40、50、60、70、80、90、95、96、97、98、99、100等。
55、上述25-32中的具体点值可以选择25、26、27、28、29、30、31、32等。
56、上述150-260中的具体点值可以选择150、151、152、153、154、200、210、220、230、240、250、255、256、257、258、259、260等。
57、上述2-15％中的具体点值可以选择2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％等。
58、上述12-48中的具体点值可以选择12、13、14、15、16、20、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48等。
59、上述0.1-5％中的具体点值可以选择0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、2％、3％、4％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％等。
60、上述25-30中的具体点值可以选择25、26、27、28、29、30等。
61、上述0.5-5中的具体点值可以选择0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、4.6、4.7、4.8、4.9、5等。
62、上述4-24中的具体点值可以选择4、5、6、7、8、10、12、13、14、15、16、17、20、21、22、23、24等。
63、上述0.2-1％中的具体点值可以选择0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.99、1％等。
64、第八方面，本发明提供了利用第七方面所述的催化甾体化合物羟基化的方法催化得到的甾体羟化产物在制备药物、保健品或食品添加剂中的应用。
65、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
66、本发明构建了重组表达载体ppicza-duet-cyp7462-cprcs，以毕赤酵母km71h为表达宿主，实现多功能甾体羟化酶的异源表达，且成功实现了对不同甾体化合物c6β、c7β、c12α、c14α、c7β、c15α、c15β羟基化的高效转化，为甾体化合物进一步的工业化应用奠定了基础。
1.一种多功能甾体羟化酶，其特征在于，所述多功能甾体羟化酶的氨基酸序列包括：
2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1所述的多功能甾体羟化酶的编码序列；
3.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求2所述的核酸分子；
4.一种同时表达多功能甾体羟化酶和细胞色素p450还原酶的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株含有权利要求3所述的重组载体；
5.根据权利要求4所述基因工程菌株的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将权利要求3所述的重组载体转导至毕赤酵母细胞，即得所述基因工程菌株。
6.权利要求1所述的多功能甾体羟化酶在催化甾体化合物羟基化中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羟基化的位置包括c6β、c7β、c12α、c14α、c7β、c15α或c15β中任意一种或至少两种的组合；
8.一种催化甾体化合物羟基化的方法，其特征在于，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的催化甾体化合物羟基化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
10.利用权利要求8或9所述的催化甾体化合物羟基化的方法催化得到的甾体羟化产物在制备药物、保健品或食品添加剂中的应用。
