本发明属于生物，涉及用于肺癌检测的甲基化生物标志物、捕获探针、试剂盒及其用途。
背景技术：
1、据估算，2022年中国有大约4,820,000的癌症新发病例，另外，有3,210,000癌症死亡病例。其中肺癌新发病例达到870,982例，因肺癌死亡病例达到766,898例。无论是发病率还是病死率，肺癌在我国都排在首位。据统计，一期(i期)肺癌患者五年存活率超过80％，然而四期(iv期)肺癌患者五年生存率不足10％。此外，晚期肺癌患者花费巨大。由于早期癌症的治愈率和治疗花费都远远高于中晚期患者，因此，实现肺癌早期诊断具有十分重要的临床价值和社会经济价值。然而，由于大部分早期肺癌患者往往缺乏明显的临床症状，绝大部分肺癌患者确诊时都已经进入中晚期，致使我国肺癌的病死率超过了80％。医学研究发现，癌症从病灶开始形成到患者出现临床症状平均需要经历数年时间，这为我们早期检出肺癌提供了一个非常有效的窗口期。如果能够在这个窗口期内实现肺癌早诊，将大大降低肺癌病死率。
2、目前临床上应用于肺癌早期诊断和筛查的技术主要是基于影像学技术，包括胸部x光射线和低剂量螺旋ct(low-dose computed tomography,ldct)。国外大规模临床研究发现，相比胸部x光，ldct可以显著提高一期肺癌的检出率，从而显著提高肺癌患者的存活率。然而，研究同时发现ldct检出肺部结节中超过90％都是良性结节，因此存在过度诊疗的风险。此外，ldct设备成本高昂，需要专门的技术人员进行操作，因此难以大规模推广。同时，ldct具有一定的放射性，对大众的健康也有一定影响。除了影像学技术，临床上也有一些常规肿瘤标志物在应用，包括cea、ca 125、nse、cyfra21-1和scc等。然而，这类标志物在早期肺癌中敏感性非常低，因此难以满足肺癌早期检测和筛查的临床需求。
3、近年来，大量研究发现和证明，表观遗传学的异常改变是肿瘤发生和发展的重要原因。作为表观遗传学的重要机制之一，dna甲基化在癌症发生发展中的作用机制在近些年得到了深入的研究和阐述。研究表明，dna甲基化能够改变染色质构象，从而实现对基因表达的调控。dna甲基化的改变发生在肿瘤形成的早期，并贯穿肿瘤发生发展和转移的整个过程。抑癌基因启动子区的高甲基化能够下调该基因的表达，从而促使癌前病灶转化为恶性的肿瘤细胞。因此，甲基化生物标志物是肺癌早期检测较为理想的一种标志物，能够满足对早期肺癌检测的灵敏性和特异性要求。
技术实现思路
1、发明要解决的问题
2、针对现有肺癌早期检测技术存在的诸多问题，本发明提供了可以早期检测肺癌的不同的甲基化生物标志物，本发明提供的甲基化生物标志物能够灵敏和特异地检测肺癌，本发明还提供了包含所述甲基化生物标志物的试剂盒，并证明了其在检测肺癌中的用途。
3、本发明提供了用于体外检测肺癌的甲基化生物标志物、捕获探针及相关试剂盒，以及基于该甲基化生物标志物、捕获探针或试剂盒来实施检测的方法，证明了用于检测肺癌的功效。
4、用于解决问题的方案
5、一种用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的甲基化生物标志物包括附表1中提供的编号1～编号631的差异甲基化区域中的任一项或其任意组合。
6、根据[1]所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的甲基化生物标志物包括以下差异甲基化区域中的任一项或其任意组合：
7、chr3:157821381-157821501、chr3:157821417-157821537、chr5:40681015-40681135、chr5:40681136-40681256、chr5:40681257-40681377、chr5:40681498-40681618、chr5:40681619-40681739、chr5:40681740-40681860、chr5:40681861-40681981、chr5:40681982-40682102、chr5:40681378-40681498、chr12:6665201-6665321、chr12:6665268-6665388、chr12:6664436-6664556、chr12:6664515-6664635、chr2:63283967-63284087、chr2:63284046-63284166、chr7:27204863-27204983、chr7:27204924-27205044、chr1:145562692-145562812、chr1:145562715-145562835、chr5:3601276-3601396、chr5:3601357-3601477。
8、根据[1]或[2]所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域至少包括：chr3:157821381-157821501、chr3:157821417-157821537中的至少一种；
9、任选地，所述的差异甲基化区域还包括：chr5:40681015-40681135、chr5:40681136-40681256、chr5:40681257-40681377、chr5:40681498-40681618、chr5:40681619-40681739、chr5:40681740-40681860、chr5:40681861-40681981、chr5:40681982-40682102、chr5:40681378-40681498。
10、根据[3]所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域还包括：chr12:6665201-6665321、chr12:6665268-6665388、chr12:6664436-6664556、chr12:6664515-6664635；和/或，
11、所述的差异甲基化区域还包括：chr1:145562692-145562812、chr1:145562715-145562835；和/或，
12、所述的差异甲基化区域还包括：chr5:3601276-3601396、chr5:3601357-3601477。
13、根据[3]所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域还包括：chr2:63283967-63284087、chr2:63284046-63284166；
14、和/或，所述的差异甲基化区域还包括：chr7:27204863-27204983、chr7:27204924-27205044。
15、根据[1]或[2]所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，
16、所述的差异甲基化区域至少包括：
17、chr5:40681015-40681135、chr5:40681136-40681256、chr5:40681257-40681377、chr5:40681498-40681618、chr5:40681619-40681739、chr5:40681740-40681860、chr5:40681861-40681981、chr5:40681982-40682102、chr5:40681378-40681498；
18、和/或，所述的差异甲基化区域至少包括：
19、chr12:6665201-6665321、chr12:6665268-6665388、chr12:6664436-6664556、chr12:6664515-6664635；
20、和/或，所述的差异甲基化区域至少包括：
21、chr2:63283967-63284087、chr2:63284046-63284166；
22、和/或，所述的差异甲基化区域至少包括：
23、chr7:27204863-27204983、chr7:27204924-27205044；
24、和/或，所述的差异甲基化区域至少包括：
25、chr1:145562692-145562812、chr1:145562715-145562835；
26、和/或，所述的差异甲基化区域至少包括：
27、chr5:3601276-3601396、chr5:3601357-3601477。
28、根据[1]～[6]中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域包括：chr3:157821381-157821501、chr3:157821417-157821537、chr5:40681015-40681135、chr5:40681136-40681256、chr5:40681257-40681377、chr5:40681498-40681618、chr5:40681619-40681739、chr5:40681740-40681860、chr5:40681861-40681981、chr5:40681982-40682102、chr5:40681378-40681498、chr12:6665201-6665321、chr12:6665268-6665388、chr12:6664436-6664556、chr12:6664515-6664635、chr2:63283967-63284087、chr2:63284046-63284166、chr7:27204863-27204983、chr7:27204924-27205044、chr1:145562692-145562812、chr1:145562715-145562835、chr5:3601276-3601396、chr5:3601357-3601477。
29、根据[1]～[7]中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域包括：附表1中提供的编号1～编号631的差异甲基化区域。
30、根据[1]～[8]中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的肺癌为存在于受试者中的肺癌；
31、任选地，所述的受试者为哺乳动物；
32、优选地，所述的哺乳动物为人。
33、根据[1]～[9]中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述肺癌选自非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
34、根据[1]～[10]中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，待测样本中所述甲基化生物标志物的甲基化水平，与未患有肺癌的受试者的样本中所述甲基化生物标志物的甲基化水平存在差异。
35、一种捕获探针，其用于捕获[1]～[11]中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物；
36、优选地，所述捕获探针至少部分地与[1]～[11]中任一项所述的甲基化生物标志物的序列杂交；
37、更优选地，所述捕获探针包括以seq id no:1～92所示的捕获探针的至少一种。
38、下述(i)～(iii)中任一用途：
39、(i)[1]～[11]中任一项所述的甲基化生物标志物在制备用于诊断肺癌的试剂或试剂盒中的用途；
40、(ii)确定[1]～[11]中任一项所述的甲基化生物标志物的甲基化水平的试剂在制备用于诊断肺癌的试剂或试剂盒中的用途；
41、(iii)[12]所述的捕获探针在制备用于诊断肺癌的试剂或试剂盒中的用途。
42、一种用于诊断肺癌的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中[1]～[11]中任一项所述的甲基化生物标志物的甲基化水平的试剂和/或[12]所述的捕获探针。
43、根据[14]所述的用于诊断肺癌的试剂盒，其中，所述的待测样本选自组织、全血、血浆、血清、唾液、痰液、胸腔积液、肺泡灌洗液、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种；
44、优选地，所述的待测样本为组织、全血、血浆、血清、唾液、痰液、肺泡灌洗液或胸腔积液。
45、根据[14]或[15]所述的用于诊断肺癌的试剂盒，其中，所述的待测样本来自受试者；
46、任选地，所述的受试者是哺乳动物；
47、优选地，所述的哺乳动物是人。
48、一种用于诊断肺癌的系统，其中，所述系统包括检测装置、计算装置和输出装置；
49、所述检测装置包括进样器和检测器，所述进样器用于采集来自受试者的样本，所述检测器用于检测所述样本中[1]～[11]中任一项所述的甲基化生物标志物的甲基化水平；
50、所述计算装置包括存储器和处理器，所述存储器中存储有计算机程序，所述处理器被配置为执行所述存储器中存储的计算机程序，以实现如下判别：
51、所述样本中[1]～[11]中任一项所述的甲基化生物标志物的甲基化水平是否不同于未患有肺癌的受试者的样本中测定的所述甲基化生物标志物的甲基化水平。
52、发明的效果
53、本发明的发明人利用表观基因组学技术，结合高通量测序和生物信息学技术，通过测定肺癌组织、癌旁正常对照组织以及良性肺部疾病组织的全基因组甲基化谱，发现与肺癌发生密切相关的甲基化生物标志物，并确定了它们在肺癌中甲基化状态的异常改变，由此设计了特异性的捕获探针用于捕获这些特定的靶序列。进一步，本发明的发明人发现，利用高通量测序技术分析甲基化生物标志物的甲基化状态，能够灵敏且特异地在体外检测肺癌。本发明发现，通过对肺癌患者和正常对照个体的外周血游离dna的检测显示：本发明描述的标志物及其组合及相关检测方法能够灵敏和特异地检测肺癌，尤其适用于两种不同组织学亚型的常见肺癌：鳞癌和腺癌，以及小细胞肺癌。除了适用于外周血游离dna样本，本发明同时适用于能够获取满足试验所需dna的各种类型生物样本(包括但不限于手术和穿刺活检的组织样本、血液样本、尿液、痰液、肺泡灌洗液和胸水等)。因此，本发明提供了一种可用于体外检测肺癌的甲基化生物标志物及其组合及相关的捕获探针、检测方法、用途等，解决了临床上的迫切需求，具有重要的临床应用价值。
1.一种用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的甲基化生物标志物包括附表1中提供的编号1～编号631的差异甲基化区域中的任一项或其任意组合。
2.根据权利要求1所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的甲基化生物标志物包括以下差异甲基化区域中的任一项或其任意组合：
3.根据权利要求1或2所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域至少包括：chr3:157821381-157821501、chr3:157821417-157821537中的至少一种；
4.根据权利要求3所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域还包括：chr12:6665201-6665321、chr12:6665268-6665388、chr12:6664436-6664556、chr12:6664515-6664635；和/或，
5.根据权利要求3所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域还包括：chr2:63283967-63284087、chr2:63284046-63284166；
6.根据权利要求1或2所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，
7.根据权利要求1～6中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域包括：chr3:157821381-157821501、chr3:157821417-157821537、
8.根据权利要求1～7中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的差异甲基化区域包括：附表1中提供的编号1～编号631的差异甲基化区域。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述的肺癌为存在于受试者中的肺癌；
10.根据权利要求1～9中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，所述肺癌选自非小细胞肺癌或小细胞肺癌。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物，其中，待测样本中所述甲基化生物标志物的甲基化水平，与未患有肺癌的受试者的样本中所述甲基化生物标志物的甲基化水平存在差异。
12.一种捕获探针，其用于捕获权利要求1～11中任一项所述的用于诊断肺癌的甲基化生物标志物；
13.下述(i)～(iii)中任一用途：
14.一种用于诊断肺癌的试剂盒，其中，所述的试剂盒包含用于检测待测样本中权利要求1～11中任一项所述的甲基化生物标志物的甲基化水平的试剂和/或权利要求12所述的捕获探针。
15.根据权利要求14所述的用于诊断肺癌的试剂盒，其中，所述的待测样本选自组织、全血、血浆、血清、唾液、痰液、胸腔积液、肺泡灌洗液、尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清中的一种或多种；
16.根据权利要求14或15所述的用于诊断肺癌的试剂盒，其中，所述的待测样本来自受试者；
17.一种用于诊断肺癌的系统，其中，所述系统包括检测装置、计算装置和输出装置；
