1.本发明涉及蛋白领域，具体涉及一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系及其制备方法。
背景技术：2.胶原蛋白又称胶原，是广泛存在于人体及动物中的主要结构蛋白。是皮肤、肌腱、韧带、软骨等结蹄组织的重要组成，目前已经发现的胶原蛋白已达20多种。胶原蛋白两条α1链和一条α2链通过三螺旋的方式进行组装，具备支撑，修复，营养，保湿，凝血等功能，而且具有高度生物相容性，可降解性，亲和性等优势，在功效化妆品，食品及医疗领域均有重大应用。
3.透明质酸又名玻尿酸，是由d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。透明质酸类物质广泛存在与人体内，具有较高的生物相容性。在调节血管壁通透性，促进伤口愈合，维持渗透压等方面发挥作用。尤其是具有强大的保湿能力，可以结合1000倍自身重量的水分子，被称为“最强保湿剂”。应用在化妆品领域具有保湿，抗皱，维持皮肤光泽的作用。
4.随着物质生活的丰富，人们的对美丽有了更高的需求。近些年来美容产业逐渐被越来越多的人所重视和接受，种类繁多的化妆品逐渐进入消费者的视野。其中，胶原蛋白与透明质酸类物质无疑是化妆品领域及消费者眼中的两大“宠儿”。
5.皮肤真皮层的主要支撑结构为胶原纤维和弹力纤维，胶原蛋白进入体内后不仅能够为自身胶原合成提供原料，同时因为其具有生物活性，还能够激发自身胶原的合成。胶原蛋白还参与到细胞的增殖，粘附，迁移等过程中，对伤口的修复具有强大的促进作用。透明质酸类物质作为生物体内的天然产物，能够为胶原纤维及弹力纤维的修复创造湿润的环境，同时它还有促进伤口愈合，促进血管生成的作用，胶原蛋白和透明质酸类物质协同会加速修复进程，有研究表明两者复配还能够显著提升两者的抗氧化能力。
6.胶原和透明质酸类物质的一系列特性使得人们逐渐开始思考是否可以将两大原料复配使用，从而提升双方的功效，起到协同增效作用。但是透明质酸类物质与胶原蛋白发生沉淀的原因从上世纪就有人提出可能是两者电荷属性不同，但几十年来公开数据显示的能够将透明质酸与胶原蛋白以液体的形态稳定复配的方式屈指可数，他们的相互作用应该还受等电点，ph及离子强度等原因的影响，总之两者稳定复配的原因较为复杂，目前尚无准确定论。
7.在目前市面上宣称胶原和透明质酸类物质复配的化妆品，大部分是使用水解胶原和透明质酸类物质进行复配。水解胶原是胶原的水解产物，因为在高温等极端条件下胶原分子的三螺旋结构发生变化，分解成大小不一的肽链及氨基酸。虽然可以和透明质酸类物质复配，但是却因为三级结构发生了变化从而失去了胶原的生物活性。目前现有的技术中，将胶原和透明质酸类物质混合使用的方法主要有调整ph、交联、添加缓冲体系等方法。
8.cn102492033a公开了一种类人胶原蛋白复合透明质酸类物质获得水凝胶的方式，通过将类人胶原蛋白、透明质酸类物质及β甘油磷酸钠按照一定比例混合，通过控制β甘油
磷酸钠添加量的方式调节ph，获得了较为稳定的注射水凝胶，但是该产品在存在较好机械强度的同时也注定限制了在化妆品领域的应用。
9.cn107189119a公开了一种复合方法，在合适的缓冲体系下，特定浓度胶原和透明质酸类物质复配可以产生较少的聚离子沉淀（《0.5wt%），同时保留了胶原蛋白引导细胞修复的能力及透明质酸类物质的强大保湿性，但是水凝胶的质地及缓冲体系的存在也大大限制了它在医药及化妆品领域的应用。该技术依然存在一定的聚离子沉淀，这也限制了其应用范围。
10.陈旭等在《胶原/透明质酸共混体系的相容性及相互作用研究》一文中也提出一种方法，在高浓度离子存在的情况下，胶原和透明质酸可以复配，但是高浓度的离子环境仍然限制了这种方法的推广应用。
11.cn110075006a公开了通过聚谷氨酸盐的加入解决了ⅱ型胶原蛋白和透明质酸类物质在溶液中产生聚离子型沉淀物的问题，得到了均一稳定的溶液。但是皮肤中胶原蛋白的主要类型为ⅰ型胶原蛋白，ⅱ型胶原蛋白主要由软骨细胞产生，大多存在于软骨及筋腱中，对皮肤的作用效果远远低于ⅰ型胶原蛋白，难以实现皮肤护理作用，并且在我们的研究中发现聚谷氨酸盐的加入并不能避免ⅰ型胶原蛋白和透明质酸类物质生成聚离子型沉淀。
12.开发一种适用性更广，稳定性更佳的ⅰ型胶原蛋白与透明质酸类物质的互溶体系，同时保留ⅰ型胶原蛋白活性，具有非常重要的意义。
技术实现要素：13.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系及其制备方法。
14.本发明所采取的技术方案是：本发明的第一个方面，提供：一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系的制备方法，包括如下步骤：s1) 将透明质酸钠或透明质酸衍生物的至少一种、阳离子纤维素加入液态多元醇中，混合均匀，得到ha醇混合物；s2) 在ha醇混合物逐步加入水，搅拌至混合液澄清，得到改性ha液；s3) 在改性ha液中加入ⅰ型胶原蛋白水溶液，混合均匀，得到胶原蛋白-透明质酸互溶体系。
15.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中透明质酸钠和透明质酸衍生物的总浓度为1～20mg/ml。
16.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中多元醇的浓度为1～200mg/ml。
17.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中阳离子纤维素的浓度为1～100 mg/ml。
18.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中多元醇的浓度为1～200mg/ml，所述改性ha液中阳离子纤维素的浓度为1～100 mg/ml。
19.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中，以透明质酸钠计，透明质酸钠和透明质酸盐的总质量与阳离子纤维素的质量比为1：(0.1～10)。
20.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液与ⅰ型胶原蛋白水溶液的体积比为10：(1
～100)。
21.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中，以透明质酸钠计，透明质酸钠和透明质酸盐的总质量与阳离子纤维素的质量比为1：(0.1～10) ，所述改性ha液与ⅰ型胶原蛋白水溶液的体积比为10：(1～100)。
22.在一些制备方法的实例中，所述透明质酸钠的分子量为1 kda～1000 kda。
23.在一些制备方法的实例中，所述ⅰ型胶原蛋白水溶液的浓度为0.1～10 mg/ml。
24.在一些制备方法的实例中，所述多元醇选自甘油、丙二醇、丁二醇、己二醇、戊二醇、聚乙二醇、甘油聚醚-26中的至少一种。
25.本发明的第二个方面，提供：一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系，按本发明第一个方面所述的制备方法制备得到。
26.本发明的第三个方面，提供：一种组合物，其添加有本发明第二个方面所述的胶原蛋白-透明质酸互溶体系。
27.在一些组合物的实例中，其选自精华液、乳液、膏霜、水剂、面膜液，洗护产品等化妆品或其他皮肤调理剂。
28.本发明的有益效果是：本发明一些实例的制备方法，制备得到的胶原蛋白-透明质酸互溶体系，具有良好的稳定性，不会产生沉淀，该互溶体系中的ⅰ型胶原蛋白组分依然保持其原有的活性。
29.本发明一些实例的制备方法，使用的原料简单，易于制备，制备得到的胶原蛋白-透明质酸互溶体系，可以添加在各种产品中，应用范围更广。
附图说明
30.图1是不同阳离子聚合物对胶原蛋白-透明质酸互溶体系稳定性的影响；图2是不同阳离子纤维素用量对胶原蛋白-透明质酸互溶体系稳定性的影响；图3～图9是不同阳离子纤维素用量胶原蛋白-透明质酸互溶体系的圆二色谱测试结果。
具体实施方式
31.本发明的第一个方面，提供：一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系的制备方法，包括如下步骤：s1) 将透明质酸钠或透明质酸衍生物的至少一种、阳离子纤维素加入液态多元醇中，混合均匀，得到ha醇混合物；s2) 在ha醇混合物逐步加入水，搅拌至混合液澄清，得到改性ha液；s3) 在改性ha液中加入ⅰ型胶原蛋白水溶液，混合均匀，得到胶原蛋白-透明质酸互溶体系。
32.透明质酸的用量可以根据具体应用的不同进行相应的调整。在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中透明质酸钠和透明质酸盐的总浓度为1～20mg/ml。
33.透明质酸类成分易吸水团聚，影响后续的分散溶解。通过先将透明质酸与多元醇混合分散，可以极大方便后续水溶液的配制。多元醇的用量可以根据透明质酸类的用量进
行相应的调整，以可以使透明质酸粉成分分散，后续可以方便溶解在水中为宜。在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中多元醇的浓度为1～200mg/ml。
34.阳离子纤维素的用量可以根据透明质酸类成分的用量进行相应的调整，以可以充分对透明质酸类成分进行改性为宜。在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中阳离子纤维素的浓度为1～100 mg/ml。
35.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中多元醇的浓度为1～200mg/ml，所述改性ha液中阳离子纤维素的浓度为1～100 mg/ml。
36.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中，以透明质酸钠计，透明质酸钠和透明质酸盐的总质量与阳离子纤维素的质量比为1：(0.1～10)。
37.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液与ⅰ型胶原蛋白水溶液的体积比为10：(1～100)。
38.在一些制备方法的实例中，所述改性ha液中，以透明质酸钠计，透明质酸钠和透明质酸盐的总质量与阳离子纤维素的质量比为1：(0.1～10) ，所述改性ha液与ⅰ型胶原蛋白水溶液的体积比为10：(1～100)。
39.透明质酸钠的分子量无特殊要求，可以根据产品的具体需要进行相应的选择。在一些制备方法的实例中，所述透明质酸钠的分子量为1 kda～1000 kda。
[0040]ⅰ型胶原蛋白水溶液的浓度无特殊要求，可以很好分散即可。在一些制备方法的实例中，所述ⅰ型胶原蛋白水溶液的浓度为0.1～10 mg/ml。
[0041]
多元醇为分散溶剂，透明质酸钠粉末遇水会凝结成团，难以溶解。先由多元醇将透明质酸分散，再进行溶解可以避免透明质酸钠遇水凝结成团，将透明质酸钠进行充分溶解，方便下一步操作进行，本身并不对胶原和透明质酸钠的互溶产生影响。因此多元醇的种类本身没有特别的要求，具体的可以根据产品应用领域的差异进行相应的调整。在一些制备方法的实例中，所述多元醇选自甘油、丙二醇、丁二醇、己二醇、戊二醇、聚乙二醇、甘油聚醚-26中的至少一种。这些多元醇是护肤品、化妆品等常用的辅料。
[0042]
本发明的第二个方面，提供：一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系，按本发明第一个方面所述的制备方法制备得到。
[0043]
本发明的第三个方面，提供：一种组合物，其添加有本发明第二个方面所述的胶原蛋白-透明质酸互溶体系。
[0044]
在一些组合物的实例中，其选自精华液、乳液、膏霜、水剂、面膜液等化妆品成品及半成品和皮肤调理剂。
[0045]
本发明的透明质酸(hyaluronan)是指存在于自然界中、具有阴离子且未经硫酸化的葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan)，其包含n-乙酰葡萄糖胺(n-acetylglucosamine)、d-葡萄糖醛酸(d-glucuronic acid)及其衍生物的双醣分子重复单元及其盐。透明质酸的衍生物包括但不限于：透明质酸酯(hyaluronan esters)、经己二酸二酰肼修饰的透明质酸(adipic dihydrazide-modified hyaluronan)、透明质酸胺产物(hyaluronan amide products)、交联透明质酸(cross-linked hyaluronic acid)、琥珀酸半酯(hemiesters of succinic acid)或其金属盐类的透明质酸、部分或整体的透明质酸酯、硫化透明质酸(sulphated hyaluronic acid)、n-硫化透明质酸(n-sulphatedhyaluronic acid)、以及经
胺基或二胺基修饰的透明质酸。
[0046]
下面结合实验，进一步说明本发明的技术方案。
[0047]
实施例1：不同阳离子聚合物对胶原蛋白-透明质酸互溶体系性质的影响：实验方法：1)称取0.5g透明质酸钠及2g阳离子聚合物粉末，于3.5g的甘油中充分搅拌，分散均匀；2)分多次小剂量添加去离子水，200rpm搅拌，定容至50ml；3)均质机6hz处理1min，均匀颗粒物，注意不要打出泡沫；4)水浴，50℃加热5min，200rpm搅拌，使阳离子聚合物与透明质酸钠充分融合；5)溶液逐渐变粘稠，呈现透明或半透明微黄色粘稠液体，得到改性ha溶液；6)冷却至室温后，取25g改性ha溶液与25g
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型胶原蛋白溶液（3.8mg/ml）混合，200rpm搅拌均匀，得到成品，并测试成品的性质，因粘稠无法直接观察稳定性的样品1:5加水稀释后观察。
[0048]
所使用的ⅰ型胶原蛋白溶液外观微白透明，25℃下的粘度为141 cp，ph=3.61；透明质酸钠0.25 wt%的水溶液为无色透明，25℃下的粘度为1025 cp，ph=6.81。
[0049]
实验结果如表1和图1所示：从上述实验结果可知，在测试的阳离子聚合物中，只有阳离子纤维素可以得到稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系，其他的阳离子聚合物均无法得到稳定的互溶体系。
[0050]
实施例2：不同阳离子纤维素用量对胶原蛋白-透明质酸互溶体系的影响参照实施例1的方法，使用不同用量的阳离子纤维素复制得到胶原蛋白-透明质酸互溶体系，结果如表2和图2所示。
[0051]
由表2和图2的结果可知，胶原蛋白-透明质酸互溶体系中，阳离子纤维素用量在2.6 wt%后，反应体系逐渐澄清，超过4 wt%后，进一步增加阳离子纤维素的用量对于体系的澄清度无显著影响，但也不会带来不利影响；阳离子纤维素用量越多，体系的粘度越大。考虑到实际功效和成品对粘度的要求，阳离子纤维素的用量控制在2.6～5.0 wt%较为适宜。
[0052]
实施例3：胶原蛋白-透明质酸互溶体系的圆二色谱测试结果胶原蛋白肽链骨架中的肽键及少量芳香氨基酸残基均具有旋光活性，当平面圆偏振光透过以上光活性基团时，不同手性的两种构型对平面偏振光所分解成的左旋和右旋圆偏振光吸 收不同，从而产生吸收差。吸收差的存在产生了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变为椭圆偏振光，这就是圆二色性。实施例2中不同用量的阳离子纤维素复制得到的胶原蛋白-透明质酸互溶体系的圆二色谱图如图3～图9所示，胶原蛋白的圆二吸收不同于一般蛋白质，其在200nm附近存在负吸收峰，220nm处存在正吸收峰，是典型聚（l-脯氨酸）ⅱ型螺旋结构的圆二吸收特征，而胶原三螺旋结构与聚（l-脯氨酸）ⅱ型螺旋结构的圆二吸收相似，可见，本试验优化条件下制得的混合物中胶原蛋白具有完整的三螺旋结构。
[0053]
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系的制备方法，包括如下步骤：s1)将透明质酸钠或透明质酸衍生物的至少一种、阳离子纤维素加入液态多元醇中，混合均匀，得到ha醇混合物；s2)在ha醇混合物逐步加入水，搅拌至混合液澄清，得到改性ha液；s3)在改性ha液中加入ⅰ型胶原蛋白水溶液，混合均匀，得到胶原蛋白-透明质酸互溶体系。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述改性ha液中：透明质酸钠和透明质酸衍生物的总浓度为1～20mg/ml；和/或多元醇的浓度为1～200mg/ml；和/或阳离子纤维素的浓度为1～100 mg/ml。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述改性ha液中，以透明质酸钠计，透明质酸钠和透明质酸衍生物的总质量与阳离子纤维素的质量比为1：(0.1～10)。4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述改性ha液与ⅰ型胶原蛋白水溶液的体积比为10：(1～100)。5.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述透明质酸钠的分子量为1 kda～1000 kda。6.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述ⅰ型胶原蛋白水溶液的浓度为0.1～10 mg/ml。7.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述多元醇选自甘油、丙二醇、丁二醇、己二醇、戊二醇、聚乙二醇、甘油聚醚-26中的至少一种。8.一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系，其特征在于：按权利要求1～7任一项所述的方法制备得到。9.一种组合物，其特征在于：其添加有权利要求8所述的胶原蛋白-透明质酸互溶体系。10.根据权利要求9所述的组合物，其特征在于：其选自精华液、乳液、膏霜、水剂、面膜液。
技术总结本发明公开了一种稳定的胶原蛋白-透明质酸互溶体系及其制备方法。发明人研究意外发现通过使用阳离子纤维素对透明质酸进行改性，之后再与胶原蛋白溶液混合，得到均匀的互溶体系，该互溶体系具有良好的稳定性，不会产生沉淀，该互溶体系中的Ⅰ型胶原蛋白组分依然保持其原有的活性。可以添加在各种产品中，应用范围更广。围更广。
技术研发人员：权利要求书1页说明书6页附图8页
受保护的技术使用者：广州创尔生物技术股份有限公司
技术研发日：2022.04.25
技术公布日：2022/7/5
