背景技术：
1、本发明涉及用标签标记o-聚糖的领域，所述标签允许通过荧光、通过质谱法以及通过紫外吸收进行检测。
2、在翻译后通过添加诸如脂质或碳水化合物的部分或通过磷酸化修饰由真核细胞产生的许多蛋白质或肽。这些修饰可以显著影响经修饰的蛋白质或肽的特性。
3、一组重要的此类翻译后修饰是添加共价连接的、线性的或分支的碳水化合物链。蛋白质-碳水化合物缀合物被称为糖蛋白，而具有附接的碳水化合物的肽被称为糖肽。碳水化合物与蛋白质或肽附接的点被称为糖基化位点。所附接的多糖和寡糖有时在本文中被称为聚糖。n-聚糖被定义为通过天冬酰胺残基的氮附接至蛋白质或肽的那些，而o-聚糖被定义为通过丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸侧链的羟基氧附接至蛋白质或肽的那些。
4、特定糖蛋白或糖肽上的特定聚糖模式通过产生蛋白质或肽的特定细胞系和细胞生长的条件来确定。由于与蛋白质或肽缀合的聚糖可能影响对其功能至关重要的特征(包括药代动力学、稳定性、生物活性或免疫原性)，在许多用途中，确定存在哪些聚糖是重要的。例如，美国食品和药物监督管理局(food and drug administration)要求表征附接至治疗性糖蛋白和疫苗的碳水化合物，以显示物质的组成和制造的一致性，导致需要对产品进行广泛表征。碳水化合物谱的分析对于重组蛋白或肽生产中的质量控制也是重要的，其中碳水化合物谱的变化可以指示系统中的应激，如果不及时纠正，则可能需要丢弃商业规模的一发酵罐的昂贵蛋白质。
5、当前用于确定目的糖蛋白或糖肽上存在哪些聚糖的方法典型地依赖于从蛋白质组分释放聚糖，所述过程被称为“去糖基化”。许多n-聚糖可以在温和条件下通过各种酶(诸如pngase f(肽-n4-(乙酰基-β-葡糖胺基)-天冬酰胺酰胺酶，ec 3.5.1.52.))的酶促裂解来从糖蛋白或糖肽中方便地释放。n-聚糖的酶促消化(诸如通过pngase f)典型地发生在水溶液中，并且导致作为β-葡基胺的n-聚糖的初始释放，其中所释放的聚糖的游离还原端与氨缀合(参见例如，tarentino等人tigg 1993,23,163-170；rasmussenj.r.j.am.chem.soc.1992,114,1124-1126；risley等人,j.biol.chem.1985,260,15488-15494,1985)。
6、不幸的是，只有有限的通过酶释放o-聚糖的手段是可用的。二糖gal-β(1,3)galnac可以通过酶o-糖苷酶酶促释放，但通常没有释放具有分支链的完整o-聚糖的酶促手段。因此，已经开发了许多通过使用化学品释放这些更复杂的o-聚糖的方法。一旦o-聚糖已经从糖蛋白或糖肽被释放，典型地将它们在其还原末端进行标记，经受高压液相色谱法以分离标记的聚糖，并且进行分析以确定从目的糖蛋白或糖肽释放的聚糖的类型和量。
7、大多数传统的化学去糖基化技术涉及在相对苛刻的条件下对相对大量的起始样品进行化学去糖基化。例如，相对早期的用于释放o-聚糖的方案要求在0℃下与三氟甲磺酸一起孵育0.5至2小时，随后在-20℃下将酸用水性吡啶中和。carlson方法(许多人认为其是释放和分析o-聚糖的黄金标准)始于20世纪60年代末，并且依赖于β-消除，即使用氢氧化钠在碱性条件下释放o-聚糖结合使用硼氢化钠进行还原、在45℃下孵育14-16小时并且固相萃取以富集聚糖，用于通过液相色谱-质谱法(“lc-ms”)进行分析。参见例如，carlson,d.,j.biol.chem.,243:616-626(1968)。maniatis方法需要1+毫克糖蛋白并且依赖于使用二甲胺的β-消除，在70℃下微波辐射70分钟，以及羟基的完全甲基化，以通过基质辅助激光解吸电离质谱法(maldi-ms)进行分析。参见例如，maniatis等人,anal.chem.82:2421-2425(2010)。merry等人的方法使用肼(在呈无水形式时有毒且不稳定的化合物)，需要>40μg的糖蛋白，导致可能存在于o-聚糖核心中的乙酰基的不必要的去除，在60℃下孵育6小时，以及用荧光团进行再乙酰化和还原末端标记的附加步骤。参见例如，merry等人,anal.biochem.304:91-99(2002)。其他人报告了使用释放o-聚糖，其使用β-消除、含0.2m三乙胺的50％肼溶液、随后用对氨基苯甲酸乙酯标记的组合，并且发现在最佳孵育时间为48小时的情况下有良好结果。参见，kisiel等人,toxicology mechanisms and methods,18:503-07(2008)；kisiel等人,acta biochemica polonica,1999,46(3):753-757。
8、最近，已经开发了几种“一锅法”程序。一种这样的一锅法方法使用用二甲胺的β-消除与用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮或“pmp”的还原端标记的组合。所述方法要求将非常少的样品(约5μg)与40％二甲胺在0.5m pmp中在甲醇中在85℃下孵育2小时，随后干燥样品并且固相萃取所释放的聚糖以浓缩它们用于液相色谱-质谱法(lc-ms)分析。参见例如，zauner等人,biochim.biophys.acto.1820:142o-1428(2012)(以下，“zauner”)。wang等人(proteomics 11:4229-4242(2011))和furukawa等人(anal.chem,83:906o-9067(2011))是用于释放o-聚糖并且用pmp标记它们的其他一锅法β消除方法。wuhrer等人传授了他们坚称的“用于从糖蛋白释放以及标记o-聚糖的一锅法方法”...包括在标记剂的存在下使糖蛋白与胺(例如，甲胺、二甲胺或氨、nh3)接触”。摘要，wuhrer等人，wo 2011/038874。最近，在共同拥有的pct申请(公开为wo 2021/119333)中披露了使用pmp作为标签的一锅法程序。
9、从糖蛋白或糖肽释放的n-聚糖典型地用既可通过荧光又可通过质谱法(“ms”)检测的标签(诸如(agilent technologies,inc.，加利福尼亚州圣克拉拉))标记。这允许通过检测其荧光信号来定量n-聚糖，并且然后通过ms分析确定其分子种类。不幸的是，没有单一的组合了所有希望特征的用于o-聚糖的可用标签。虽然标签2-氨基苯甲酰胺(“2-ab”)为o-聚糖提供了可通过荧光和ms两者检测的标签，但它不能用于一锅释放且标记方法。并且，虽然pmp可以用于此类一锅法方法并且为o-聚糖提供可通过ms检测的信号，但它不是发荧光的。希望具有这样的试剂，所述试剂可以用于一锅法方法以释放并且标记o-聚糖，并且所述试剂将提供具有标签的所得的标记的o-聚糖衍生物，所述标签可以通过uv、通过荧光以及通过ms检测。
10、仍需要这样的试剂，所述试剂可以用于标记从糖蛋白或糖肽释放的o-聚糖，以便它们可以通过uv、荧光和ms来检测；可以用于一锅法程序；仅需要少量样品体积；仅需要中等反应条件；仅需要很短的孵育时间；以及可以适于高通量分析。令人惊奇的是，本发明满足了这些和其他需要。
技术实现思路
1、在第一组的实施方案中，本发明提供了发荧光的标记o-聚糖的化合物，所述化合物包含吡唑啉酮核心、接头和香豆素核心，
2、其中，(a)所述接头将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心，并且(b)在所述吡唑啉酮核心与o-聚糖反应以标记所述o-聚糖从而形成用所述标记o-聚糖的化合物的衍生物标记的o-聚糖时，用所述标记o-聚糖的化合物的所述衍生物标记的所述o-聚糖能通过荧光检测。在一些实施方案中，将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心的接头由以下构成：(a)十个或更少个碳原子的烷基链，和(b)至多十个碳原子的链，或总计十个碳原子和桥接基团的链，前提是在所述吡唑啉酮核心与任何桥接基团之间存在至少一个碳原子，前提是至少一个未经取代的碳原子被布置在任两个桥接基团之间。在一些实施方案中，所述桥接基团选自酯基、胺基、烷基、苄基和硫代酸酯基。在一些实施方案中，将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心的接头由四个或更少个碳原子构成。在一些实施方案中，所述接头是一个碳原子。在一些实施方案中，所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头以从所述吡唑啉酮核心至所述香豆素核心的顺序具有第一碳原子、第二碳原子和从所述第二碳原子至所述香豆素核心的原子的醚连接中的氧原子的链。在一些实施方案中，所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头以从所述吡唑啉酮核心至所述香豆素核心的顺序具有第一碳原子、第二碳原子和从所述第二碳原子至所述香豆素核心的原子的酰胺连接中的氮原子的链，其中氮原子能够具有氢或具有式cnh2n+1的烷基的取代基。在一些实施方案中，所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头具有至多九个碳原子和苄基的链。在一些实施方案中，所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头具有以从所述吡唑啉酮核心起的顺序的一个碳原子和苄基。在一些实施方案中，所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头具有碳原子和携带羰基的碳原子的链，前提是至少一个未经取代的碳原子被布置在每个携带羰基的碳原子之间。在一些实施方案中，所述化合物具有以下结构：
3、结构3，
4、
5、“4-mm基团”
6、其中x1＝cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，
7、结构4
8、
9、“7-emcmp基团”
10、其中r＝ch3或cf3，
11、结构5，
12、
13、其中r1＝h或cnh2n+1；并且r2＝ch3或cf3，
14、结构6，
15、
16、其中x1＝h、cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，
17、结构7，
18、
19、其中x1＝h、cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，或
20、结构8，
21、
22、其中x1＝h、cl、br或i。
23、在一些实施方案中，所述化合物是结构3的化合物，并且具有结构1的结构：
24、
25、(“4-mm”)。在一些实施方案中，所述化合物是结构4的化合物，并且具有以下结构：
26、
27、其中r＝ch3(“7-emcmp”)。
28、在另一组的实施方案中，本发明提供了用于释放、标记以及任选地分析存在于所选的目的糖缀合物上的o-聚糖的方法，所述方法包括：在容器中将所述选定的目的糖缀合物在包含发荧光的标记o-聚糖的化合物的溶液中在0℃至100℃的温度下孵育约10分钟与23小时之间的时间，所述化合物包含吡唑啉酮核心、接头和香豆素核心，其中，(a)所述接头将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心，并且(b)在所述吡唑啉酮核心与o-聚糖反应以标记所述o-聚糖从而形成用所述标记o-聚糖的化合物的衍生物标记的o-聚糖时，用所述标记o-聚糖的化合物的所述衍生物标记的所述o-聚糖能通过荧光检测。在一些实施方案中，将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心的接头由以下构成：(a)十个或更少个碳原子的烷基链，
29、(b)至多十个碳原子的链，或总计十个碳原子和桥接基团的链，前提是在所述吡唑啉酮核心与任何桥接基团之间存在至少一个碳原子，前提是至少一个未经取代的碳原子被布置在任两个桥接基团之间。在一些实施方案中，所述一个或多个桥接基团独立地选自酯基、胺基、烷基、苄基和硫代酸酯基。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物具有以下结构：
30、结构3，
31、
32、“4-mm基团”
33、其中x1＝cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，
34、结构4
35、
36、“7-emcmp基团”
37、其中r＝ch3或cf3，结构5，
38、
39、其中r1＝h或cnh2n+1；r2＝ch3或cf3，
40、结构6，
41、
42、其中x1＝h、cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，
43、结构7
44、
45、其中x1＝h、cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，或
46、结构8，
47、
48、x1＝h、cl、br或i。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构3的化合物，并且具有结构1的结构：
49、
50、(“4-mm”)。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构4的化合物，并且具有以下结构：
51、
52、其中r＝ch3(“7-emcmp”)。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物的接头包含总计四个或更少个碳和桥接基团，并且所述溶液是完全水性的。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物的所述接头包含总计四个或更少个碳和桥接基团，并且所述溶液是水溶液和有机溶剂的混合物，所述有机溶剂是极性质子有机溶剂或非质子有机溶剂。在一些实施方案中，所述有机溶剂是极性质子有机溶剂。在一些实施方案中，所述极性质子有机溶剂是甲醇。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物的所述接头包含总计五至十个碳和桥接基团，并且所述溶液包含至多90％极性质子或非质子有机溶剂。在一些实施方案中，所述溶液进一步包含有效量的碱。在一些实施方案中，所述水溶液和有机溶剂的混合物进一步包含有效量的碱。在一些实施方案中，包含至多90％极性质子或非质子有机溶剂的溶液进一步包含有效量的碱。在一些实施方案中，所述碱是二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铵或这些中的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，碱是tea。在一些实施方案中，碱以0.5m至5m的浓度存在。在一些实施方案中，所述碱是tea并且以0.5m至5m的浓度存在。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物以0.05m至5m的浓度存在。在一些实施方案中，将糖缀合物在所述水溶液中在0℃-100℃的温度下孵育约10分钟与23小时之间的时间。在一些实施方案中，选定的目的糖缀合物以4μg与1000μg之间的量存在于所述溶液中。在一些实施方案中，选定的目的糖缀合物以20μg与800μg之间的量存在于所述溶液中。在一些实施方案中，选定的目的糖缀合物是糖蛋白或糖肽。在一些实施方案中，所述水溶液不含有肼。在一些实施方案中，所述孵育时间是10至约30分钟。在一些实施方案中，孵育所述水溶液的温度是70℃-90℃。在一些实施方案中，孵育所述水溶液的温度是80℃±5℃。在一些实施方案中，所述容器是多孔板。在一些实施方案中，所述多孔板是96孔板。在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析所述释放的、标记的o-聚糖。在一些实施方案中，所述分析包括通过液相色谱法分离所述释放的、标记的o-聚糖。在一些实施方案中，所述分析包括通过荧光分析所述释放的、标记的、分离的o-聚糖。在一些实施方案中，所述分析包括通过质谱法分析所述释放的、标记的、分离的o-聚糖。在一些实施方案中，所述分析包括通过液相色谱法分离所述释放的、标记的o-聚糖并且通过荧光、紫外光、质谱法或这些中的两种或更多种的组合分析所述释放的、标记的和分离的o-聚糖。
53、在又另外一组实施方案中，本发明提供了组合物，所述组合物包含目的糖缀合物和溶液，所述溶液包含(a)选自二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化铵的碱，和(b)发荧光的标记o-聚糖的化合物，所述化合物包含吡唑啉酮核心、接头和香豆素核心，
54、其中，(i)所述接头将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心，并且(ii)在所述吡唑啉酮核心与o-聚糖反应以标记所述o-聚糖从而形成用所述标记o-聚糖的化合物的衍生物标记的o-聚糖时，用所述标记o-聚糖的化合物的所述衍生物标记的所述o-聚糖能通过荧光检测。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物具有以下结构：
55、结构3，
56、
57、“4-mm基团”
58、其中x1＝cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，
59、结构4，
60、
61、“7-emcmp基团”
62、其中r＝ch3或cf3，
63、结构5，
64、
65、其中r1＝h或cnh2n+1；并且r2＝ch3或cf3，
66、结构6，
67、
68、其中x1＝h、cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，
69、结构7，
70、
71、其中x1＝h、cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，或
72、结构8，
73、
74、其中x1＝h、cl、br或i。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构3的化合物，并且具有结构1的结构：
75、
76、(“4-mm”)。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构4的化合物，并且具有以下结构：
77、
78、其中r＝ch3(“7-emcmp”)。在一些实施方案中，所述溶液含有不超过5％的肼。在一些实施方案中，所述溶液不含有肼。
79、在另一组实施方案中，本发明提供了合成1-(4-甲基-7-甲氧基香豆素)-3-甲基-5-吡唑啉酮(“4-mm”)的方法，所述方法包括：(a)使4-溴甲基-7-甲氧基香豆素与肼基甲酸叔丁酯在水溶性碳酸盐或碳酸氢盐的存在下在极性非质子有机溶剂中在一定温度下反应一段时间，所述温度和时间足以产生反应产物1，
80、(b)去除所述溶剂，从而获得反应产物1的粗固体混合物，(c)将选自三氟乙酸(“tfa”)、冰乙酸、冰甲酸、三氯乙酸的酸添加至所述反应产物1的粗固体混合物中，并且允许所述酸与所述反应产物1的粗固体混合物在一定温度下反应一段时间，所述温度和时间足以导致反应产物2的形成，
81、(d)将乙酰乙酸烃酯添加至所述反应产物2中，并且将所得混合物在一定温度下孵育一段时间，所述温度和时间允许它在具有一定ph的溶液中形成反应产物3，(e)将所述溶液的所述ph调节至ph 3-7之间，以及，
82、(f)从所述溶液中萃取所述反应产物3(4-mm)，从而获得4-mm。在一些实施方案中，步骤(a)中的温度是≥40℃≤90℃。在一些实施方案中，步骤(a)中的温度是65℃±10℃。在一些实施方案中，步骤(a)中的时间是16小时，±4小时。在一些实施方案中，所述溶剂的去除是通过旋转蒸发(rotavap)。在一些实施方案中，所述水溶性碳酸盐或碳酸氢盐是碳酸钠或碳酸氢钠。在一些实施方案中，所述极性非质子有机溶剂是四氢呋喃、丙酮或二甲基甲酰胺。在一些实施方案中，所述酸是tfa。在一些实施方案中，在步骤(a)与步骤(c)之间通过以下方式去除过量肼基甲酸叔丁酯：将其用二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯相对于饱和碳酸氢钠从所述粗固体混合物中萃取。在一些实施方案中，步骤(c)中的时间是1小时，±0.25小时。在一些实施方案中，步骤(c)中的温度是室温，±5℃。在一些实施方案中，步骤(d)中的所述孵育的时间是1-24小时。在一些实施方案中，步骤(d)中的所述孵育的时间是3-16小时。在一些实施方案中，步骤(d)中的所述孵育的温度是室温，±5℃。在一些实施方案中，步骤(e)中的所述ph的调节是通过添加乙酸钠、na2co3、nahco3、nh4cl、naoh、hcl或tfa或这些中的任何项的组合。在一些实施方案中，所述乙酰乙酸烃酯选自乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯、乙酰乙酸丙酯、乙酰乙酸丁酯、乙酰乙酸戊酯、乙酰乙酸苄酯或乙酰乙酸苯酯。
83、在另一组实施方案中，本发明提供了另外一组用于合成1-(4-甲基-7-甲氧基香豆素)-3-甲基-5-吡唑啉酮(“4-mm”)的方法，所述方法包括：(a)使4-溴甲基-7-甲氧基香豆素与肼基甲酸叔丁酯在水溶性碳酸氢盐或碳酸盐的存在下在极性非质子有机溶剂中在一定温度下反应一段时间，所述温度和时间足以产生反应产物1，
84、(b)去除所述溶剂，从而获得反应产物1的粗固体混合物，
85、(c)将醇添加至所述反应产物1的粗固体混合物中，并且将所得混合物在一定温度下加热一段时间，所述温度和时间足以溶解所述粗固体混合物中的所述固体，(d)向含有所述溶解物的所述混合物中添加酸，并且将所得混合物在一定温度下孵育一段时间以允许在所述混合物中形成固体，(e)过滤所述固体以将它们从所述混合物中分离，并且将所述分离的固体与醇和乙酰乙酸烃酯在一定温度下一起孵育一段时间，所述时间和温度足以允许所述分离的固体与所述乙酰乙酸烃酯之间的反应以形成4-mm，(f)用合适的有机溶剂萃取所述混合物以将4-mm浓缩在有机层中并且从所述有机层中纯化所述4-mm，从而合成4-mm。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从所述纯化的4-mm中分离4-mm。在一些实施方案中，步骤(a)中的极性非质子有机溶剂是四氢呋喃、丙酮或二甲基甲酰胺。在一些实施方案中，步骤(b)中的所述溶剂的去除是通过旋转蒸发。在一些实施方案中，步骤(a)中的温度是75℃±10℃。在一些实施方案中，步骤(a)中的时间是6小时，±3小时。在一些实施方案中，步骤(c)中的温度是50℃±10℃。在一些实施方案中，步骤(d)中的时间是30分钟，±10小时。在一些实施方案中，步骤(e)中的温度是80℃±10℃。在一些实施方案中，步骤(e)中的时间是16小时，±6小时。在一些实施方案中，在步骤(e)中添加的乙酰乙酸烃酯的浓度是20mmol±10mmol。在一些实施方案中，在步骤(e)中添加的乙酰乙酸烃酯的浓度是20mmol±5mmol。在一些实施方案中，步骤(f)的有机溶剂是乙酸乙酯、二氯甲烷或二甲醚。在一些实施方案中，所述分离是通过过滤。在一些实施方案中，所述分离是通过旋转蒸发。在一些实施方案中，步骤(e)的乙酰乙酸烃酯选自乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯、乙酰乙酸丙酯、乙酰乙酸丁酯、乙酰乙酸戊酯、乙酰乙酸苄酯或乙酰乙酸苯酯。
86、在又另一组实施方案中，本发明提供了合成化合物1-[7-乙氧基(-4-甲基香豆素)]-3-甲基-5-吡唑啉酮(“7-emcmp”)的方法，所述化合物具有结构4的结构，
87、
88、其中r＝ch3，
89、所述方法包括以下顺序的以下步骤：
90、(a)在反应器皿中使4-甲基伞形酮与meona在meoh中反应以获得黄色溶液，(b)添加二甲基甲酰胺(dmf)，随后在搅拌和用氮气吹扫下添加对甲苯磺酸2-氯乙酯，从而产生第一混合物，(c)将步骤(b)的第一混合物缓慢加热至高于室温的第一选定温度，在所述选定温度下或在约所述选定温度下将所述第一混合物孵育有效的时间段，将所述第一混合物冷却至高于室温的第二选定温度，添加选自乙醇、甲醇、丙醇、丁醇的醇，从而产生第二混合物，并且将所述第二混合物加热至沸腾，将所述第二混合物冷却至室温，收集所述反应器皿中的任何固体，并且将所述固体用冷乙醇、甲醇、丙醇或丁醇洗涤，(d)将步骤(c)的经洗涤的固体放置在反应器皿中，添加nai和丙酮，从而产生第三混合物，使所述第三混合物流动，将它冷却至室温，并且通过(1)二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯与(2)水之间的萃取从所述流动的第三混合物中萃取产物，(e)将来自步骤(d)的所述产物与(1)肼基甲酸叔丁酯、(2)水溶性碳酸盐或碳酸氢盐和(3)极性非质子有机溶剂一起添加至反应器皿中，从而产生第四混合物，将所述第四混合物在高于室温下搅拌并且回流1o-24h，并且在(1)二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯二氯甲烷与(2)h2o之间萃取以获得有机层，用mgso4或na2so4干燥所述有机层，并且去除溶剂以获得粗固体混合物(“第五混合物”)，(f)将选自三氟乙酸(“tfa”)、冰乙酸、冰甲酸、三氯乙酸的酸添加至所述第五混合物中，并且然后添加乙酰乙酸烃酯，从而产生第六混合物，将所述第六混合物添加至弱碱溶液中，从而产生第七混合物，其中第七混合物具有一定ph，将所述第七混合物的所述ph用乙酸钠、na2co3、nahco3、nh4cl、naoh、hcl或tfa的任何组合调节至3-7，从而产生第八混合物，用二氯甲烷萃取所述第八混合物以获得有机层，并且经mgso4或na2so4干燥所述有机层，从而获得7-emcmp粗产物，从而合成7-emcmp。在一些实施方案中，步骤(f)的弱碱是na2co3。在一些实施方案中，所述方法进一步包括步骤(g)，将所述7-emcmp粗产物与乙酸乙酯一起在其沸腾温度下或在接近其沸腾温度下研磨，随后逐滴添加乙醚以沉淀7-emcmp，从而获得纯化的7-emcmp。
91、在又另一组实施方案中，本发明提供了一种化合物1-[7-(-4-甲基香豆素)]-3-甲基-5-吡唑啉酮(“7-mcmp”)，所述化合物具有以下结构：
92、
93、在仍另一组实施方案中，本发明提供了用于释放、用7-mcmp标记以及任选地分析选定的目的糖缀合物上存在的o-聚糖的方法，所述方法包括：在容器中将所述选定的目的糖缀合物在包含7-mcmp的水溶液中在0℃至100℃的温度下孵育约10分钟与23小时之间的时间。在一些实施方案中，所述水溶液进一步包含有效量的碱。在一些实施方案中，所述碱是二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化铵。在一些实施方案中，所述碱是tea。在一些实施方案中，所述tea以0.5m至5m的浓度存在。在一些实施方案中，所述7-mcmp以0.05m至5m的浓度存在。在一些实施方案中，将糖缀合物在所述水溶液中在0℃-100℃的温度下孵育约10分钟与23小时之间的时间。在一些实施方案中，选定的目的糖缀合物以4μg与200μg之间的量存在于所述溶液中。在一些实施方案中，选定的目的糖缀合物是糖蛋白或糖肽。在一些实施方案中，所述水溶液不含有肼。在一些实施方案中，孵育所述水溶液的温度是70℃-90℃。在一些实施方案中，所述容器是多孔板。在一些实施方案中，所述多孔板是96孔板。
94、在又另一组实施方案中，本发明提供了用于释放以及标记存在于目的糖缀合物上的o-聚糖的试剂盒，所述试剂盒包含：(a)一个或多个容器，(b)选自二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化铵或这些中的两种或更多种的组合的碱，以及(c)发荧光的标记o-聚糖的化合物，所述化合物包含吡唑啉酮核心、接头和香豆素核心，其中(1)所述接头将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心，并且(2)在所述吡唑啉酮核心与o-聚糖反应以标记所述o-聚糖从而形成用所述标记o-聚糖的化合物的衍生物标记的o-聚糖时，用所述标记o-聚糖的化合物的所述衍生物标记的所述o-聚糖能通过荧光检测。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是以下的化合物：
95、结构3，
96、
97、(“4-mm基团”)
98、其中x1＝cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，
99、结构4
100、
101、(“7-emcmp基团”)
102、其中r＝ch3或cf3，
103、结构5，
104、
105、其中r1＝h或cnh2n+1；r2＝ch3或cf3，
106、结构6，
107、
108、其中x1＝h、cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，
109、结构7
110、
111、其中x1＝h、cl、br、i、oh、ome、oet、nh2、nme2、net2，或
112、结构8，
113、
114、其中x1＝h、cl、br或i。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构3的化合物，并且具有结构1的结构：
115、
116、(“4-mm”)。在一些实施方案中，所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构4的化合物，并且具有以下结构：
117、
118、其中r＝ch3(“7-emcmp”)。在一些实施方案中，所述碱是tea。在一些实施方案中，所述碱和所述标签在同一容器的分开的隔室中。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含：(d)至少一个o-聚糖标准品。
119、在仍另一组实施方案中，本发明提供了用于释放以及标记存在于目的糖缀合物上的o-聚糖的试剂盒，所述试剂盒包含：
120、(a)一个或多个容器，(b)布置在所述容器之一中的选自二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化铵或这些中的两种或更多种的组合的碱，以及(c)布置在所述容器之一中的标签1-[7-(-4-甲基香豆素)]-3-甲基-5-吡唑啉酮(“7-mcmp”)。在一些实施方案中，所述碱是tea。
1.一种发荧光的标记o-聚糖的化合物，所述化合物包含
2.根据权利要求1所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心的所述接头由以下构成：
3.根据权利要求2所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述桥接基团独立地选自酯基、胺基、烷基、苄基和硫代酸酯基。
4.根据权利要求1所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心的所述接头由四个或更少个碳原子构成。
5.根据权利要求4所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述接头是一个碳原子。
6.根据权利要求1所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头具有以从所述吡唑啉酮核心至所述香豆素核心的顺序的第一碳原子、第二碳原子和从所述第二碳原子至所述香豆素核心的原子的醚连接中的氧原子的链。
7.根据权利要求1所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头具有以从所述吡唑啉酮核心至所述香豆素核心的顺序的第一碳原子、第二碳原子和从所述第二碳原子至所述香豆素核心的原子的酰胺连接中的氮原子的链，其中氮原子能够具有氢或具有式cnh2n+1的烷基的取代基。
8.根据权利要求1所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头具有至多九个碳原子和苄基的链。
9.根据权利要求1所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头具有以从所述吡唑啉酮核心起的顺序的一个碳原子和苄基。
10.根据权利要求1所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述吡唑啉酮通过接头共价连接至所述香豆素核心，所述接头具有碳原子和携带羰基的碳原子的链，前提是至少一个未经取代的碳原子被布置在每个携带羰基的碳原子之间。
11.根据权利要求1所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述化合物具有以下结构：结构3，
12.根据权利要求11所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述化合物是结构3的化合物，并且具有结构1的结构：
13.根据权利要求11所述的发荧光的标记o-聚糖的化合物，其中所述化合物是结构4的化合物，并且具有以下结构：
14.一种用于释放、标记以及任选地分析存在于选定的目的糖缀合物上的o-聚糖的方法，所述方法包括：在容器中将所述选定的目的糖缀合物在包含发荧光的标记o-聚糖的化合物的溶液中在0℃至100℃的温度下孵育约10分钟与23小时之间的时间，所述化合物包含吡唑啉酮核心、接头和香豆素核心，
15.根据权利要求14所述的方法，其中将所述吡唑啉酮核心共价连接至所述香豆素核心的所述接头由以下构成：
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物具有以下结构：结构3，
17.根据权利要求14所述的方法，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构3的化合物，并且具有结构1的结构：
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构4的化合物，并且具有以下结构：
19.根据权利要求14所述的方法，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物的所述接头包含总计四个或更少个碳和桥接基团，并且所述溶液是完全水性的。
20.根据权利要求14所述的方法，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物的所述接头包含总计四个或更少个碳和桥接基团，并且所述溶液是水溶液和有机溶剂的混合物，所述有机溶剂是极性质子有机溶剂或非质子有机溶剂。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述有机溶剂是极性质子有机溶剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述极性质子有机溶剂是甲醇。
23.根据权利要求14所述的方法，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物的所述接头包含总计五至十个碳和桥接基团，并且所述溶液包含至多90％极性非质子有机溶剂。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述溶液进一步包含有效量的碱。
25.根据权利要求20所述的方法，其中所述水溶液和有机溶剂的混合物进一步包含有效量的碱。
26.根据权利要求23所述的方法，其中包含至多90％极性非质子有机溶剂的所述溶液进一步包含有效量的碱。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述碱是二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化铵。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述碱是二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铵或这些中的两种或更多种的组合。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述碱是二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化铵或这些中的两种或更多种的组合。
30.根据权利要求27所述的方法，其中所述碱是tea。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述碱是tea。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述碱是tea。
33.根据权利要求30所述的方法，其中所述tea以0.5m至5m的浓度存在。
34.根据权利要求31所述的方法，其中所述tea以0.5m至5m的浓度存在。
35.根据权利要求32所述的方法，其中所述tea以0.5m至5m的浓度存在。
36.根据权利要求14所述的方法，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物以0.05m至5m的浓度存在。
37.根据权利要求14所述的方法，其中将所述糖缀合物在所述水溶液中在0℃-100℃的温度下孵育约10分钟与23小时之间的时间。
38.根据权利要求14所述的方法，其中所述选定的目的糖缀合物以4μg与1000μg之间的量存在于所述溶液中。
39.根据权利要求14所述的方法，其中所述选定的目的糖缀合物以20μg与800μg之间的量存在于所述溶液中。
40.根据权利要求14所述的方法，其中所述选定的目的糖缀合物是糖蛋白或糖肽。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述选定的糖蛋白或糖肽是糖蛋白。
42.根据权利要求14所述的方法，其中所述水溶液不含有肼。
43.根据权利要求14所述的方法，其中所述孵育时间是10至约30分钟。
44.根据权利要求14所述的方法，其中孵育所述水溶液的所述温度是70℃-90℃。
45.根据权利要求14所述的方法，其中孵育所述水溶液的所述温度是80℃±5℃。
46.根据权利要求14所述的方法，其中所述容器是多孔板。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述多孔板是96孔板。
48.根据权利要求14所述的方法，所述方法进一步包括分析所述释放的、标记的o-聚糖。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述分析包括通过液相色谱法分离所述释放的、标记的o-聚糖。
50.根据权利要求48所述的方法，进一步其中所述分析包括通过荧光分析所述释放的、标记的、分离的o-聚糖。
51.根据权利要求48所述的方法，进一步其中所述分析包括通过质谱法分析所述释放的、标记的、分离的o-聚糖。
52.根据权利要求48所述的方法，其中所述分析包括通过液相色谱法分离所述释放的、标记的o-聚糖并且通过荧光、紫外光、质谱法或这些中的两种或更多种的组合分析所述释放的、标记的和分离的o-聚糖。
53.一种组合物，所述组合物包含目的糖缀合物和包含以下的溶液：
54.根据权利要求53所述的组合物，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物具有以下结构：
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构3的化合物，并且具有结构1的结构：
56.根据权利要求52所述的组合物，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构4的化合物，并且具有以下结构：
57.根据权利要求53所述的组合物，其中所述溶液含有不超过5％的肼。
58.根据权利要求53所述的组合物，其中所述溶液不含有肼。
59.一种合成1-(4-甲基-7-甲氧基香豆素)-3-甲基-5-吡唑啉酮(“4-mm”)的方法，所述方法包括：
60.根据权利要求59所述的方法，其中步骤(a)中的所述温度是≥40℃≤90℃。
61.根据权利要求59所述的方法，其中步骤(a)中的所述温度是65℃±10℃。
62.根据权利要求59所述的方法，其中步骤(a)中的所述时间是16小时，±4小时。
63.根据权利要求59所述的方法，其中所述溶剂的所述去除是通过旋转蒸发。
64.根据权利要求59所述的方法，其中所述水溶性碳酸盐或碳酸氢盐是碳酸钠或碳酸氢钠。
65.根据权利要求59所述的方法，其中所述极性非质子有机溶剂是四氢呋喃、丙酮或二甲基甲酰胺。
66.根据权利要求59所述的方法，其中所述酸是tfa。
67.根据权利要求59所述的方法，其中在步骤(a)与步骤(c)之间通过以下方式去除过量肼基甲酸叔丁酯：将其用二氯甲烷、乙醚或乙酸乙酯相对于饱和碳酸氢钠从所述粗固体混合物中萃取。
68.根据权利要求59所述的方法，其中步骤(c)中的所述时间是1小时，±0.25小时。
69.根据权利要求59所述的方法，其中步骤(c)中的所述温度是室温，±5℃。
70.根据权利要求59所述的方法，其中步骤(d)中的所述孵育的所述时间是1-24小时。
71.根据权利要求70所述的方法，其中步骤(d)中的所述孵育的所述时间是3-16小时。
72.根据权利要求59所述的方法，其中步骤(d)中的所述孵育的所述温度是室温，±5℃。
73.根据权利要求59所述的方法，其中步骤(e)中的所述ph的所述调节是通过添加乙酸钠、na2co3、nahco3、nh4cl、naoh、hcl或tfa或这些中的任何项的组合。
74.根据权利要求59所述的方法，其中所述乙酰乙酸烃酯选自乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯、乙酰乙酸丙酯、乙酰乙酸丁酯、乙酰乙酸戊酯、乙酰乙酸苄酯或乙酰乙酸苯酯。
75.一种合成1-(4-甲基-7-甲氧基香豆素)-3-甲基-5-吡唑啉酮(“4-mm”)的方法，所述方法包括：
76.根据权利要求75所述的方法，所述方法进一步包括从所述纯化的4-mm中分离4-mm。
77.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(a)中的所述极性非质子有机溶剂是四氢呋喃、丙酮或二甲基甲酰胺。
78.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(b)中的所述溶剂的所述去除是通过旋转蒸发。
79.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(a)中的所述温度是75℃±10℃。
80.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(a)中的所述时间是6小时，±3小时。
81.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(c)中的所述温度是50℃±10℃。
82.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(d)中的所述时间是30分钟，±10小时。
83.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(e)中的所述温度是80℃±10℃。
84.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(e)中的所述时间是16小时，±6小时。
85.根据权利要求75所述的方法，其中在步骤(e)中添加的所述乙酰乙酸烃酯的浓度是20mmol±10mmol。
86.根据权利要求75所述的方法，其中在步骤(e)中添加的所述乙酰乙酸烃酯的浓度是20mmol±5mmol。
87.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(f)的所述合适的有机溶剂是乙酸乙酯、二氯甲烷或二甲醚。
88.根据权利要求76所述的方法，其中所述分离是通过过滤。
89.根据权利要求76所述的方法，其中所述分离是通过旋转蒸发。
90.根据权利要求75所述的方法，其中步骤(e)的所述乙酰乙酸烃酯选自乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸甲酯、乙酰乙酸丙酯、乙酰乙酸丁酯、乙酰乙酸戊酯、乙酰乙酸苄酯或乙酰乙酸苯酯。
91.一种合成化合物1-[7-乙氧基(-4-甲基香豆素)]-3-甲基-5-吡唑啉酮(“7-emcmp”)的方法，所述化合物具有结构4的结构
92.根据权利要求91所述的方法，其中步骤(f)的所述弱碱是na2co3。
93.根据权利要求91所述的方法，所述方法进一步包括步骤(g)，将所述7-emcmp粗产物与乙酸乙酯一起在其沸腾温度下或在接近其沸腾温度下研磨，随后逐滴添加乙醚以沉淀7-emcmp，从而获得纯化的7-emcmp。
94.一种化合物1-[7-(-4-甲基香豆素)]-3-甲基-5-吡唑啉酮(“7-mcmp”)，所述化合物具有以下结构：
95.一种用于释放、用7-mcmp标记以及任选地分析选定的目的糖缀合物上存在的o-聚糖的方法，所述方法包括：在容器中将所述选定的目的糖缀合物在包含7-mcmp的水溶液中在0℃至100℃的温度下孵育约10分钟与23小时之间的时间。
96.根据权利要求95所述的方法，其中所述水溶液进一步包含有效量的碱。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述碱是二甲胺、三乙胺(“tea”)、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化锂和氢氧化铵。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述碱是tea。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述tea以0.5m至5m的浓度存在。
100.根据权利要求95所述的方法，其中所述7-mcmp以0.05m至5m的浓度存在。
101.根据权利要求95所述的方法，其中将所述糖缀合物在所述水溶液中在0℃-100℃的温度下孵育约10分钟与23小时之间的时间。
102.根据权利要求95所述的方法，其中所述选定的目的糖缀合物以4μg与200μg之间的量存在于所述溶液中。
103.根据权利要求95所述的方法，其中所述选定的目的糖缀合物是糖蛋白或糖肽。
104.根据权利要求95所述的方法，其中所述水溶液不含有肼。
105.根据权利要求95所述的方法，其中孵育所述水溶液的所述温度是70℃-90℃。
106.根据权利要求95所述的方法，其中所述容器是多孔板。
107.根据权利要求106所述的方法，其中所述多孔板是96孔板。
108.一种用于释放以及标记存在于目的糖缀合物上的o-聚糖的试剂盒，所述试剂盒包含：
109.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是以下的化合物：
110.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构3的化合物，并且具有结构1的结构：
111.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述发荧光的标记o-聚糖的化合物是结构4的化合物，并且具有以下结构：
112.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述碱是tea。
113.根据权利要求108所述的试剂盒，其中所述碱和所述标签在同一容器的分开的隔室中。
114.根据权利要求108所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含：(d)至少一个o-聚糖标准品。
115.一种用于释放以及标记存在于目的糖缀合物上的o-聚糖的试剂盒，所述试剂盒包含：
116.根据权利要求115所述的试剂盒，其中所述碱是tea。
