本发明涉及一种用基因工程重组技术制作的npq-igg2/fc融合蛋白及其应用，该融合蛋白包含npq多肽和igg2/fc多肽。npq-igg2/fc融合蛋白具有与肝细胞hepg2及胰岛素分泌细胞ins-1特异性结合的能力，并在结合细胞后形成内吞，激活细胞内信号通路。同时，本技术也公开了npq-igg2/fc融合蛋白，通过多靶向作用包括促进肝细胞糖脂代谢，改善胰岛β细胞功能，可以用于治疗肝脏疾病包括脂肪肝，糖尿病及代谢综合征等疾病。
背景技术：
1、神经肽q（neuropeptide q，npq），又称spexin，是一种2007年发现的肽类激素，在内分泌器官和上皮组织中广泛表达。npq成熟肽由14个氨基酸残基组成，作为天然配体结合细胞表面甘丙肽受体2/3（galanin receptor 2/3，galr2/3），激活下游多种信号通路，刺激胰岛素分泌，改善胰岛素抵抗，调节碳水化合物和脂肪代谢稳态，影响包括摄食和能量平衡在内的多种生理功能。此外，npq可能参与调控肾上腺皮质细胞的增殖，影响心血管、肾脏和内分泌系统的功能。npq与许多疾病相关，包括肥胖症、2型糖尿病、脂肪肝（türkel, ibrahim et al. “impact of spexin on metabolic diseases and inflammation: anupdated minireview.” experimental biology and medicine (maywood, n.j.) vol.247,7 (2022): 567-573.），以及焦虑和抑郁等精神性疾病（lv, shuang-yu et al.“emerging roles of npq/spexin in physiology and pathology.” frontiers inpharmacology vol. 10 457. 7 may. 2019）。
2、有研究表明，npq水平下降，与肥胖、衰老、以及心脑血管等其他代谢疾病严重程度相关；注射外源性npq（spexin）在饮食诱导的肥胖（diet induced obesity，dio）小鼠中能够降低食欲减少能量摄入、减低体重、增加运动和脂肪消耗等。另外，外源npq（spexin）能够显著降低肝细胞内脂肪水平、降低谷草转氨酶（ast）和谷丙转氨酶（alt），以及降低dio小鼠的非酒精性脂肪肝和肝纤维化水平；dio小鼠中，npq（spexin）能够降低胰岛素抵抗及糖化血红蛋白水平，增强糖耐受。
3、因此，npq可能成为治疗糖脂代谢异常相关疾病的潜在药物，但是成熟npq仅有14个氨基酸，容易被酶降解，在体内半衰期短（约1小时），限制了其临床应用。因此，迫切需要寻找具有较好疗效和代谢特性的npq类似物。
技术实现思路
1、一方面，本发明提供了一种npq融合蛋白，所述融合蛋白包含npq多肽和免疫球蛋白fc结构域，其中所述npq多肽选自人npq和鼠npq，所述npq多肽与免疫球蛋白fc结构域共价连接，所述免疫球蛋白fc结构域包含或为igg2/fc多肽，所述npq多肽包含seq id no：1或seq id no：2或seq id no：19或seq id no：20的氨基酸序列或与上述序列具有至少90％的序列相同性的氨基酸序列，所述igg2/fc多肽具有seq id no：3或seq id no：4所示的氨基酸序列；所述npq融合蛋白还包含用于连接所述npq多肽和所述免疫球蛋白fc结构域的连接肽，所述连接肽具有选自seq id no：8的氨基酸序列。
2、在一些实施方式中，所述npq融合蛋白进一步被修饰，所述修饰包含n糖基化或o糖基化或氧化或天冬酰胺的琥珀酰亚胺化或天冬酰胺的脱酰胺或羟基化修饰。
3、在一个实施方式中，本发明的npq融合蛋白中，所述igg2/fc多肽还包含选自c222s取代、a330s取代和p331s取代中的一种或两种或三种。
4、在一个实施方式中，所述连接肽还具有选自seq id no：9、seq id no：10、seq idno：11、seq id no：12、seq id no: 13、seq id no: 14、seq id no: 15、seq id no: 16、seq id no: 17和seq id no: 18 中的任一氨基酸序列。
5、在一个实施方式中，本发明的npq融合蛋白具有seq id no：5的氨基酸序列。
6、在一个实施方式中，本发明的npq融合蛋白还包含信号肽。信号肽是在起始密码子后，有一段编码疏水性氨基酸序列，负责把蛋白质引导到细胞内结构或引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的长度约为5-30个氨基酸的肽链。本发明使用多种形式的信号肽。在一个实施方式中，所呈现信号肽包括但不限于人cd33信号肽，或者所述信号肽具有seq idno:6的氨基酸序列。
7、在一个实施方式中，本发明的npq融合蛋白还可以包含酶切位点。
8、在一个实施方式中，本发明的npq融合蛋白中，所述npq融合蛋白还可以进一步被修饰，包含赖氨酸羟基化（hydroxylation）、或甲硫氨酸氧化（oxidation）、或o糖基化（galnac）、或天冬氨酸异构化等修饰的一种或多种。
9、在一个实施方式中，本发明的npq融合蛋白中，所述的n糖基化修饰，其n-糖苷类型为g0f和g1f，优选g0f。
10、在一个实施方式中，本发明的npq融合蛋白中，所述的n糖基化修饰的位点，例如，可以在seq id no:5的第105位的天冬酰胺（n）上；所述的o糖基化修饰的位点，可以在seqid no:5的第15位、或16位、或22位、或27位的丝氨酸（s）上；所述的氧化的位点，可以在seqid no:5的第60位的甲硫氨酸（m）上，或seq id no:5的第7位的甲硫氨酸（m）上，或seq idno:5的第205位的甲硫氨酸（m）上，优选seq id no:5的第65位的甲硫氨酸（m）上；所述的天冬酰胺的琥珀酰亚胺化（succinimide formation）修饰的位点，可以在seq id no:5的123位的天冬酰胺（n）；所述的天冬酰胺的脱酰胺（deamidation）修饰位点，可以在seq id no:5的第123位的天冬酰胺（n）上，或者seq id no:5的第169位的天冬酰胺（n）上；所述的羟基化（hydroxylation）的位点，可以在seq id no:5的第11位的赖氨酸（k）上，也可以在seq idno:5的第225位的色氨酸（w）上。上述修饰还可以在其它合适的位点。
11、另一方面，本发明提供了一种多核苷酸，其包含编码本发明的npq融合蛋白的多核苷酸。
12、在一个实施方式中，本发明的多核苷酸具有seq id no：7的多核苷酸序列或与seqid no：7具有至少约70％的序列相同性的多核苷酸序列。
13、再一方面，本发明提供了一种载体，其包含本发明的多核苷酸。
14、又一方面，本发明提供了一种药物组合物，其包含本发明的npq融合蛋白、或本发明的多核苷酸、或本发明的载体，以及任选的药学上可接受的载体。
15、在一个实施方式中，所述组合物进一步包含缓冲液，包括但不限于磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液。
16、在一个实施方式中，所述组合物进一步包含表面活性剂。合适的表面活性剂包括但不限于吐温80（聚山梨酯 80）、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、泊洛沙姆、卵磷脂、聚乙二醇15-羟基硬脂酸酯、环糊精类等。
17、在一个实施方式中，所述组合物进一步包含辅料。在一个实施例中，所述辅料可以包括甘露醇、山梨醇、麦芽糖醇、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、蔗糖、乳糖、海藻糖、葡聚糖或其混合物。在一些实施方式中，所述辅料可以是选自甘露醇、蔗糖、山梨醇中的一种或多种，优选甘露醇、蔗糖。
18、在一个实施方式中，所述组合物包含npq融合蛋白，配制成制剂，给药剂量为约0.2mg至约40 mg，例如，约0.25 mg、约0.3 mg、约0.35 mg、约0.4 mg、约0.45 mg、约0.5 mg、约0.55 mg、约0.6 mg、约0.65 mg、约0.7 mg、约0.75 mg、约0.8 mg、约0.85 mg、约0.9 mg、约0.95 mg、约1 mg、约1.5 mg、约2 mg、约2.5 mg、约3 mg、约3.5 mg、约4 mg、约4.5 mg、约5mg、约5.5 mg、约6 mg、约7 mg、约7.5 mg、约8 mg、约8.5 mg、约9 mg、约9.5 mg、约10 mg、约11 mg、约12 mg、约13 mg、约14 mg、约15 mg、约16 mg、约17 mg、约18 mg、约19 mg、约20mg、约25 mg、约30 mg、约35 mg、约40 mg的npq融合蛋白。
19、还一方面，本发明提供了本发明的npq融合蛋白、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物为治疗或预防糖代谢或脂代谢紊乱相关的代谢疾病的药物。所述药物组合物可以包括融合蛋白、多核苷酸、载体和细胞等，采用基因疗法进行治疗。
20、在一个实施方式中，本发明的应用中，所述糖代谢或脂代谢紊乱相关的代谢疾病选自糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎（nash）、非酒精性脂肪肝病（nafld）和肥胖症。
21、在一个实施方式中，本发明的应用中，所述糖代谢或脂代谢紊乱相关的代谢疾病是糖尿病，优选2型糖尿病。
22、在一个实施方式中，本发明的应用中，所述npq融合蛋白、所述多核苷酸、所述载体、或所述药物组合物与治疗糖尿病的药物联合应用。所述治疗糖尿病的药物可以是目前已经上市的药物，例如二甲双胍，glp-1受体激动剂或glp-1类似物，以及磺酰脲类主要包括格列美脲、格列本脲、格列齐特、格列喹酮等，α葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖，还包括其它已经上市和正在研发的治疗糖尿病的药物。
23、在一个实施方式中，本发明的应用中，所述npq融合蛋白或所述药物组合物通过肠胃外、静脉、皮下或肌肉内等途径给药。
24、在一个实施方式中，所述融合蛋白或其组合物给药次数可以为每1天一次，每3天一次，或每周一次，或每两周一次等。
25、又一方面，本发明提供了一种重组细胞，所述细胞包含编码本发明的npq融合蛋白的多核苷酸，或包含本发明的多核苷酸，或包含本发明的载体。
26、在一个实施方式中，本发明的重组细胞由中国仓鼠卵巢细胞（cho），特别是cho-s细胞得到。
27、再一方面，本发明提供了一种重组细胞的构建方法，包括：将编码本发明的npq融合蛋白的多核苷酸引入载体中以构建表达载体；将所述表达载体导入细胞以得到重组细胞。
28、在一个实施方式中，本发明的重组细胞的构建方法中，所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞，特别是chos细胞。
29、在一个实施方式中，所述载体可以是pcdna3.1载体。
30、在一个实施方式中，所述重组细胞的构建方法包括以下步骤：
31、将seq id no: 7所示的多核苷酸序列插入pcdna3.1载体中，生成含有所述融合蛋白多核苷酸序列的载体；
32、将表达载体导入cho-s细胞中得到重组细胞。
33、所述步骤还可以包括，筛选重组质粒稳定整合到基因组内的细胞。
34、再一方面，本发明提供了一种生产本发明的npq融合蛋白的方法，包括使用本发明的重组细胞得到npq融合蛋白的步骤。
35、本发明的npq(36-49)-igg2/fc融合蛋白，具有与肝细胞hepg2及胰岛素分泌细胞ins-1特异性结合的能力，并在结合细胞后形成内吞，激活细胞内信号通路。同时，本技术的npq(36-49)-igg2/fc融合蛋白，通过多靶向作用包括促进肝细胞糖脂代谢，改善胰岛β细胞功能，可以用于治疗肝脏疾病包括脂肪肝，糖尿病及代谢综合征等疾病。
36、除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本技术文件（包括所附权利要求）中的参数（例如，数量或条件）的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确（在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似）。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10%，小于或等于5%，小于或等于4%，小于或等于3%，小于或等于2%，小于或等于1%或者小于或等于0.5%的变化。
37、在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或
技术实现要素：
或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
1.一种npq融合蛋白，其特征在于，所述npq融合蛋白包含npq多肽和免疫球蛋白fc结构域，其中所述npq多肽为人npq，所述npq多肽与免疫球蛋白fc结构域共价连接，所述免疫球蛋白fc结构域为igg2/fc多肽，所述npq多肽为seq id no：2所示的氨基酸序列，所述igg2/fc多肽为seq id no：4所示的氨基酸序列；所述npq融合蛋白还包含用于连接所述npq多肽和所述免疫球蛋白fc结构域的连接肽，所述连接肽为seq id no：8所示的氨基酸序列，所述npq融合蛋白包含seq id no：5所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的npq融合蛋白，其特征在于，所述npq融合蛋白进一步被修饰，所述修饰包含n糖基化或o糖基化或氧化或天冬酰胺的琥珀酰亚胺化或天冬酰胺的脱酰胺或羟基化修饰。
3. 根据权利要求1或2所述的npq融合蛋白，其特征在于，所述npq融合蛋白还包含信号肽，所述信号肽是人cd33信号肽，或者所述信号肽具有seq id no:6的氨基酸序列。
4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含编码权利要求1-3中任一项所述的npq融合蛋白的多核苷酸。
5.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求4所述的多核苷酸。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1-3中任一项所述的npq融合蛋白、或权利要求4所述的多核苷酸、或权利要求5所述的载体，以及任选的药学上可接受的载体。
7.一种如权利要求1-3中任一项所述的npq融合蛋白、如权利要求4所述的多核苷酸、如权利要求5所述的载体、如权利要求6所述的药物组合物在制备药物中的应用，所述药物为治疗或预防糖代谢或脂代谢紊乱相关的代谢疾病的药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述糖代谢或脂代谢紊乱相关的代谢疾病选自糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪肝病和肥胖症。
9.一种重组细胞，其特征在于，所述细胞包含如权利要求4所述的多核苷酸，或包含如权利要求5所述的载体。
10.根据权利要求9所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞由cho细胞得到。
