本发明涉及疫苗接种及免疫疗法的领域，尤其涉及癌症免疫疗法。更特别是，本发明涉及在不同mrna的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原。提供包含此类肿瘤抗原的组合物及肽以及编码此类肿瘤抗原的病毒。本发明还涉及此类组合物、肽及病毒在治疗癌症中的用途。
背景技术：
1、免疫系统可识别且在一定程度上消除肿瘤细胞，然而，此抗肿瘤反应通常幅度小且效率低。通过治疗性疫苗接种加强此较弱抗肿瘤反应为癌症疗法的长期探寻目标。调节免疫系统以增强免疫反应因此已成为肿瘤学中有前景的治疗方法，因为其可与标准护理疗法组合。
2、肿瘤细胞通常表达若干抗原，诸如肿瘤相关抗原(taa)、病毒抗原(肿瘤病毒)或突变衍生的抗原(新抗原)。已鉴别在癌细胞中表达的各种taa、病毒抗原或新抗原且用作癌症疫苗的目标。引发肿瘤特异性免疫反应之一种方法为基于肽的癌症疫苗接种，其涉及根据肿瘤的性质施用taa、病毒抗原或新抗原衍生以治疗癌症。
3、虽然肿瘤相关抗原通常亦存在于正常细胞上，但肿瘤特异性抗原仅存在于肿瘤细胞上。肿瘤特异性抗原包括突变衍生的抗原以及来源于隐蔽开放阅读框和/或框移突变的抗原。此类抗原可通过免疫系统识别为外来抗原，且因此在动物肿瘤模型及癌症患者中驱动抗肿瘤免疫反应。然而，具有肿瘤特异性突变的新抗原通常需要针对个别患者定制的疫苗，这是繁琐及成本较高的。最近，所谓的“暗抗原”接受逐渐增加的关注，其为在肿瘤中特异性表达的肽，所述肽在先前咸信为“非编码”(诸如mrna的5'utr)的序列区域中编码。
4、由此，本发明的目标为提供在许多患者的肿瘤中特异性表达的新颖肿瘤抗原。此类肿瘤抗原提供肿瘤特异性，但不需要繁琐及成本较高的个人化方法。本发明的其中一个目标还为提供疫苗，具体地可用于异源性-增强免疫(prime-boost)方案中的疫苗，其将此类肿瘤抗原与其他有利特征(诸如多抗原性域)组合。这是尤其相关的，因为各人类具有不同mhc分子集且多个肽的呈现允许在各hla中呈现最佳(最高亲和力)肽。
5、此目标通过下文及随附权利要求书中所示的主题的方式来达成。
6、虽然下文详细描述本发明，但应理解本发明不限于本文所描述的特定方法、方案及试剂，因为这些可以变化。也应理解，本文所用的术语不意欲限制本发明的范围，其将仅受限于随附权利要求书。除非另外定义，否则本文中所用的所有技术及科学术语均具有如一般技术者通常了解的相同含义。
技术实现思路
1、在下文中，将描述本发明的要素。这些要素用特定具体实施方案列出，然而，应理解其可以任何方式及任何数量组合以形成额外具体实施方案。各种描述的实施方案及优选具体实施方案不应视为将本发明仅限于明确描述的具体实施方案。本说明书应理解为支持及涵盖将明确描述的具体实施方案与任何数量的所公开和/或优选要素组合的具体实施方案。此外，除非上下文另外指示，否则本技术案中所有所描述的要素的任何排列及组合应视为由本技术案的描述公开。
2、在本说明书及随后的权利要求书中，除非本文另外规定，否则术语“包含(comprise)”及变化形式(诸如“包含(comprises/comprising)”)应理解为暗示包括所陈述成员、整体或步骤但不排除任何其他非陈述的成员、整体或步骤。术语“由…组成(consistof)”为术语“包含”的特定具体实施方案，其中排除任何其他非陈述成员、整体或步骤。在本发明的上下文中，术语“包含”涵盖术语“由...组成”。因此，术语“包含”涵盖“包括”以及“由…组成”，例如“包含”x的组合物可仅由x组成，或可包括额外某物，例如x+y。
3、除非本文中另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其在权利要求书的上下文中)所使用的术语“一(a/an)”及“该”以及类似参考应解释为包括单数及复数二者。本文中值的范围的叙述仅仅意欲充当个别地提及处于该范围内的各单独值的简写方法。除非本文中另外指明，否则将各个别值并入至本说明书中，该引用程度就如同其在本文中个别地叙述一般。本说明书中的任何语言不应解释是指示实施本发明所必需的任何未主张要素。
4、词或词组“实质上”不排除“完全”，例如“实质上不含”y的组合物可完全不含y。必要时，可自本发明的定义忽略词语“实质上”。
5、关于数值x的术语“约”意为x±10％。
6、在整个本说明书中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”及这些术语的变化形式可互换使用。这些术语是指肽、寡肽或包括融合蛋白的蛋白质，其包含至少两个优选通过(“正常”)肽键彼此接合的氨基酸。替代地，氨基酸可通过经修饰的肽键彼此接合，诸如(例如)在等排肽的情况下。因此，如本文所使用，术语“肽”是指较短(寡聚)肽以及较长(多肽)及蛋白质，与其长度无关。典型地由选自由基因密码定义的通过正常肽键彼此连接的20个氨基酸的氨基酸构成的“经典”肽为优选的。然而，除这些氨基酸外，肽亦可包含除由基因密码定义的20个氨基酸以外的氨基酸，或其可由除由基因密码定义的20个氨基酸以外的氨基酸构成。在一些具体实施方案中，肽可由通过天然方法(诸如翻译后成熟方法)或通过化学方法(本领域技术人员所熟知)修饰的氨基酸构成。修饰可出现在肽中的任何地方：在肽骨架中、在氨基酸链中或甚至在肽的羧基端或氨基端处。因此，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”亦包括经修饰的肽、多肽及蛋白质。举例而言，肽修饰可包括乙酰化、酰化、adp核糖基化、酰胺化、核苷酸或核苷酸衍生物的共价固定、脂质或脂质衍生物的共价固定、磷脂酰肌醇的共价固定、共价或非共价交联、环化、双硫键形成、去甲基化、糖基化(包括聚乙二醇化)、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白水解方法、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒酰化(seneloylation)、硫酸酯化、氨基酸添加(诸如精氨酰化)或泛素化。
7、如本文所使用，(亦即，在整个本技术案中)，术语“序列变体”是指参考序列中的任何改变。术语“序列变体”包括核苷酸序列变体及氨基酸序列变体。优选地，参考序列为“序列及seq id编号表”(序列表)中列出的序列中的任一者，亦即seq id no:1至seq id no:51。具体地，序列变体与参考序列共享(在序列的全长上)至少70％或至少75％、优选至少80％或至少85％、更优选地至少90％或至少95％、甚至更优选至少97％或至少98％、尤其优选至少99％序列同一性。序列同一性可如下文所描述计算。特别是序列变体通常保留参考序列的特定功能。在一些具体实施方案中，氨基酸序列变体具有改变的序列，其中参考序列中的一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)氨基酸缺失或经取代，或一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个)氨基酸插入至或添加至参考氨基酸序列的序列中。作为改变的结果，氨基酸序列变体具有与参考序列至少70％或至少75％、优选至少80％或至少85％、更优选地至少90％或至少95％、甚至更优选至少97％或至少98％、尤其优选至少99％一致的氨基酸序列。举例而言，至少90％一致的变体序列每100个参考序列氨基酸具有不超过10个改变，亦即缺失、插入或取代的任何组合。当然，相同的亦类似地应用于核酸序列。
8、对于不具有确切对应性的(氨基酸或核酸)序列，可相对于第二序列确定第一序列的“一致性％”。一般而言，可将待比较的此两个序列比对以得到所述序列之间的最大相关性。此可包括在一或两个序列中插入“间隙”以增强比对程度。接着可在尤其适用于具有相同或类似长度的序列的所比较的序列中的各者的全长上(所谓的整体比对)或在更适用于不相等长度的序列的较短限定长度上(所谓的局部比对)确定一致性％。用于比较两个或更多个序列之一致性及同源性的方法为本领域所熟知。两个序列一致的百分比可例如使用数学算法确定。可使用的数学算法的优选但非限制实施方案为karlin等人(1993),pnas usa,90:5873-5877的算法。此类算法整合于blast程序家族中，例如blast或nblast程序(亦参见altschul等人,1990,j.mol.biol.215,403-410或altschul等人(1997),nucleic acidsres,25:3389-3402，可通过全球信息网网站ncbi.nlm.nih.gov的ncbi的首页访问)及fasta(pearson(1990),methods enzymol.183,63-98；pearson及lipman(1988),proc.natl.acad.sci.u.s.a 85,2444-2448.)。
9、一般而言，优选保守地进行对参考氨基酸序列中存在的一个或多个氨基酸的取代。保守取代的实施方案包括一个脂族残基经另一个取代，诸如ile、vai、leu或ala彼此取代，或一个极性残基经另一个取代，诸如在lys与arg；glu与asp；或gln与asn之间。熟知其他此类保守取代，例如具有类似疏水性特性的全部区域的取代(kyte及doolittle,1982,j.mol.biol.157(1):105-132)。将一个或多个l-氨基酸经一个或多个d-氨基酸取代视为在本发明的情形中的保守取代。例示性氨基酸取代呈现下表1中：
10、 原始残基 取代实例 ala(a) val、leu、ile、gly arg(r) his、lys asn(n) gln asp(d) glu cys(c) ser gln(q) asn glu(e) asp gly(g) pro、ala his(h) lys、arg ile(i) leu、val、met、ala、phe leu(l) ile、val、met、ala、phe lys(k) arg、his met(m) leu、ile、phe phe(f) leu、val、ile、tyr、trp、met pro(p) ala、gly ser(s) thr thr(t) ser trp(w) tyr、phe tyr(y) trp、phe 原始残基 取代实例 val(v) ile、met、leu、phe、ala
11、(表1)
12、如本文所使用，“抗原”为充当适应性免疫反应的受体的目标，具体地充当抗体、t细胞受体和/或b细胞受体的目标的任何结构物质。优选地，抗原为肽(包括多肽及蛋白质)。“表位”(也称为“抗原决定子”)为通过免疫系统，具体地通过抗体、t细胞受体和/或b细胞受体识别的抗原的部分(或片段)。因此，一个抗原具有至少一个表位，亦即单个抗原具有一个或多个表位。在本发明的情形下，术语“表位”主要用于表示呈现于抗原呈递细胞的表面上的t细胞表位，其中其与主要组织兼容复合体(mhc)结合。对于肽抗原，通过mhc i类分子呈现的t细胞表位典型地(但非排他地)为长度在8与11个氨基酸之间的肽，而mhc ii类分子呈现较长肽，一般(但非排他地)长度在12与25个氨基酸之间。
13、如本文所使用，术语“cd4+表位”或“cd4+限制性表位”表示通过cd4+t细胞识别的表位，该表位具体地由位于mhc ii类分子的凹槽中的抗原片段组成。单个cd4+表位优选由约12至25个氨基酸组成。其亦可由例如约8至25个氨基酸或约6至100个氨基酸组成。
14、如本文所使用，术语“cd8+表位”或“cd8+限制性表位”表示通过cd8+t细胞识别的表位，该表位具体地由位于mhc i类分子的凹槽中的抗原片段组成。单个cd8+表位优选由约8至11个氨基酸组成。其亦可由例如约8至15个氨基酸或约6至100个氨基酸组成。
15、如本文所使用，抗原的“片段”通常具有8个氨基酸的最小长度，亦即该片段包含抗原的至少8个连续氨基酸，优选抗原的至少10个连续氨基酸，更优选抗原的至少15个连续氨基酸，甚至更优选抗原的至少20个连续氨基酸，再更优选抗原的至少25个连续氨基酸且最佳抗原的至少30个连续氨基酸。抗原片段通常包含一个或多个表位。因此，抗原的片段典型地为免疫原性的。抗原(或其片段)的“序列变体”通常具有与参考序列至少70％或至少75％、优选至少80％或至少85％、更优选至少90％或至少95％、甚至更优选至少97％或至少98％、尤其优选至少99％一致的(氨基酸)序列。在抗原/抗原片段的情形下，“功能性”序列变体意为例如由抗原(片段)包含的表位的功能不会减弱或消除。换言之，抗原(片段)的“功能”序列变体为免疫原性的，其优选具有与参考抗原(片段)实质上相同的免疫原性。在一些具体实施方案中，例如包含于肿瘤抗原(片段)中的一个或多个表位的氨基酸序列未突变且因此与(天然存在的)参考表位序列一致。
16、应了解，鉴于待治疗的疾病，熟练技术人员通常选择抗原或其片段。因此，抗原或抗原性表位通常与待治疗的疾病相关联(或与其相关)。在特定疾病的情形下，大量抗原为本领域所已知。举例而言，为治疗肿瘤/癌症，熟练技术人员选择适用于特定类型的肿瘤/癌症的肿瘤抗原(或其片段)。在一些具体实施方案中，可针对特定抗原(例如，通过使用经分离样本)测试/筛选患者以鉴别癌症/肿瘤是否表达特异性抗原。
17、如本文所使用，“肿瘤抗原”为由癌症/肿瘤细胞产生的抗原。肿瘤抗原包括肿瘤相关抗原及肿瘤特异性抗原。肿瘤相关联(亦肿瘤相关)抗原(taa)为在癌症/肿瘤细胞及正常细胞两者中表达的抗原。相比之下，肿瘤特异性抗原(tsa)为由癌症/肿瘤细胞而非正常细胞特异性表达的抗原。tsa的实施方案包括在癌症/肿瘤出现之前不存在于体内的新抗原，且因此新抗原针对免疫系统为“新”的。新抗原通常归因于体细胞突变。肿瘤抗原的适合表位可例如自癌症/肿瘤表位数据库撷取，例如如vigneron等人2013,cancer immun.13:15；url:http://www.cancerimmunity.org/peptide/中所描述，或自数据库“tantigen”撷取(tantigen版本1.0，2009年12月1日；由丹娜-法伯癌症研究所(dana-farber cancerinstitute)的癌症疫苗中心(cancer vaccine center)处的生物信息核心(bioinformatics core)研发；url:http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/)。
18、如本文所使用，术语“药物组合物”尤其是指制剂，其呈允许活性成分的生物活性明确有效且不含对该调配物所施用的个体有毒的额外组分的此类形式。在一些具体实施方案中，除本文下文所描述的活性组分外，(药物)组合物不含有另一活性组分(例如，关于癌症治疗的“活性”)。
19、如本文所使用，术语“疫苗”是指典型地向特定疾病、优选癌症提供先天性和/或适应性免疫的生物制剂。因此，疫苗尤其支持待治疗的个体的免疫系统的先天性和/或适应性免疫反应。举例而言，如本文所描述的抗原或多抗原性域典型地在待治疗的患者中引起或支持适应性免疫反应，且如本文所描述的tlr肽激动剂可引起或支持先天性免疫反应。
20、如本文所使用，术语“疾病”一般意欲与术语“病症”及“病状”(如同医学病状)同义且可互换使用，这是因为其全部反映人类或动物身体或其部分中之一的损害正常功能的异常病状，典型地由突出的病征及症状体现，且使得人类或动物的存活期减短或生活质量降低。
21、如本文所使用，引用“治疗”个体或患者意欲包括预防、防治、减弱、改善及疗法。术语“个体”或“患者”在本文中可互换地用于意为所有哺乳动物，包括人类。个体的实施方案包括人类、母牛、狗、猫、马、山羊、绵羊、猪及兔。优选地，个体或患者为人类。
22、组合物
23、在第一方面中，本发明提供一种组合物，其包含
24、(i)至少一种肿瘤抗原或其片段或序列变体，
25、其中该肿瘤抗原在kras mrna(kras-uorf1)、tpx2 mrna(tpx2-uorf1)或aurkamrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码；
26、(ii)编码该肿瘤抗原的核酸，或其片段或序列变体；
27、(iii)含有(i)或(ii)的抗原呈递细胞(apc)；或
28、(iv)表达靶向该肿瘤抗原的t细胞受体或car t细胞受体的t细胞。
29、本发明人通过分析所选ribo-seq数据集，例如来自rpfdb v.2.0数据库(wang等人,2019,nucleic acids res.47,d230-d234)来鉴别上游开放阅读框(open readingframe；orf)，亦即在肿瘤抗原的5'-utr(5'-未翻译的区)中编码的orf。由此，本发明人意想不到地鉴别出在kras(基尔斯滕(kirsten)大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物)mrna的5'-utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肽、在tpx2(xklp2的靶向蛋白)mrna的5'-utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肽及在aurka(aurora a激酶)mrna的5'-utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肽作为肿瘤抗原。如随附实施方案中所证实，发现此类kras、tpx2及aurka转录物相比于正常健康组织在肿瘤中大量表达。本发明人亦发现kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2肽内的免疫原性表位及衍生自kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2肽的表位在mhc i类和/或mhc ii类的情形下通过人类树突状细胞呈现。总的这些发现支持kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2肽作为适用于癌症免疫疗法的新颖肿瘤特异性抗原的作用。
30、因此，本发明提供一种组合物，其包含至少一种肿瘤抗原，该肿瘤抗原在krasmrna(kras-uorf1)、tpx2 mrna(tpx2-uorf1)或aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码；或其片段或序列变体。肿瘤抗原典型地为肽肿瘤抗原。这些肿瘤抗原(亦即，在肽水平上)在本文中亦分别称为“kras-uorf1”、“tpx2-uorf1”及“aurka-uorf2”。本领域技术人员将立即自各情形知晓其是指核苷酸或指肽。
31、在一些具体实施方案中，该组合物包含
32、-在kras mrna(kras-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，
33、-在tpx2 mrna(tpx2-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，和/或
34、-在aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体。
35、在一些具体实施方案中，组合物包含在kras mrna(kras-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:1或2的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
36、在一些具体实施方案中，组合物包含在tpx2 mrna(tpx2-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:3或4的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
37、在一些具体实施方案中，组合物包含在aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:5的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
38、除上文所描述的肿瘤抗原以外，组合物可进一步包含至少一种选自由以下项组成的组的肿瘤抗原：ceacam5(或如上文所定义的其片段或序列变体)、duoxa2(或如上文所定义的其片段或序列变体)及kras(或如上文所定义的其片段或序列变体)。相比于如上文所描述的在5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原，如本文中所提及的额外抗原ceacam5、duoxa2及kras为肿瘤抗原，其在mrna(亦即，不在“未翻译的”区域/utr中)的(“经典的”)编码序列(cds)中编码。
39、在一些具体实施方案中，组合物包含ceacam5的片段(癌胚抗原相关细胞黏附分子5)，其可包含根据seq id no:6的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:6的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
40、在一些具体实施方案中，组合物包含ceacam5的片段，其可包含根据seq id no:7的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
41、在一些具体实施方案中，组合物包含ceacam5的片段，其可包含根据seq id no:8的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:8的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
42、在一些具体实施方案中，如上文所描述的ceacam5的片段可彼此连接(尤其作为融合肽/蛋白)。因此，组合物可包含(融合)肽，其包含根据seq id no:9的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
43、在一些具体实施方案中，组合物包含duoxa2的片段(双重氧化酶成熟因子2)，其可包含根据seq id no:10的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
44、在一些具体实施方案中，组合物包含kras的片段。由于kras突变常见于癌症中，所以kras的片段优选包括突变。kras突变可发生于例如kras的g12、g13或q61处。因此，kras的片段可包括kras的位置g12、g13和/或q61，优选其中这些位置处的氨基酸残基中的至少一者经取代。优选地，kras的片段包括g12处的取代。此类取代的非限制性实施方案包括g12d、g12v、g12c、g12a及g12r。优选地，kras的片段包括具有g12d或g12v取代的kras的位置g12。因此，kras或其片段优选为kras-g12d或其片段或kras-g12v或其片段(其中片段包括kras的g12位置及各取代)。
45、在一些具体实施方案中，组合物包含kras的片段，其可包含根据seq id no:11或12的氨基酸序列(或由其组成)。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。组合物亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。
46、优选地，组合物包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含(恰好或至少)两个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含(恰好或至少)三个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含(恰好或至少)四个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含(恰好或至少)五个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含所有六个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。多抗原疫苗将(i)避免抗原缺失变体的过度生长，(ii)靶向非均质肿瘤块内的不同肿瘤细胞及(iii)避开患者间的肿瘤变异性。
47、优选地，组合物包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras-g12d、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras-g12v、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras-g12d、kras-g12v、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。
48、优选地，选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2的肿瘤抗原或其片段或序列变体包含cd4+和/或cd8+表位。
49、在一些具体实施方案中，根据本发明的组合物包含至少一个cd4+表位及至少一个cd8+表位，其可包括于相同或不同肿瘤抗原(或其片段或变体)中。th细胞(cd4+t细胞)在树突状细胞(dc)许可及在肿瘤部位处募集及保持ctl(cd8+t细胞，细胞毒性t淋巴细胞)时在抗肿瘤免疫反应中起主要作用。因此，包含至少一个cd4+表位及至少一个cd8+表位的根据本发明的组合物提供整合的免疫反应，从而允许同时预致敏ctl及th细胞且因此对于针对仅cd8+或仅cd4+表位的免疫性为优选的。
50、优选地，组合物包含(i)不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2；及(ii)不同cd4+表位及不同cd8+表位。此组合物诱导多表位cd8+ctl及cd4+th细胞协同作用以对抗肿瘤细胞且促进有效的抗肿瘤免疫性。th细胞亦参与保持在疫苗接种之后监测的持久细胞免疫。此组合物诱导多克隆、多表位免疫反应及聚功能性cd8+及cd4+t细胞且因此有效的抗肿瘤活性。
51、在一些具体实施方案中，组合物包含肿瘤抗原，其包含氨基酸序列中的至少一者，其中氨基酸序列为
52、-根据seq id no:11的氨基酸序列，或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
53、-根据seq id no:12的氨基酸序列，或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
54、-根据seq id no:1的氨基酸序列，或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:2的氨基酸序列，或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
55、-根据seq id no:3的氨基酸序列，或与seq id no:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:4的氨基酸序列，或与seq id no:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
56、-根据seq id no:5的氨基酸序列，或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
57、-根据seq id no:9的氨基酸序列，或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；和/或
58、-根据seq id no:10的氨基酸序列，或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
59、在一些具体实施方案中，该组合物包含
60、-包含根据seq id no:11的氨基酸序列或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原；
61、-包含根据seq id no:12的氨基酸序列或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原；
62、-包含根据seq id no:1的氨基酸序列或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原，或包含根据seq id no:2的氨基酸序列或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原；
63、-包含根据seq id no:3的氨基酸序列或与seq id no:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原，或包含根据seq id no:4的氨基酸序列或与seq id no:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原；
64、-包含根据seq id no:5的氨基酸序列或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原；
65、-包含根据seq id no:9的氨基酸序列或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原；和/或
66、-包含根据seq id no:10的氨基酸序列或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)的肿瘤抗原。
67、应了解，肿瘤抗原(或其片段或变体)优选作为肽包含于组合物中，如上文所描述。替代地(或另外)，组合物可包含编码肿瘤抗原(或其片段或变体)的核酸，如上文所描述。
68、核酸优选包含单链、双链或部分双链核酸，其优选选自基因组dna、cdna、rna、sirna、反义dna、反义rna、核酶、具有或不具有表达组件的互补rna/dna序列、微型基因、基因片段、调控元件、启动子及其组合。核酸(分子)和/或聚核苷酸的其他优选实施方案包括例如如上文所描述的重组聚核苷酸、载体、寡核苷酸、rna分子(诸如rrna、mrna、微小rna、sirna或trna)或dna分子。因此优选地，核酸(分子)为dna分子或rna分子；优选选自基因组dna；cdna；sirna；rrna；mrna；反义dna；反义rna；核酶；互补rna和/或dna序列；具有或不具有表达组件、调控元件和/或启动子的rna和/或dna序列；载体；及其组合。
69、在一些具体实施方案中，该组合物包含
70、-编码kras-uorf1的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:37的聚核苷酸序列，或与seq id no:37的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
71、-编码tpx2-uorf1的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:38的聚核苷酸序列，或与seq id no:38的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
72、-编码aurka-uorf2的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:39的聚核苷酸序列，或与seq id no:39的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
73、-编码ceacam5的片段的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:40的聚核苷酸序列，或与seq id no:40的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
74、-编码ceacam5的片段的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:41的聚核苷酸序列，或与seq id no:41的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
75、-编码ceacam5的片段的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:42的聚核苷酸序列，或与seq id no:42的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
76、-编码duoxa2的片段的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:43的聚核苷酸序列，或与seq id no:43的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
77、-编码kras-g12d的片段的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:44的聚核苷酸序列，或与seq id no:44的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；和/或
78、-编码kras-g12v的片段的核酸，该核酸优选包含根据seq id no:45的聚核苷酸序列，或与seq id no:45的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
79、组合物可包含一种或多种编码如上文所描述的不同肿瘤抗原(或其片段或变体)，例如2、3、4、5或所有6个如上文所描述的肿瘤抗原(或其片段或变体)的核酸分子。如上文所描述的不同肿瘤抗原(或其片段或变体)可由相同核酸分子(例如以多顺反子方式)或不同核酸分子编码。
80、可替代地(或另外)，组合物可包含含有以下项的抗原呈递细胞(apc)：(i)如上文所描述的肿瘤抗原(或其片段或变体)或(ii)如上文所描述的核酸，其编码肿瘤抗原(或其片段或变体)。在一些具体实施方案中，抗原呈递细胞(apc)可为树突状细胞(dc)。
81、在一些具体实施方案中，apc可装载有如上文所描述的肿瘤抗原(或其片段或变体)，使得apc可呈现肿瘤抗原(或其片段或变体)的一个或多个表位。
82、组合物可包含含有以下项的不同抗原呈递细胞：(i)不同肿瘤抗原(或其片段或变体)；或(ii)不同核酸分子，如上文所描述。然而，单个apc亦可含有(i)不同肿瘤抗原(或其片段或变体)；或(ii)不同核酸分子，如上文所描述。
83、替代地(或另外)，组合物可包含表达靶向肿瘤抗原(或其片段或变体)的t细胞受体或car t细胞受体的t细胞，如上文所描述。在一些具体实施方案中，组合物可包含不同t细胞，其各自表达靶向不同肿瘤抗原(或其片段或变体)的不同t细胞受体或car t细胞受体，如上文所描述。
84、一般而言，组合物可为药物组合物和/或疫苗。具体地，此组合物优选为(药物)组合物，其任选包含药学上可接受的载剂和/或媒剂，或任何赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他物质。
85、作为另一成分，(药物)组合物可尤其包含药学上可接受的载剂和/或媒剂。在本发明的情形下，药学上可接受的载剂典型地包括(药物)组合物的液体或非液体基础。若(药物)组合物以液体形式提供，则载剂将典型地为无热原质水；等张盐水或缓冲(水性)溶液，例如磷酸盐、柠檬酸盐等缓冲的溶液。尤其对于(药物)组合物的注射，可使用水或优选缓冲液，更优选水性缓冲液，其含有钠盐，优选至少30mm钠盐、钙盐，优选至少0.05mm钙盐及任选选用的钾盐，优选至少1mm钾盐。根据一优选具体实施方案，钠盐、钙盐及任选选用的钾盐可以其卤化物(例如氯化物、碘化物或溴化物)的形式，以其氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐或硫酸盐的形式等存在。不限于此，钠盐的实施方案包括例如nacl、nai、nabr、na2co3、nahco3、na2so4，任选选用的钾盐的实施方案包括例如kcl、ki、kbr、k2co3、khco3、k2so4，且钙盐的实施方案包括例如cacl2、cai2、cabr2、caco3、caso4、ca(oh)2。此外，前述阳离子的有机阴离子可含于缓冲液中。根据一更优选具体实施方案，适用于如上文所定义的注射目的的缓冲液可含有选自氯化钠(nacl)、氯化钙(cacl2)及任选选用的氯化钾(kcl)的盐，其中可存在除氯化物以外的其他阴离子。cacl2亦可由另一盐(如kcl)替换。典型地，注射缓冲液中的盐以至少30mm氯化钠(nacl)、至少1mm氯化钾(kcl)及至少0.05mm氯化钙(cacl2)的浓度存在。注射缓冲液参照特定参考介质可为高张、等张或低张的，亦即缓冲液参照特定参考介质可具有更高、相同或更低盐含量，其中优选可使用前面提及的盐的此类浓度，其不归因于渗透或其他浓度效应导致细胞损害。参考介质为例如存在于“体内”方法中的液体，诸如血液、淋巴、胞溶质液或其他体液；或例如可用作“体外”方法中的参考介质的液体，诸如常见缓冲液或液体。所述常见缓冲液或液体为熟练人员已知。盐水(0.9％ nacl)及林格氏乳酸盐溶液(ringer-lactate solution)尤其优选作为液体基础。在一些具体实施方案中，(药物)组合物进一步包含精氨酸，诸如l-精氨酸。
86、在此情形下，治疗处方，例如当使用以上(药物)组合物时对剂量等的决定典型地在一般医生及其他医疗医生的职责内，且典型地考虑待治疗的病症、个别患者的病状、递送部位、施用方法及医生已知的其他因素。因此，(药物)组合物典型地包含治疗有效量的活性组分(肿瘤抗原)。(药物)组合物可用于人类且亦用于兽医医疗目的，优选用于人类医疗目的，一般作为(药物)组合物或作为疫苗。
87、在本发明的情形下，适合佐剂和/或免疫调节物质的实施方案包括(corixa)、包括铝化合物的基于铝的矿物质(一般称为明矾)、aso1-4、mf59、磷酸钙、脂质体、伊斯康(iscom)、多聚肌苷酸:聚胞苷酸(polyic)(包括其稳定形式聚iclc(hiltonol))、cpg寡脱氧核苷酸、粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(gm-csf)、脂多糖(lps)、孟塔纳(montanide)、聚乳酸交酯共乙交酯(plg)、鞭毛蛋白(flagellin)、肥皂树皮树皂苷(qs21)、氨基烷基葡萄糖酰胺化合物(例如，rc529)、具有合成寡脱氧核苷酸的双组分抗菌剂肽(例如，ic31)、咪喹莫特(imiquimod)、雷西莫特(resiquimod)、免疫刺激序列(iss)、单磷酰基脂质a(mpla)及成纤维细胞刺激脂肽(fsl1)。
88、适用于组合物、尤其药物组合物及疫苗的情形或其制备的情形的其他物质以及调配物处理技术及类似者为本领域技术人员所已知。
89、肽
90、在另一方面中，本发明提供一种肽，其包含：
91、a)细胞穿透肽；
92、b)多抗原性域，其包含至少一种肿瘤抗原，或其片段或序列变体，
93、其中该肿瘤抗原在kras mrna(kras-uorf1)、tpx2 mrna(tpx2-uorf1)或aurkamrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码；及
94、c)tlr肽激动剂。
95、在本发明的肽中，组分a)至c)通常与肽键共价连接。因此，该肽为重组肽(自然界中未出现)或“融合”肽(其中组分a)至c)与彼此“融合”)。
96、此肽同时提供(i)刺激多表位细胞毒性t细胞介导的免疫性，(ii)诱导th细胞及(iii)促进免疫记忆。由此，根据本发明的肽提供一种有效疫苗，尤其具有改良的抗肿瘤活性的疫苗。
97、多抗原性域
98、本发明的肽包含多抗原性域。如本文所使用，术语“多抗原性域”是指包含至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)不同抗原或至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)不同抗原的片段的域，诸如肽。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含三个或更多个不同抗原或其片段，尤其3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同抗原或其片段。优选地，“多抗原性域”包含至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)不同抗原(的片段)，其中各片段或抗原包含至少一个抗原性表位。更优选地，“多抗原性域”包含至少两个至八个不同抗原(的片段)，其中各片段/抗原包含至少一个抗原性表位。甚至更优选地，“多抗原性域”包含五个或六个不同抗原(的片段)，其中各片段包含至少一个抗原性表位。
99、具体地，不同抗原(的片段)连续定位于多抗原性域中。在一些具体实施方案中，不同抗原(的片段)例如通过肽间隔子或接头(例如，gs接头)彼此连接。间隔子或接头通常既不为组分a)，亦即细胞穿透肽，亦不为组分c)，亦即tlr肽激动剂。在其他具体实施方案中，不同抗原(的片段)彼此直接连接，亦即在无间隔子或接头的情况下。
100、在一些具体实施方案中，多抗原性域中的各抗原或其片段包含至少一个cd4+表位和/或至少一个cd8+表位，其可包括于相同或不同肿瘤抗原(或其片段或变体)中。th细胞(cd4+t细胞)在树突状细胞(dc)许可及在肿瘤部位处募集及保持ctl(cd8+t细胞，细胞毒性t淋巴细胞)时在抗肿瘤免疫反应中起主要作用。因此，包含至少一个cd4+表位及至少一个cd8+表位的多抗原结域提供整合的免疫反应，从而允许同时预致敏ctl及th细胞且因此对于针对仅cd8+或仅cd4+表位的免疫性为优选的。
101、肽的多抗原性域包含至少一种肿瘤抗原，该肿瘤抗原在kras mrna(kras-uorf1)、tpx2 mrna(tpx2-uorf1)或aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码；或如上文所定义的其片段或序列变体。肿瘤抗原典型地为肽肿瘤抗原。这些肿瘤抗原(亦即，在肽含量上)在本文中亦分别称为“kras-uorf1”、“tpx2-uorf1”及“aurka-uorf2”。本领域技术人员将立即自各情形知晓其是指核苷酸和/或指肽。
102、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含
103、-在kras mrna(kras-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，
104、-在tpx2 mrna(tpx2-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，和/或
105、-在aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体。
106、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含在kras mrna(kras-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:1或2的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:1或2的氨基酸序列或其序列变体。
107、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含在tpx2 mrna(uorf-tpx2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:3或4的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:3或4的氨基酸序列或其序列变体。
108、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含在aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:5的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:5的氨基酸序列或其序列变体。
109、除上文所描述的肿瘤抗原以外，多抗原性域可进一步包含至少一种选自由以下项组成的组的肿瘤抗原：ceacam5(或如上文所定义的其片段或序列变体)、duoxa2(或如上文所定义的其片段或序列变体)及kras(或如上文所定义的其片段或序列变体)。
110、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含ceacam5(癌胚抗原相关细胞黏附分子5)(的片段)，其可包含根据seq id no:6的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:6的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:6的氨基酸序列或其序列变体。
111、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含ceacam5(的片段)，其可包含根据seq idno:7的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:7的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:7的氨基酸序列或其序列变体。
112、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含ceacam5(的片段)，其可包含根据seq idno:8的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:8的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:8的氨基酸序列或其序列变体。
113、在一些具体实施方案中，如上文所描述的ceacam5的片段可彼此连接(尤其作为融合肽/蛋白)。因此，多抗原性域可包含(融合)肽，其包含根据seq id no:9的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:9的氨基酸序列或其序列变体。
114、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含duoxa2(双重氧化酶成熟因子2)(的片段)，其可包含根据seq id no:10的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:10的氨基酸序列或其序列变体。
115、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含kras(的片段)。由于kras突变常见于癌症中，所以kras(的片段)优选包括突变。kras突变可发生于例如kras的g12、g13或q61处。因此，kras的片段可包括kras的位置g12、g13和/或q61，优选其中这些位置处的氨基酸残基中的至少一者经取代。优选地，kras的片段包括g12处的取代。此类取代的非限制性实施方案包括g12d、g12v、g12c、g12a及g12r。优选地，kras的片段包括具有g12d或g12v取代的kras的位置g12。因此，kras或其片段优选为kras-g12d或其片段或kras-g12v或其片段(其中片段包括kras的g12位置及各取代)。
116、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含kras的片段，其可包含根据seq id no:11或12的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:11或12的氨基酸序列或其序列变体。
117、因此，多抗原性域可包含至少一个选自由以下项组成的组的氨基酸序列：
118、-根据seq id no:9的氨基酸序列，或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
119、-根据seq id no:12的氨基酸序列，或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
120、-根据seq id no:11的氨基酸序列，或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
121、-根据seq id no:1的氨基酸序列，或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:2的氨基酸序列，或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
122、-根据seq id no:3的氨基酸序列，或与seq id no:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:4的氨基酸序列，或与seq id no:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
123、-根据seq id no:5的氨基酸序列，或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；或
124、-根据seq id no:10的氨基酸序列，或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
125、优选地，多抗原性域包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(恰好或至少)两个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(恰好或至少)三个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(恰好或至少)四个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(恰好或至少)五个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含所有六个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。多抗原疫苗将(i)避免抗原缺失变体的过度生长，(ii)靶向非均质肿瘤块内的不同肿瘤细胞及(iii)避开患者间的肿瘤变异性。
126、优选地，多抗原性域包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras-g12d、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras-g12v、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，组合物包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras-g12d、kras-g12v、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。
127、优选地，选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2的肿瘤抗原或其片段或序列变体包含cd4+和/或cd8+表位。优选地，多抗原性域包含(i)不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2；及(ii)不同cd4+表位及不同cd8+表位。包含此多抗原性域的肽诱导多表位cd8+ctl及cd4+th细胞协同作用以对抗肿瘤细胞且促进有效的抗肿瘤免疫性。th细胞亦参与保持在疫苗接种之后监测的持久细胞免疫。包含此多抗原性域的肽诱导多克隆、多表位免疫反应及多功能cd8+及cd4+t细胞且因此有效的抗肿瘤活性。
128、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(优选由n端至c端的方向)：
129、-ceacam5或其片段或序列变体，
130、-kras或其片段或序列变体，
131、-kras-uorf1或其片段或序列变体，
132、-tpx2-uorf1或其片段或序列变体，
133、-aurka-uorf2或其片段或序列变体，及
134、-duoxa2或其片段或序列变体。
135、优选地，多抗原性域包含(优选由n端至c端的方向)：
136、-根据seq id no:9的氨基酸序列，或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
137、-根据seq id no:11的氨基酸序列，或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，和/或根据seqid no:12的氨基酸序列，或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
138、-根据seq id no:1的氨基酸序列，或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:2的氨基酸序列，或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
139、-根据seq id no:3的氨基酸序列，或与seq id no:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:4的氨基酸序列，或与seq id no:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
140、-根据seq id no:5的氨基酸序列，或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；及
141、-根据seq id no:10的氨基酸序列，或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
142、更优选地，多抗原性域包含根据seq id no:13的氨基酸序列或与seq id no:13的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)。亦更优选地，多抗原性域包含根据seq id no:14的氨基酸序列或与seq id no:14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)。
143、细胞穿透肽
144、细胞穿透肽(cpp)允许有效的递送，亦即转运及装载，尤其多抗原性域进入抗原呈递细胞(apc)中，尤其进入树突状细胞(dc)中且因此进入树突状细胞抗原处理机构。
145、术语“细胞穿透肽”(“cpp”)一般用于表示能够跨质膜转运不同类型的货物分子的短肽，且因此有助于各种分子货物(自纳米尺寸粒子至小化学分子及大dna片段)的细胞摄取。连接至细胞穿透肽的货物分子的“细胞内化”一般意为跨质膜转运货物分子且因此货物分子进入细胞中。视特定情况而定，货物分子可接着在细胞质中释放、导引至细胞内细胞器或在细胞表面处进一步呈现。根据本发明的细胞穿透肽或肽(包含该细胞穿透肽)的细胞穿透能力或内化可通过本领域技术人员已知的标准方法检查，包括活细胞及固定细胞的流式细胞分析技术或荧光显微法、经该肽转导的细胞的免疫细胞化学及免疫印记法(westernblot)。
146、通常，细胞穿透肽(cpp)具有8至50个残基的长度。细胞穿透肽典型地具有含有高相对丰度的带正电氨基酸(诸如赖氨酸或精氨酸)或具有含有交替模式的极性/带电氨基酸及非极性疏水性氨基酸的序列的氨基酸组成。此两种类型的结构分别称为聚阳离子结构或两性结构。细胞穿透肽具有不同大小、氨基酸序列及电荷，但所有cpp均具有能够易位质膜且促进各种分子货物递送至细胞质或细胞的细胞器的共同特征。已发现脑穿透肽在药品中作为药物递送剂在治疗包括癌症的不同疾病及病毒抑制剂以及用于细胞标记及成像的造影剂中的许多应用。在根据本发明的肽中可用作细胞穿透肽(亦即，作为组分a))的各种cpp亦公开于综述：milletti,f.,cell-penetrating peptides:classes,origin,and currentlandscape.drug discov today 17(15-16):850-60,2012中。
147、优选地，包含于本发明的肽中的细胞穿透肽具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：根据seq id no:15、seq id no:21、seq id no:22或seq idno:23的氨基酸序列，或为如上文所描述的其序列变体。
148、在一些具体实施方案中，根据本发明的细胞穿透肽具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：seq id no:15，或与seq id no:15的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
149、在一些具体实施方案中，根据本发明的细胞穿透肽具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：seq id no:21，或与seq id no:21的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
150、在一些具体实施方案中，根据本发明的细胞穿透肽具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：seq id no:22，或与seq id no:22的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
151、在一些具体实施方案中，根据本发明的细胞穿透肽具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：seq id no:23，或与seq id no:23的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
152、这些细胞穿透肽衍生自艾伯斯坦-巴尔病毒(ebv)的“zebra”蛋白。“zebra”(也称为zta、z、eb1或bzlf1)一般是指艾伯斯坦-巴尔病毒(ebv)的碱性亮氨酸拉链(bzip)转录活化因子。不受任何理论束缚，假设这些细胞穿透肽促进货物抗原分别mhc i类及ii类限制呈现至cd8+及cd4+t细胞。因此，此cpp可将多表位肽递送至树突状细胞(dc)，且随后促进ctl及th细胞活化及抗肿瘤功能。此cpp可因此将根据本发明的肽有效递送至抗原呈递细胞(apc)且引起多表位mhc i类及ii类限制呈现。
153、优选地，细胞穿透肽具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：根据seq id no:15的氨基酸序列，或为如上文所描述的其序列变体。
154、本领域技术人员将理解，在不背离本发明的情况下，细胞穿透肽之一级氨基酸序列可进一步经翻译后修饰，诸如通过糖基化或磷酸化。
155、在某些具体实施方案中，除如上文所描述的其氨基酸序列外，细胞穿透肽任选可进一步包含以下项中的任一者或以下项的任何组合：
156、(i)核定位信号(nls)。此类信号为本领域技术人员所熟知且描述于nair等人(2003,nucleic acids res.31(1):397-399)中；和/或
157、(ii)靶向肽，包括肿瘤归巢肽，诸如kapoor等人(2012,plos one 7(4):e35187)中所描述的那些。
158、优选地，细胞穿透肽(直接)连接至多抗原性域且促进多抗原性域的细胞内化。
159、tlr肽激动剂
160、在根据本发明的肽中，tlr肽激动剂允许疫苗靶向树突状细胞以及自佐剂性增加。根据本发明的肽中tlr肽激动剂与cpp及至少一个抗原或抗原性表位的物理连接通过同时刺激内化、代谢且呈现抗原的抗原呈递细胞(具体地，树突状细胞)而提供增强的免疫反应。
161、如本文中所使用，“tlr肽激动剂”为toll样受体(tlr)的激动剂，亦即其结合于tlr且活化tlr，尤其产生生物反应。此外，tlr肽激动剂为如上文所定义的肽。优选地，tlr肽激动剂包含10至150个氨基酸，更优选15至130个氨基酸，甚至更优选20至120个氨基酸，尤其优选25至110个氨基酸，且最佳30至100个氨基酸。
162、toll样受体(tlr)为以胞外、跨膜及胞溶质域为特征的跨膜蛋白。含有具有马蹄形样形状的富亮氨酸重复序列(lrr)的胞外域参与识别衍生自不同微生物的常见分子图案。toll样受体包括tlrs1-10。能够活化tlr受体及其修饰及衍生物的化合物充分记载于本领域。tlr1可通过细菌脂蛋白及其乙酰化形式活化，tlr2可另外由革兰氏阳性细菌糖脂、lps、lp a、lta、菌毛(fimbriae)、外膜蛋白质、来自细菌或宿主的热休克蛋白及分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖活化。tlr3可由dsrna(尤其病毒来源)或由化合物聚(lc)活化。tlr4可由革兰氏阴性lps、lta、来自宿主或细菌来源的热休克蛋白、病毒包衣或包膜蛋白、紫杉醇或其衍生物、含有寡糖及纤维结合蛋白的玻尿酸活化。tlr5可用细菌鞭毛或鞭毛蛋白活化。tlr6可由分支杆菌脂蛋白及b族链球菌热不稳定可溶性因子(gbs-f)或葡萄球菌调节素活化。tlr7可由咪唑喹啉活化。tlr9可由未甲基化cpg dna或染色质-igg复合物活化。
163、优选地，由根据本发明的肽包含的tlr肽激动剂为tlr1、2、4、5、6和/或10的激动剂。tlr在细胞表面(tlr1、2、4、5、6及10)上或在细胞内细胞器的膜上表达，诸如胞内体(tlr3、4、7、8及9)。胞内体受体的天然配体原来为基于核酸的分子(除tlr4以外)。细胞表面表达的tlr1、2、4、5、6及10识别胞外微生物的分子图案(monie,t.p.,bryant,c.e.等人2009:activating immunity:lessons from the tlrs and nlrs.trends biochem.sci.34(11),553-561)。tlr在若干细胞类型上表达，但几乎所有tlr在dc上表达，从而允许这些特定细胞感测所有可能的病原体及危险信号。
164、然而，tlr2、4及5在dc的表面处组成性表达。因此，由根据本发明的肽包含的tlr肽激动剂更优选为tlr2、tlr4和/或tlr5的肽激动剂。甚至更优选地，tlr肽激动剂为tlr2肽激动剂和/或tlr4肽激动剂。
165、tlr2可检测衍生自细菌、病毒、寄生虫及真菌的广泛多种配体。tlr2与广泛且结构上不同范围的配体(包括由微生物及真菌表达的分子)相互作用。
166、优选的tlr2肽激动剂为磷脂结合蛋白ii或其免疫调节片段(具有tlr激动剂功能)，其详细描述于wo 2012/048190 a1及美国专利申请案13/0331546中，具体地，包含根据wo 2012/048190a1的seq id no:7的氨基酸序列或其片段或变体的tlr2肽激动剂为优选的。
167、包含根据seq id no:16或24的氨基酸序列；或其序列变体(其为或与seq id no:16的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或与seq id no:24的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体)或由其组成的tlr2肽激动剂优选作为组分c)，亦即作为由肽包含的tlr肽激动剂。尤其优选地，tlr肽激动剂具有根据seq id no:16的氨基酸序列。
168、多种配体与tlr4相互作用，包括来自明尼苏达沙门氏菌属(salmonellaminnesota)r595(mpla)的单磷酰基脂质a、脂多糖(lps)、甘露聚糖(白色念珠菌(candidaalbicans))、糖肌醇磷脂(锥虫(trypanosoma))、病毒包膜蛋白(rsv及mmtv)及内源性抗原，包括纤维蛋白原及热休克蛋白。优选的tlr4肽激动剂对应于结合于tlr4的模体，具体地(i)模拟天然lps配体(rs01：gln-glu-ile-asn-ser-ser-tyr及rs09：ala-pro-pro-his-ala-leu-ser)的肽及(ii)纤维结合蛋白衍生肽。细胞糖蛋白纤维结合蛋白(fn)具有通过三个外显子的替代性剪接由单个基因产生的多种同功异构物。这些同功异构物中之一为额外域a(eda)，其与tlr4相互作用。因此，适合tlr肽激动剂包含纤维结合蛋白eda域或其片段或变体。此类适合纤维结合蛋白eda域或其片段或变体公开于ep 1 913 954b1、ep 2 476 440a1、us2009/0220532 a1及wo 2011/101332 a1中。
169、在一些具体实施方案中，根据本发明的肽包含
170、a)细胞穿透肽，其具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：根据seq id no:15、seq id no:21、seq id no:22或seq id no:23的氨基酸序列；或其具有至少70％序列同一性的序列变体；
171、b)多抗原性域，其包含：
172、-ceacam5的片段，其具有8个氨基酸的最小长度，
173、-duoxa2的片段，其具有8个氨基酸的最小长度，
174、-kras的片段，其具有8个氨基酸的最小长度，
175、-kras-uorf1或其具有8个氨基酸的最小长度的片段，
176、-tpx2-uorf1或其具有8个氨基酸的最小长度的片段，和/或
177、-aurka-uorf2或其具有8个氨基酸的最小长度的片段；
178、及
179、c)tlr肽激动剂，其为tlr2肽激动剂和/或tlr4肽激动剂。
180、肽的不同组分a)、b)及c)可直接地或间接地连接(例如，通过肽键)。换言之，两种组分可直接邻接或其可通过肽的额外组分连接，例如肽间隔子或接头。优选地，肽间隔子由约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸、更优选约1、2、3、4或5个氨基酸组成。肽间隔子的氨基酸序列可与组分a)、b)或c)中的任一者的n端或c端侧接区域一致。替代地，肽间隔子可由非天然氨基酸序列组成，诸如由所述天然侧接区域的保守氨基酸取代产生的氨基酸序列或蛋白酶的裂解位点的序列。在一些具体实施方案中，肽间隔子不含任何cys(c)残基。在一些具体实施方案中，连接序列含有至少20％、更优选至少40％且甚至更优选至少50％ gly或β-丙氨酸残基。适当的接头序列可容易地由本领域技术人员选择及制备。其可由d和/或l氨基酸构成。
181、优选地，所有三种组分a)、b)及c)经由主链/主链键连接，由此产生肽的主链，该主链包含细胞穿透肽的主链、多抗原性域的主链及tlr肽激动剂的主链。换言之，细胞穿透肽的主链、多抗原性域的主链及tlr肽激动剂的主链任选与其他组分(例如接头或间隔子)一起构成肽的主链。因此，以下组分a)、b)及c)的安排为优选的，其中该优选安排在肽的主链的n端→c端方向上展示如下且其中所有三种组分a)、b)及c)经由主链/主链键连接且可任选通过接头、间隔子或另一种额外组分连接：
182、(α)组分a)(细胞穿透肽)-组分b)(多抗原性域)-组分c)(tlr肽激动剂)；
183、(β)组分c)(tlr肽激动剂)-组分a)(细胞穿透肽)-组分b)(多抗原性域)；
184、(γ)组分a)(细胞穿透肽)-组分c)(tlr肽激动剂)-组分b)(多抗原性域)；
185、(δ)组分c)(tlr肽激动剂)-组分b)(多抗原性域)-组分a)(细胞穿透肽)；
186、(ε)组分b)(多抗原性域)-组分a)(细胞穿透肽)-组分c)(tlr肽激动剂)；或
187、(ζ)组分b)(多抗原性域)-组分c)(tlr肽激动剂)-组分a)(细胞穿透肽)。
188、优选地，多抗原性域位于细胞穿透肽的c端。更优选地，组分a)、b)及c)按以下顺序位于该肽的主链的n端至c端方向上：
189、(α)组分a)-组分b)-组分c)；或
190、(β)组分c)-组分a)-组分b)，
191、其中组分可通过另一组分，尤其通过接头或间隔子连接。
192、本发明的优选例示性肽包含(优选由n端至c端的方向)：
193、a)细胞穿透肽，具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：根据seq id no:15的氨基酸序列，或与seq id no:15的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
194、b)多抗原性域，其包含
195、-根据seq id no:9的氨基酸序列，或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
196、-根据seq id no:11的氨基酸序列，或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，和/或根据seqid no:12的氨基酸序列，或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
197、-根据seq id no:1的氨基酸序列，或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
198、-根据seq id no:3的氨基酸序列，或与seq id no:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
199、-根据seq id no:5的氨基酸序列，或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；及
200、-根据seq id no:10的氨基酸序列，或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；及
201、c)tlr肽激动剂，其具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：根据seq id no:16的氨基酸序列，或与seq id no:16的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
202、在一些具体实施方案中，本发明的肽可包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：根据seq id no:17、seq id no:18、seq id no:46或seq id no:47的氨基酸序列；或与seq id no:17、seq id no:18、seq id no:46或seq id no:47的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。举例而言，本发明的肽可包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：根据seq id no:17、seq id no:18、seq id no:46或seq id no:47的氨基酸序列。优选地，本发明的肽可包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：根据seq id no:17或seq id no:18的氨基酸序列；或与seqid no:17或seq id no:18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。举例而言，本发明的肽可包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：根据seq id no:17或18的氨基酸序列。
203、本发明亦提供一种(药物)组合物，其包含如上文所描述的本发明的肽。(药物)组合物可包含药学上可接受的载剂和/或媒剂，或任何赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他物质。关于此类其他成分，亦即载剂、媒剂、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、佐剂及类似者，以上根据本发明的组合物的详细描述因此适用于包含本发明的肽的(药物)组合物。(药物)组合物典型地包含治疗有效量的活性组分(肽)。(药物)组合物可用于人类且亦用于兽医医疗目的，优选用于人类医疗目的，一般作为(药物)组合物或作为疫苗。
204、本发明亦提供一种核酸(分子)，其包含编码如上文所描述的本发明的肽的聚核苷酸。核酸优选包含单链、双链或部分双链核酸。优选地，核酸(分子)为选自基因组dna、cdna、rna、sirna、mrna、反义dna、反义rna、核酶、互补rna/dna序列。其可(或可不)含有表达组件、微型基因、基因片段、调控元件、启动子及其组合。核酸(分子)和/或聚核苷酸的其他优选实施方案包括例如重组聚核苷酸、载体、寡核苷酸、rna分子(诸如rrna、mrna、微小rna、sirna或trna)或dna分子。因此优选地，核酸(分子)为dna分子或rna分子；优选选自基因组dna；cdna；sirna；rrna；mrna；反义dna；反义rna；核酶；互补rna和/或dna序列；具有或不具有表达组件、调控元件和/或启动子的rna和/或dna序列；载体；及其组合。在一些具体实施方案中，核酸(分子)可为载体，例如用于表达本发明的肽的表达载体。
205、水疱性口炎病毒(vsv)
206、在另一方面中，本发明提供一种重组水疱性口炎病毒(vsv)，其编码包含至少一种肿瘤抗原或其片段或序列变体的多抗原性域，其中该肿瘤抗原在kras mrna(kras-uorf1)、tpx2 mrna(tpx2-uorf1)或aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码。
207、水疱性口炎病毒(vsv)属于弹状病毒(弹状病毒科)且为负股rna病毒。vsv的基因组在编码五种主量蛋白的反义rna分子的单分子上：g蛋白(g)、大蛋白(l)、磷蛋白(p)、基质蛋白(m)及核蛋白(n)。在一些具体实施方案中，水疱性口炎病毒为水泡性口炎印地安那型病毒(vsiv)或水泡性口炎新泽西型病毒(vsnjv)。
208、多抗原性域
209、本发明的vsv为重组vsv，其在肽的情形下包含如上文所定义的多抗原性域。因此，其是指包含至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)不同抗原或至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)不同抗原的片段的域，诸如肽。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含三个或更多个不同抗原或其片段，尤其3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同抗原或其片段。优选地，“多抗原性域”包含至少两个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个)不同抗原(的片段)，其中各片段或抗原包含至少一个抗原性表位。更优选地，“多抗原性域”包含至少两个至八个不同抗原(的片段)，其中各片段/抗原包含至少一个抗原性表位。甚至更优选地，“多抗原性域”包含五个或六个不同抗原(的片段)，其中各片段包含至少一个抗原性表位。
210、具体地，不同抗原(的片段)连续定位于多抗原性域中。在一些具体实施方案中，不同抗原(的片段)例如通过肽间隔子或接头(例如，gs接头)彼此连接。在其他具体实施方案中，不同抗原(的片段)彼此直接连接，亦即在无间隔子或接头的情况下。
211、在一些具体实施方案中，多抗原性域中的各抗原或其片段包含至少一个cd4+表位和/或至少一个cd8+表位，其可包括于相同或不同肿瘤抗原(或其片段或变体)中。th细胞(cd4+t细胞)在树突状细胞(dc)许可及在肿瘤部位处募集及保持ctl(cd8+t细胞，细胞毒性t淋巴细胞)时在抗肿瘤免疫反应中起主要作用。因此，包含至少一个cd4+表位及至少一个cd8+表位的多抗原结域提供整合的免疫反应，从而允许同时预致敏ctl及th细胞且因此对于针对仅cd8+或仅cd4+表位的免疫性为优选的。
212、vsv的多抗原性域包含至少一种肿瘤抗原，该肿瘤抗原在kras mrna(kras-uorf1)、tpx2 mrna(tpx2-uorf1)或aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码；或如上文所定义的其片段或序列变体。肿瘤抗原典型地为肽肿瘤抗原。这些肿瘤抗原(亦即，在肽含量上)在本文中亦分别称为“kras-uorf1”、“tpx2-uorf1”及“aurka-uorf2”。本领域技术人员将立即自各情形告知其是指核苷酸和/或指肽。
213、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含
214、-在kras mrna(kras-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，
215、-在tpx2 mrna(tpx2-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，和/或
216、-在aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体。
217、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含在kras mrna(kras-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:1或2的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:1或2的氨基酸序列或其序列变体。
218、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含在tpx2 mrna(uorf-tpx2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:3或4的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:3或4的氨基酸序列或其序列变体。
219、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含在aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原包含根据seq id no:5的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:5的氨基酸序列或其序列变体。
220、除上文所描述的肿瘤抗原以外，多抗原性域可进一步包含至少一种选自由以下项组成的组的肿瘤抗原：ceacam5(或如上文所定义的其片段或序列变体)、duoxa2(或如上文所定义的其片段或序列变体)及kras(或如上文所定义的其片段或序列变体)。
221、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含ceacam5(癌胚抗原相关细胞黏附分子5)(的片段)，其可包含根据seq id no:6的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:6的氨基酸序列或其序列变体。
222、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含ceacam5(的片段)，其可包含根据seq idno:7的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:7的氨基酸序列或其序列变体。
223、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含ceacam5(的片段)，其可包含根据seq idno:8的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:8的氨基酸序列或其序列变体。
224、在一些具体实施方案中，如上文所描述的ceacam5的片段可彼此连接(尤其作为融合肽/蛋白)。因此，多抗原性域可包含(融合)肽，其包含根据seq id no:9的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:9的氨基酸序列或其序列变体。
225、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含duoxa2(双重氧化酶成熟因子2)(的片段)，其可包含根据seq id no:10的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:10的氨基酸序列或其序列变体。
226、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含kras(的片段)。由于kras突变常见于癌症中，所以kras(的片段)优选包括突变。kras突变可发生于例如kras的g12、g13或q61处。因此，kras的片段可包括kras的位置g12、g13和/或q61，优选其中这些位置处的氨基酸残基中的至少一者经取代。优选地，kras的片段包括g12处的取代。此类取代的非限制性实施方案包括g12d、g12v、g12c、g12a及g12r。优选地，kras的片段包括具有g12d或g12v取代的kras的位置g12。因此，kras或其片段优选为kras-g12d或其片段或kras-g12v或其片段(其中片段包括kras的g12位置及各取代)。
227、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含kras的片段，其可包含根据seq id no:11或12的氨基酸序列(或由其组成)。多抗原性域亦可包含如上文所定义的片段或其序列变体，亦即具有8个氨基酸的最小长度的片段或具有至少70％序列同一性的序列变体。作为肿瘤抗原的功能性优选保持在片段或序列变体中(例如，因为片段或序列变体含有至少一个表位)。因此，多抗原性域优选包含根据seq id no:11或12的氨基酸序列或其序列变体。
228、因此，多抗原性域可包含至少一个选自由以下项组成的组的氨基酸序列：
229、-根据seq id no:9的氨基酸序列，或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
230、-根据seq id no:12的氨基酸序列，或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
231、-根据seq id no:11的氨基酸序列，或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
232、-根据seq id no:1的氨基酸序列，或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:2的氨基酸序列，或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
233、-根据seq id no:3的氨基酸序列，或与seq id no:3的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:4的氨基酸序列，或与seq id no:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
234、-根据seq id no:5的氨基酸序列，或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；或
235、-根据seq id no:10的氨基酸序列，或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
236、优选地，多抗原性域包含不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(恰好或至少)两个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(恰好或至少)三个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(恰好或至少)四个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(恰好或至少)五个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，多抗原性域包含所有六个不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。多抗原疫苗将(i)避免抗原缺失变体的过度生长，(ii)靶向非均质肿瘤块内的不同肿瘤细胞及(iii)避开患者间的肿瘤变异性。
237、优选地，选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2的肿瘤抗原或其片段或序列变体包含cd4+和/或cd8+表位。优选地，多抗原性域包含(i)不同肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2；及(ii)不同cd4+表位及不同cd8+表位。
238、在一些具体实施方案中，多抗原性域包含(优选由n端至c端的方向)：
239、-ceacam5或其片段或序列变体，
240、-kras或其片段或序列变体，
241、-kras-uorf1或其片段或序列变体，
242、-tpx2-uorf1或其片段或序列变体，
243、-aurka-uorf2或其片段或序列变体，及
244、-duoxa2或其片段或序列变体。
245、优选地，多抗原性域包含(优选由n端至c端的方向)：
246、-根据seq id no:9的氨基酸序列，或与seq id no:9的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
247、-根据seq id no:11的氨基酸序列，或与seq id no:11的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，和/或根据seqid no:12的氨基酸序列，或与seq id no:12的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
248、-根据seq id no:1的氨基酸序列，或与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:2的氨基酸序列，或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
249、-根据seq id no:3的氨基酸序列，或与seq id no:2的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:4的氨基酸序列，或与seq id no:4的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
250、-根据seq id no:5的氨基酸序列，或与seq id no:5的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；及
251、-根据seq id no:10的氨基酸序列，或与seq id no:10的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
252、更优选地，多抗原性域包含根据seq id no:19或48的氨基酸序列或与seq id no:19或48的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体(或由其组成)。举例而言，多抗原性域包含根据seq id no:19或48、优选seqid no:19的氨基酸序列(或由其组成)。
253、vsv：其他特征
254、在一些具体实施方案中，水疱性口炎病毒(vsv)为溶瘤水疱性口炎病毒(vsv)。如本文所使用，“溶瘤”病毒是指优先感染及杀死癌细胞的病毒。假设经溶瘤作用破坏的所感染癌细胞释放新感染病毒粒子或病毒体，以靶向“剩余的”癌症/肿瘤。可在熟练技术人员已知的不同分析系统中测试本发明的重组弹状病毒的溶瘤活性(例示性试管内分析由muik等人,cancer res.,74(13),3567-78,2014描述)。应理解，溶瘤vsv可仅感染且溶解特定类型的癌细胞。此外，溶瘤效应可视癌细胞的类型而变化。
255、在一些具体实施方案中，水疱性口炎病毒(vsv)为有复制能力型的。如本文所使用，术语“有复制能力型”或“有复制能力型的病毒”是指含有其基因组内的所有信息以允许其在细胞内复制的病毒。举例而言，本发明的重组水疱性口炎病毒的复制能力可根据tani等人journal of virology,2007年8月,第8601-8612页；或garbutt等人journal ofvirology,2004年5月,第5458-5465页中所公开的方法来评定。优选地，vsv能够在癌细胞内特异性复制。优选地，vsv在肿瘤细胞中特异性复制，所述肿瘤细胞已失去启动抗病毒先天性免疫反应(例如，i型ifn信号传导)且对其响应的能力。肿瘤细胞中的病毒复制导致细胞死亡，且假设引起肿瘤相关抗原的释放、局部发炎及抗肿瘤免疫性的诱导。另一方面，中止复制在“健康细胞”中为优选的，使得vsv可自正常组织快速排除。
256、优选地，在vsv的基因组中，编码糖蛋白g的基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白gp的基因替换，其中lcmv的糖蛋白gp优选包含根据seq id no:25的氨基酸序列或与其至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％一致的其功能性序列变体。因此，水疱性口炎病毒(vsv)且具体地vsv-gp(具有lcmv的gp的重组vsv，例如，如wo2010/040526中所公开的)为优选的。vsv-gp的有利特性包括以下项中的一或多者：极有效及快速的杀伤(<8h)；溶瘤病毒；可全身应用；伴随神经毒性消除的向神经性显著降低；其以溶解方式繁殖；先天性免疫性的强力活化；用于免疫调节货物及抗原的约3kb空间；与来自淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的沙粒状病毒糖蛋白重组；与野生型vsv(vsv-g)相比，在降低神经毒性及对中和抗体反应及补体破坏较不敏感方面的有利安全特征；在肿瘤细胞中特异性复制，所述肿瘤细胞已失去启动抗病毒先天性免疫反应(例如，i型ifn信号传导)且对其响应的能力；“健康细胞”中的中止复制因此自正常组织快速排除；肿瘤细胞中的病毒复制导致细胞死亡，且假设引起肿瘤相关抗原的释放、局部发炎及抗肿瘤免疫性的诱导。
257、在一些具体实施方案中，水疱性口炎病毒(vsv)展现以下特征：
258、-其在其基因组中编码如上文所定义的多抗原性域，
259、-其在其基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(n)、大蛋白(l)、磷蛋白(p)及基质蛋白(m)，
260、-编码该水疱性口炎病毒的糖蛋白g的基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白gp的基因替换，和/或
261、-水疱性口炎病毒的糖蛋白g由lcmv的糖蛋白gp替换。
262、优选地，水疱性口炎病毒(vsv)展现以下特征：
263、-其在其基因组中编码水疱性口炎病毒核蛋白(n)，该水疱性口炎病毒核蛋白(n)包含如seq id no:26中所示的氨基酸，或其具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列变体；
264、-其在其基因组中编码水疱性口炎病毒磷蛋白(p)，该水疱性口炎病毒磷蛋白(p)包含如seq id no:27中所示的氨基酸，或其具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列变体；
265、-其在其基因组中编码水疱性口炎病毒大蛋白(l)，该水疱性口炎病毒大蛋白(l)包含如seq id no:28中所示的氨基酸，或其具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列变体；
266、-其在其基因组中编码水疱性口炎病毒基质蛋白(m)，该水疱性口炎病毒基质蛋白(m)包含如seq id no:29中所示的氨基酸，或其具有至少80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列变体；
267、-其在其基因组中编码水疱性口炎病毒，如上文所定义的多抗原性域，
268、-编码该水疱性口炎病毒的糖蛋白g的基因由编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白gp的基因替换，和/或
269、-该糖蛋白g由lcmv的该糖蛋白gp替换。
270、更优选地，如实施方案43至85中任一项的水疱性口炎病毒(vsv)，且其中其在其基因组中编码
271、-磷蛋白(p)，其包含根据seq id no:27的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体，
272、-核蛋白(n)，其包含根据seq id no:26的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体，
273、-基质蛋白(m)，其包含根据seq id no:29的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体，
274、-大蛋白(l)，其包含根据seq id no:28的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体，
275、-糖蛋白(gp)，其包含根据seq id no:25的氨基酸序列，或与seq id no:25的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，及
276、-多抗原性域，其包含根据seq id no:19的氨基酸序列，或与seq id no:19的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:48的氨基酸序列，或与seq id no:48的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；
277、因此，包含根据seq id no:30的rna序列或如上文所定义的其序列变体(例如，具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列变体)(或由其组成)的包含rna基因组的水疱性口炎病毒(vsv)为尤其优选的。在一些具体实施方案中，包含rna序列(其对应于根据seq id no:49的cdna序列)或如上文所定义的其序列变体(例如，具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列变体)(或由其组成)的包含rna基因组的水疱性口炎病毒(vsv)。
278、本发明亦提供一种(药物)组合物，其包含如上文所描述的本发明的vsv。(药物)组合物可进一步包含药学上可接受的载剂和/或媒剂，或任何赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员熟知的其他物质。关于此类其他成分，亦即载剂、媒剂、赋形剂、缓冲剂、稳定剂、佐剂及类似者，以上根据本发明的组合物的详细描述因此适用于包含本发明的vsv的(药物)组合物。(药物)组合物典型地包含治疗有效量的活性组分(vsv)。(药物)组合物可用于人类且亦用于兽医医疗目的，优选用于人类医药目的，一般作为(药物)组合物或作为疫苗。
279、疫苗、试剂盒及组合
280、在另一方面中，本发明亦提供一种疫苗，其包含
281、(i)如上文所描述的根据本发明的组合物；
282、(ii)如上文所描述的根据本发明的肽；或
283、(iii)如上文所描述的根据本发明的水疱性口炎病毒(vsv)。
284、一般而言，疫苗诱导、支持或增强待治疗的个体或患者的免疫系统的(先天性和/或适应性)免疫反应。举例而言，如本文所描述的抗原(尤其多抗原性域)典型地在待治疗的患者中引起或支持适应性免疫反应。如本文中所描述的肽的tlr肽激动剂可引起或支持先天性免疫反应。
285、疫苗亦可包含如上文关于(药物)组合物所定义的药学上可接受的载体、佐剂和/或媒剂。在疫苗的特定情形下，药学上可接受的载剂的选择原则上由施用疫苗的方式确定。疫苗可例如如上文所描述全身性或局部施用。更优选地，疫苗可通过静脉内、瘤内、皮内、皮下或肌肉内途径施用。疫苗因此优选调配成液体(或有时呈固体)形式。待施用的疫苗的适合量可通过利用动物模型的常规实验来确定。此类模型包括(但不意味着任何限制)兔、绵羊、小鼠、大鼠、狗及非人类灵长类动物模型。优选用于注射的单位剂型包括水、生理食盐水或其混合物的无菌溶液。此类溶液的ph应调节至约7.4。用于注射的适合载剂包括水凝胶、用于控制或延迟释放的装置、聚乳酸及胶原蛋白基质。
286、疫苗可另外含有一种或多种辅助物质以便进一步增加其免疫原性。在一些具体实施方案中，可实现如上文所描述的含有抗原、肽和/或vsv的组合物及可任选含于疫苗中的辅助物质的协同作用。视辅助物质的各种类型而定，在此方面中可考虑各种机制。举例而言，允许树突状细胞(dc)成熟的化合物(例如脂多糖或tnf-α)形成第一类别的适合辅助物质。一般而言，有可能使用以如下方式影响免疫系统的任何药剂作为辅助物质：“危险信号”(lps、gp96等)或细胞因子，诸如gm-csf，其允许由含有如上文所描述的抗原、肽和/或vsv的组合物产生的免疫反应以靶向方式增强和/或影响。尤其优选的辅助物质为进一步促进先天性免疫反应的细胞因子，诸如单核粒细胞激素、淋巴介质、介白素或趋化激素，诸如il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-12、il-13、il-14、il-15、il-16、il-17、il-18、il-19、il-20、il-21、il-22、il-23、il-24、il-25、il-26、il-27、il-28、il-29、il-30、il-31、il-32、il-33、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、gm-csf、g-csf、m-csf、lt-β或tnf-α，生长因子，诸如hgh。
287、优选地，疫苗包含
288、(i)如上文所描述的根据本发明的肽；及
289、(ii)如上文所描述的根据本发明的水疱性口炎病毒(vsv)。
290、在另一方面中，本发明亦提供一种试剂盒，其包含
291、(i)如上文所描述的根据本发明的肽；及
292、(ii)如上文所描述的根据本发明的水疱性口炎病毒(vsv)。
293、在另一方面中，本发明亦提供一种组合，其包含
294、(i)如上文所描述的根据本发明的肽；及
295、(ii)如上文所描述的根据本发明的水疱性口炎病毒(vsv)。
296、一般而言，在本发明的疫苗、试剂盒及组合中，不同组分(i)及(ii)可(a)在相同组合物中或在相同容器中；或(b)以(空间上)单独的方式(例如，在不同组合物或不同容器中)提供。优选地，在本发明的疫苗、试剂盒及组合中，(i)肽及(ii)vsv以单独方式提供，例如在如上文所描述的单独容器或单独组合物中。不同组分(i)及(ii)的单独提供使得能够例如经由不同途径在不同组合物中和/或在不同时间/以不同计划单独施用(i)肽及(ii)vsv。具体地，不同组分(i)及(ii)的单独提供使得能够在异源预致敏-增强免疫方案中使用(i)肽及(ii)vsv。
297、在疫苗、试剂盒或组合中，优选地，在水疱性口炎病毒(vsv)(的基因组)中编码的多抗原性域包含(肿瘤)抗原或其片段或序列变体，其亦含于肽的多抗原性域中。亦优选地，在水疱性口炎病毒(vsv)(的基因组)中编码的多抗原性域包含(肿瘤)抗原、其片段或序列变体中的各者的氨基酸序列，其亦含于肽的多抗原性域中。亦优选地，肽的多抗原性域包含抗原或其片段，其含于在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域中。更优选地，肽的多抗原性域包含(肿瘤)抗原、其片段或序列变体中的各者的氨基酸序列，其含于在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的-抗原域中。
298、此实现有利的异源预致敏-增强免疫方案。异源预致敏-增强免疫技术的原理为当用于同源预致敏-增强免疫方案中时，在相继施用相同抗原载剂或递送系统之后，通过避免针对抗原载剂或递送系统的免疫反应而迫使免疫系统将其反应聚集于特定目标抗原。在异源预致敏增强免疫方案中，第一免疫原的施用预致敏对目标抗原具有特异性的细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，然而，亦发生抗原载剂或递送系统的预致敏。通过施用不相关第二抗原载剂或递送系统，诸如(例如)在“增强免疫”阶段期间的病毒载体，免疫系统面临大量新抗原。由于第二抗原载剂或递送系统亦编码/递送已存在预致敏细胞的目标抗原，因此通过免疫系统产生强记忆反应，从而扩大先前预致敏的ctl，其对目标抗原具有特异性。
299、因此，本发明的疫苗、试剂盒或组合有利地提供在不同情形下的目标抗原，亦即(i)含于本发明的肽中；及(ii)在本发明的vsv中编码，其使得能够使用异源预致敏-增强免疫方案。
300、含于肽的多抗原性域中及在vsv中编码的多抗原性域中的对应抗原(肿瘤)抗原或其片段或序列变体可为如本文所描述的任何抗原(或其片段或变体)。优选地，对应抗原(肿瘤)抗原或其片段或序列变体为选自由以下项组成的组：
301、-在kras mrna(kras-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，
302、-在tpx2 mrna(tpx2-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，
303、-在aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码的肿瘤抗原或其片段或序列变体，
304、-如上文所定义的ceacam5或其片段或序列变体，
305、-如上文所定义的duoxa2或其片段或序列变体，及
306、-如上文所定义的kras或其片段或序列变体。
307、优选地，kras(或其片段或序列变体)为如上文所描述的突变体kras。更优选地，kras(或其片段或序列变体)为kras-g12d(或其片段或序列变体)或kras-g12v(或其片段或序列变体)。
308、在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含肿瘤抗原或其片段或序列变体，其在kras mrna(kras-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码。
309、在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含肿瘤抗原或其片段或序列变体，其在tpx2 mrna(tpx2-uorf1)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码。
310、在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含肿瘤抗原或其片段或序列变体，其在aurka mrna(aurka-uorf2)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码。
311、在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含如上文所定义的ceacam5或其片段或序列变体。
312、在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含如上文所定义的duoxa2或其片段或序列变体。
313、在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含如上文所定义的kras或其片段或序列变体。优选地，kras(或其片段或序列变体)为如上文所描述的突变体kras。更优选地，kras(或其片段或序列变体)为kras-g12d(或其片段或序列变体)或kras-g12v(或其片段或序列变体)。
314、优选地，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含至少一个选自由以下项组成的组的氨基酸序列：
315、-根据seq id no:9的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；
316、-根据seq id no:12的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；
317、-根据seq id no:11的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；
318、-根据seq id no:1或2的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；
319、-根据seq id no:3或4的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；
320、-根据seq id no:5的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；或
321、-根据seq id no:10的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
322、更优选地，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含不同(亦即，超过一个)对应肿瘤抗原或其片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含(恰好或至少)两个对应肿瘤抗原或其对应片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含(恰好或至少)三个对应肿瘤抗原或其对应片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含(恰好或至少)四个对应肿瘤抗原或其对应片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含(恰好或至少)五个对应肿瘤抗原或其对应片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域各自包含所有六个不同对应肿瘤抗原或其对应片段或变体，其选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1及aurka-uorf2。
323、优选地，在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域包含含于肽的多抗原性域中的抗原或其片段或序列变体中的各者的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域包括不包括于肽的多抗原性域中的优选抗原或其片段或序列变体的一个或多个额外氨基酸序列。在其他具体实施方案中，在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域由含于肽的多抗原性域中的抗原或其片段或序列变体中的各者的氨基酸序列组成。
324、在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域包含在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域的抗原或其片段中的各者的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域包括不包括于在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组编码的多抗原性域中的优选抗原或其片段或序列变体的一个或多个额外氨基酸序列。在其他具体实施方案中，肽的多抗原性域由含于在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域中的抗原或其片段或序列变体中的各者的氨基酸序列组成。
325、优选地，在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域可包含(i)kras-g12d或其片段或序列变体；及(ii)kras-g12v或其片段或序列变体，而肽的多抗原性域可包含(i)kras-g12d或其片段或序列变体；或(ii)kras-g12v或其片段或序列变体。因此，在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域可包含(i)根据seq id no:11的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；及(ii)根据seq id no:12的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体，而肽的多抗原性域可包含(i)根据seq id no:11的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；或(ii)根据seq id no:12的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
326、在一些具体实施方案中，肽的多抗原性域可包含(i)kras-g12d或其片段或序列变体；及(ii)kras-g12v或其片段或序列变体，而在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域可包含(i)kras-g12d或其片段或序列变体；或(ii)kras-g12v或其片段或序列变体。因此，肽的多抗原性域可包含(i)根据seq id no:11的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；及(ii)根据seq id no:12的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体，而在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域可包含(i)根据seq id no:11的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；或(ii)根据seq id no:12的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
327、更优选地，在本发明的疫苗、试剂盒或组合中，
328、-肽的多抗原性域包含根据seq id no:13的氨基酸序列，或与seq id no:13的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:14的氨基酸序列，或与seq id no:14的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，及
329、-在水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域包含根据seq id no:19的氨基酸序列，或与seq id no:19的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，或根据seq id no:48的氨基酸序列，或与seqid no:48的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
330、再更优选地，在本发明的疫苗、试剂盒或组合中，
331、-肽包含根据seq id no:17的氨基酸序列，或与seq id no:17的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；根据seqid no:18的氨基酸序列，或与seq id no:18的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；根据seq id no:46的氨基酸序列，或与seq id no:46的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体；或根据seq id no:47的氨基酸序列，或与seq id no:47的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体，及
332、-水疱性口炎病毒(vsv)包含rna基因组，其包含根据seq id no:30的rna序列，或与seq id no:30的氨基酸序列具有至少70％序列同一性，更优选至少75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性中之一的其序列变体。
333、在本发明的疫苗、试剂盒或组合的一些具体实施方案中，水疱性口炎病毒(vsv)包含rna基因组，其包含rna序列(或由其组成)，该rna序列对应于根据seq id no:49的cdna序列，或如上文所定义的其序列变体(例如，具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列变体)。
334、亦优选地，本发明的疫苗、试剂盒或组合进一步包含
335、(iii)pd-1/pd-l1通路的抑制剂。
336、虽然一般而言，pd-1/pd-l1通路的抑制剂可提供(a)于与组分(i)及(ii)中的任一者(肽及vsv)相同的组合物或相同的容器中；或(b)以(空间上)单独的方式提供(例如，在不同组合物或不同容器中)，优选地，在本发明的疫苗、试剂盒及组合中，pd-1/pd-l1通路的抑制剂以单独方式(与(i)肽及(ii)vsv分开)提供，例如在单独容器或在单独组合物中。如本文所使用，术语“抑制剂”包括pd-1/pd-l1通路的降低、减少、阻断及抑制，包括pd-1/pd-l1通路的拮抗剂(及反向激动剂)。
337、一般而言，pd-1/pd-l1通路为本领域熟知的且描述于例如han y,liu d,li l.pd-1/pd-l1 pathway:current researches in cancer.am j cancer res.2020年3月1日；10(3):727-742中。pd-1(计划性细胞死亡蛋白1)及其配体pd-l1(计划性细胞死亡配体1)由于其在癌症免疫逃逸中的作用而为众所周知的。
338、pd-1/pd-l1通路的抑制剂的非限制性实施方案包括派姆单抗(pembrolizumab)(抗pd-1抗体)；纳武单抗(nivolumab)(抗pd-1抗体)；匹地利珠单抗(pidilizumab)(抗pd-1抗体)；西米普利单抗(cemiplimab)(抗pd-1抗体)；pdr-001(抗pd-1抗体)；阿特珠单坑(atezolizumab)(抗pd-l1抗体)；阿维鲁单抗(avelumab)(抗pd-l1抗体)；德瓦鲁单抗(durvalumab)(抗pd-l1抗体)；及如本文所描述的pd1-1、pd1-2及pd1-3(抗pd-1抗体)。因此，pd-1/pd-l1通路的抑制剂可选自由以下项组成的组：派姆单抗；纳武单抗；匹地利珠单抗；西米普利单抗；pdr-001；阿特珠单坑；阿维鲁单抗；德瓦鲁单抗；埃本利单抗(ezabenlimab)；包含含有seq id no:31的氨基酸序列的重链及含有seq id no:32的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-1)；包含含有seq id no:33的氨基酸序列的重链及含有seq idno:34的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-2)；及包含含有seq id no:35的氨基酸序列的重链及含有seq id no:36的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-3)。
339、可使用由li等人(见上文)公开或在临床试验中已知的其他pd-1拮抗剂(诸如amp-224、medi0680(amp-514)、bms-936559、js001-pd-1、shr-1210、bms-936559、tsr-042、jnj-63723283、medi4736、mpdl3280a)来替代或补充上文所提及的拮抗剂。如本文所使用，inn意为亦涵盖具有与源抗体相同或实质上相同的氨基酸序列的所有生物类似抗体，包括但不限于根据美国42usc§262子部分(k)及其他管辖区域的同等规定授权的那些生物类似抗体。
340、抗体pd1-1、pd1-2及pd1-3为包含以下(全长)重链及(全长)轻链序列的抗体：
341、-pd1-1：包含seq id no:31的氨基酸序列的重链及包含seq id no:32的氨基酸序列的轻链；
342、-pd1-2：包含seq id no:33的氨基酸序列的重链及包含seq id no:34的氨基酸序列的轻链；
343、-pd1-3：包含seq id no:35的氨基酸序列的重链及包含seq id no:36的氨基酸序列的轻链。
344、优选地，pd-1/pd-l1通路的抑制剂可选自由以下项组成的组：埃本利单抗；包含含有seq id no:31的氨基酸序列的重链及含有seq id no:32的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-1)；包含含有seq id no:33的氨基酸序列的重链及含有seq id no:34的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-2)；及包含含有seq id no:35的氨基酸序列的重链及含有seq id no:36的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-3)。
345、药物治疗及用途
346、如上文所描述的根据本发明的组合物、如上文所描述的根据本发明的肽、如上文所描述的根据本发明的水疱性口炎病毒(vsv)、如上文所描述的根据本发明的试剂盒、如上文所描述的根据本发明的疫苗或如上文所描述的根据本发明的组合可用于药品中。优选地，如上文所描述的根据本发明的组合物、如上文所描述的根据本发明的肽、如上文所描述的根据本发明的水疱性口炎病毒(vsv)、如上文所描述的根据本发明的试剂盒、如上文所描述的根据本发明的疫苗或如上文所描述的根据本发明的组合为用于治疗癌症。
347、因此，本发明亦提供如上文所描述的根据本发明的组合物、如上文所描述的根据本发明的肽、如上文所描述的根据本发明的水疱性口炎病毒(vsv)、如上文所描述的根据本发明的试剂盒、如上文所描述的根据本发明的疫苗或如上文所描述的根据本发明的组合用于制造用于治疗癌症的药物的用途。
348、在另一方面中，本发明提供一种用于改善、治疗或降低癌症(的发生风险)或用于诱导或增强抗肿瘤反应的方法，该方法包含向有需要的个体施用(有效量的)如上文所描述的根据本发明的组合物、如上文所描述的根据本发明的肽、如上文所描述的根据本发明的水疱性口炎病毒(vsv)、如上文所描述的根据本发明的试剂盒、如上文所描述的根据本发明的疫苗或如上文所描述的根据本发明的组合。
349、优选地，癌症(如以上方法及用途中所提及)为胃肠道(gastrointestinal tract；gi)的癌症。gi癌症的非限制性实施方案包括肛门癌；阑尾癌；胆管癌瘤/胆管癌，具体地肝外胆管癌；胃肠道类癌肿瘤；结直肠癌，具体地结肠癌、直肠癌及转移性结直肠癌；食道癌；胆囊癌；胃癌(gastric cancer/stomach cancer)；胃肠基质肿瘤(gist)；及胰腺癌，诸如胰管腺癌。因此，癌症优选选自由以下项组成的组：肛门癌；阑尾癌；胆管癌瘤/胆管癌，具体地肝外胆管癌；胃肠道类癌肿瘤；结直肠癌，具体地结肠癌、直肠癌及转移性结直肠癌；食道癌；胆囊癌；胃癌(gastric cancer/stomach cancer)；胃肠基质肿瘤gist)；及胰腺癌，诸如胰管腺癌。更优选地，癌症为为选自由以下项组成的组：结肠癌、直肠癌、结直肠癌、转移性结直肠癌、胰腺癌及胰管腺癌。
350、对于所设想的药物治疗，尤其对于癌症的治疗(例如，如上文所描述)，如上文所描述的本发明的肽优选地与如上文所描述的本发明的水疱性口炎病毒(vsv)组合。因此，如上文所描述使用的肽可与如上文所描述的本发明的水疱性口炎病毒(vsv)组合施用。此外，上文所描述使用的水疱性口炎病毒(vsv)可与如上文所描述的本发明的肽组合施用。在此经组合用途中，在包含肽及vsv的本发明的疫苗、试剂盒及组合的情形下，肽的多抗原性域及在vsv中编码的多抗原性域优选如上文详细描述地彼此适应。
351、具体地，如本文所描述的肽及vsv的“组合”或“经组合”用途通常意为用如本文所描述的肽进行的治疗与用如本文所描述的vsv进行的治疗组合。在如上文所描述的本发明的肽及vsv的此经组合用途中(亦即，亦用于如上文所描述的本发明的各疫苗、试剂盒及组合)，肽及水疱性口炎病毒(vsv)中的各者通常施用至少一次。优选地，肽及水疱性口炎病毒(vsv)为连续(不同时)施用。
352、然而，即使一种组分(肽或vsv)不例如在与另一组分相同之一天施用，其治疗计划通常错综复杂。由此，可实现如上文所描述的有利异源预致敏-增强免疫方案。具体地，一种组分(例如，肽)可首先施用(以“预致敏”方式)，而另一组分(例如，vsv)可稍后施用(以“增强免疫”形式)；例如在“预致敏”之后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天或更多周。由此，通常选择预致敏与增强免疫之间的时间间隔，使得可发现强免疫反应。优选地，在施用水疱性口炎病毒(vsv)之前施用肽。因此，在该预致敏-增强免疫方案中，肽可充当“预致敏”且vsv充当“增强免疫”。
353、在一些具体实施方案中，肽施用至少两次，优选在施用vsv之前及之后施用。因此，肽及水疱性口炎病毒(vsv)为以顺序k-v-k施用，其中“k”是指(单次)施用肽且“v”是指(单次)施用vsv。在一些具体实施方案中，重复施用肽。举例而言，肽及水疱性口炎病毒(vsv)可以顺序k-v-k,k-v-k-k、k-v-k-k-k或k-v-k-k-k-k(其中“k”是指肽且“v”是指vsv)施用。在一些具体实施方案中，治疗计划包含单次施用水疱性口炎病毒(vsv)，亦即仅一次施用vsv。
354、在一些具体实施方案中，肽及vsv彼此间隔2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21天，优选彼此间隔约4天至约24天，更优选彼此间隔约10天至约18天，甚至更优选彼此间隔约12天至约16天施用。在一些具体实施方案中，重复施用肽，优选每2至6周一次，更优选每3至5周一次，甚至更优选每4周一次。
355、在一些具体实施方案中，肽的剂量可为约0.5nmol至约10nmol。在一些具体实施方案中，vsv的剂量可为约106tcid50至约1011tcid50。优选地，vsv的剂量可为约107tcid50至约109tcid50，更优选约108tcid50至约109tcid50，或约107tcid50至约108tcid50，更优选地，约1×107tcid50至约1×108tcid50。
356、一般而言，肽及水疱性口炎病毒(vsv)可经由相同施用途径或不同施用途径施用。优选地，施用途径为选自静脉内、皮下及肌肉内施用。优选地，肽及vsv为经由不同施用途径施用。更优选地，肽为皮下施用，且水疱性口炎病毒(vsv)为经静脉内或瘤内，优选经静脉内施用。
357、肽及vsv(亦在如本文中所描述的疫苗、试剂盒及组合中)的(经组合)用途可进一步包含施用pd-1/pd-l1通路的抑制剂，诸如上文所描述的pd-1/pd-l1通路的抑制剂。因此，pd-1/pd-l1通路的抑制剂可选自由以下项组成的组：派姆单抗；纳武单抗；匹地利珠单抗；西米普利单抗；pdr-001；阿特珠单坑；阿维鲁单抗；德瓦鲁单抗；埃本利单抗(ezabenlimab)；包含含有seq id no:31的氨基酸序列的重链及含有seq id no:32的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-1)；包含含有seq id no:33的氨基酸序列的重链及含有seq idno:34的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-2)；及包含含有seq id no:35的氨基酸序列的重链及含有seq id no:36的氨基酸序列的轻链的抗体(pd1-3)。
358、pd-1/pd-l1通路的抑制剂为与肽或水疱性口炎病毒(vsv)同时、相继或交替施用。在一些具体实施方案中，pd-1/pd-l1通路的抑制剂为与肽在同一天和/或交替施用。
1.一种组合物，其包含
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物进一步包含至少一种选自由ceacam5、duoxa2和kras或其片段或序列变体组成的组的肿瘤抗原。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述kras或其片段是kras-g12d或其片段或者kras-g12v或其片段。
4.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中选自ceacam5、duoxa2、kras、kras-uorf1、tpx2-uorf1和aurka-uorf2的所述肿瘤抗原或其片段或序列变体包含cd4+和/或cd8+表位。
5.根据前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述肿瘤抗原包含至少一个氨基酸，其中氨基酸序列为-根据seq id no:9的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体；
6.一种肽，其包含：
7.根据权利要求6所述的肽，其中所述多抗原性域进一步包含至少一种选自由ceacam5或其片段、duoxa2或其片段和kras或其片段组成的组的肿瘤抗原，其中每个片段具有8个氨基酸的最小长度。
8.根据权利要求6或7所述的肽，其中所述多抗原性域包含三个或更多个不同抗原或其具有8个氨基酸的最小长度的片段，特别地包含3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同抗原或其片段。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的肽，其中所述多抗原性域包含
10.根据权利要求6至9中任一项所述的肽，其中所述多抗原性域包含，优选以n端至c端方向：
11.根据权利要求6至10中任一项所述的肽，其中所述kras或其片段是kras-g12d或其片段或kras-g12v或其片段。
12.根据权利要求6至11中任一项所述的肽，其中所述ceacam5的片段包含根据seq idno 6-8中的任一者的氨基酸序列或其具有至少70％序列同一性的序列变体，优选地其中所述多抗原性域包含根据seq id no:9的氨基酸序列或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的肽，其中所述多抗原性域包含至少一种选自由以下氨基酸序列组成的组的氨基酸序列：
14.根据权利要求6至13中任一项所述的肽，其中所述多抗原性域包含，优选以n端至c端方向：
15.根据权利要求6至14中任一项所述的肽，其中所述多抗原性域包含根据seq id no:13或14的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
16.根据权利要求6至15中任一项所述的肽，其中所述细胞穿透肽具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：根据seq id no:15、seq id no:21、seq idno:22或seq id no:23的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
17.根据权利要求6至16中任一项所述的肽，其中所述细胞穿透肽具有包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成的氨基酸序列：根据seq id no:15的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
18.根据权利要求6至17中任一项所述的肽，其中所述tlr肽激动剂为tlr2肽激动剂和/或tlr4肽激动剂。
19.根据权利要求6至18中任一项所述的肽，其中所述tlr肽激动剂包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：根据seq id no:16或24的氨基酸序列；或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
20.根据权利要求6至19中任一项所述的肽，其中
21.根据权利要求6至20中任一项所述的肽，其中所述肽包含，优选以n端至c端方向：
22.根据权利要求6至21中任一项所述的肽，其中所述肽以n端至c端方向包含：
23.根据权利要求6至22中任一项所述的肽，其中所述肽包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：根据seq id no:17、seq id no:18、seq id no:46或seq id no:47的氨基酸序列，优选根据seq id no:17或18的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
24.一种重组水疱性口炎病毒(vsv)，其编码包含至少一种肿瘤抗原或其片段或序列变体的多抗原性域，其中所述肿瘤抗原在kras mrna(kras-uorf)、tpx2mrna(tpx2-uorf)或aurka mrna(aurka-uorf)的5'utr内的5'-上游开放阅读框(uorf)中编码。
25.根据权利要求24所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述多抗原性域进一步包含至少一种选自由以下项组成的组的肿瘤抗原：ceacam5或其片段、duoxa2或其片段及kras或其片段，其中各片段具有8个氨基酸的最小长度。
26.根据权利要求24或25所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述多抗原性域包含三个或更多个不同抗原或其具有8个氨基酸的最小长度的片段，特别是3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个不同抗原或其片段。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述多抗原性域包含
28.根据权利要求24至27中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述多抗原性域包含，优选以n端至c端方向：
29.根据权利要求24至28中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述kras或其片段为kras-g12d或其片段或kras-g12v或其片段。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述ceacam5的片段包含根据seq id no 6-8中任一者的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体，优选地其中所述多抗原性域包含根据seq id no:9的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
31.根据权利要求24至30中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述多抗原性域包含选自由以下氨基酸序列组成的组的氨基酸序列中的至少一者：
32.根据权利要求24至31中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述多抗原性域包含，优选以n端至c端方向：
33.根据权利要求24至32中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述多抗原性域以n端至c端的方向包含：
34.根据权利要求24至33中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述多抗原性域包含根据seq id no:19或seq id no:48的氨基酸序列，优选根据seq id no:19的氨基酸序列，或其具有至少70％序列同一性的序列变体。
35.根据权利要求24至34中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述水疱性口炎病毒(vsv)是溶瘤水疱性口炎病毒(vsv)。
36.根据权利要求24至35中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述水疱性口炎病毒(vsv)是有复制能力型的。
37.根据权利要求24至36中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中编码糖蛋白g的基因被编码淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(lcmv)的糖蛋白gp的基因替换，其中lcmv的糖蛋白gp优选包含根据seq id no:25的氨基酸序列或与其至少80％、85％、90％、95％一致的其功能性序列变体。
38.根据权利要求24至37中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中
39.根据权利要求24至38中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中
40.根据权利要求24至39中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，并且其中所述vsv在其基因组中编码
41.根据权利要求24至40中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述vsv的rna基因组包含以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成：根据seq id no:30的rna序列，或其具有至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列变体。
42.一种疫苗，其包含
43.根据权利要求42所述的疫苗，其中所述疫苗包含
44.一种试剂盒，其包含
45.一种组合，其包含
46.根据权利要求43所述的疫苗、根据权利要求44所述的试剂盒或根据权利要求45所述的组合，其中在所述水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中编码的多抗原性域包含抗原或其片段或序列变体，其包含于所述肽的多抗原性域中。
47.根据权利要求46所述的疫苗、试剂盒或组合，其中编码在所述水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中的多抗原性域包含抗原或其片段或序列变体中的各者的氨基酸序列，其包含于所述肽的多抗原性域中。
48.根据权利要求43所述的疫苗、根据权利要求44所述的试剂盒或根据权利要求45所述的组合，其中所述肽的多抗原性域包含抗原或其片段或序列变体，其包含于编码在所述水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中的多抗原性域中。
49.根据权利要求48所述的疫苗、试剂盒或组合，其中所述肽的多抗原性域包含编码于所述水疱性口炎病毒(vsv)的基因组中的多抗原性域的抗原或其片段或序列变体中的各者的氨基酸序列。
50.根据权利要求43至49中任一项所述的疫苗、试剂盒或组合，其中
51.根据权利要求43至50中任一项所述的疫苗、试剂盒或组合，其中
52.根据权利要求43至51中任一项所述的疫苗、试剂盒或组合，其进一步包含
53.根据权利要求52所述的疫苗、试剂盒或组合，其中所述pd-1/pd-l1通路的抑制剂选自由以下组成的组：派姆单抗(pembrolizumab)；纳武单抗(nivolumab)；匹地利珠单抗(pidilizumab)；西米普利单抗(cemiplimab)；pdr-001；阿特珠单坑(atezolizumab)；阿维鲁单抗(avelumab)；德瓦鲁单抗(durvalumab)；埃本利单抗(ezabenlimab)；包含含有seqid no:31的氨基酸序列的重链及含有seq id no:32的氨基酸序列的轻链的抗体；包含含有seq id no:33的氨基酸序列的重链及含有seq id no:34的氨基酸序列的轻链的抗体；及包含含有seq id no:35的氨基酸序列的重链及含有seq id no:36的氨基酸序列的轻链的抗体。
54.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物、根据权利要求6至23中任一项所述的肽、根据权利要求24至41中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)、根据权利要求42、43及46至53中任一项所述的疫苗、根据权利要求44及46至53中任一项所述的试剂盒或根据权利要求45至53中任一项所述的组合，其供在药品中使用。
55.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物、根据权利要求6至23中任一项所述的肽、根据权利要求24至41中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)、根据权利要求42、43及46至53中任一项所述的疫苗、根据权利要求44及46至53中任一项所述的试剂盒或根据权利要求45至53中任一项所述的组合，其供在治疗癌症中使用。
56.根据权利要求55所述的供使用的组合物、肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述癌症为胃肠道(gi)的癌症。
57.根据权利要求55或56所述的供使用的组合物、肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述癌症为选自由肛门癌；阑尾癌；胆管癌瘤/胆管癌，特别是肝外胆管癌；胃肠道类癌肿瘤；结直肠癌，特别是结肠癌、直肠癌及转移性结直肠癌；食道癌；胆囊癌；胃癌；胃肠基质肿瘤(gist)；及胰腺癌，诸如胰管腺癌组成的组。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的供使用的组合物、肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述癌症为选自由结肠癌、直肠癌、结直肠癌、转移性结直肠癌、胰腺癌及胰管腺癌组成的组。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的供使用的肽，其中所述肽与根据权利要求24至41中任一项的水疱性口炎病毒(vsv)组合施用。
60.根据权利要求54至58中任一项所述的供使用的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述水疱性口炎病毒(vsv)与根据权利要求6至23中任一项所述的肽组合施用。
61.根据权利要求59所述的供使用的肽或根据权利要求61所述的供使用的水疱性口炎病毒(vsv)，其中所述肽和所述水疱性口炎病毒(vsv)为根据权利要求46至51中任一项中所定义的。
62.根据权利要求54至61中任一项所述的供使用的肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述肽和所述水疱性口炎病毒(vsv)各自施用至少一次，优选地所述肽为在施用所述水疱性口炎病毒(vsv)之前施用。
63.根据权利要求54至62中任一项所述的供使用的肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述肽施用至少两次，优选在施用所述水疱性口炎病毒(vsv)之前及之后。
64.根据权利要求54至63中任一项所述的供使用的肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述肽和所述水疱性口炎病毒(vsv)以k-v-k、k-v-k-k、k-v-k-k-k或k-v-k-k-k-k的顺序施用。
65.根据权利要求54至64中任一项所述的供使用的肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述治疗计划包含单次施用所述水疱性口炎病毒(vsv)。
66.根据权利要求54至65中任一项所述的供使用的肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述肽和所述水疱性口炎病毒(vsv)经由相同或不同途径施用，优选静脉内、皮下或肌肉内施用。
67.根据权利要求54至66中任一项所述的供使用的肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述肽为皮下施用，且所述水疱性口炎病毒(vsv)为静脉内或瘤内，优选静脉内施用。
68.根据权利要求54至67中任一项所述的供使用的肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其进一步包含施用pd-1/pd-l1通路的抑制剂，优选如权利要求53中所定义的。
69.根据权利要求68所述的供使用的肽、水疱性口炎病毒(vsv)、疫苗、试剂盒或组合，其中所述pd-1/pd-l1通路的抑制剂为与所述肽或所述水疱性口炎病毒(vsv)同时、相继或交替施用。
70.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物、根据权利要求6至23中任一项所述的肽、根据权利要求24至41中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)、根据权利要求42、43及46至53中任一项所述的疫苗、根据权利要求44及46至53中任一项的试剂盒或根据权利要求45至53中任一项所述的组合用于制造用于治疗癌症的药物的用途。
71.一种用于改善、治疗或降低癌症(发生的风险)或用于诱导或增强抗肿瘤响应的方法，所述方法包括向有需要的个体施用(有效量的)根据权利要求1至5中任一项所述的组合物、根据权利要求6至23中任一项所述的肽、根据权利要求25至41中任一项所述的水疱性口炎病毒(vsv)、根据权利要求42、43及46至53中任一项所述的疫苗、根据权利要求44及46至53中任一项所述的试剂盒或根据权利要求45至53中任一项所述的组合。
