1.本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种黑附球菌发酵产物、制备方法及其应用。
背景技术：2.植物内生菌是一种在植物生命周期的一个时期内寄生在植物体内的微生物，不会诱发疾病症状，也不会产生外在的明显伤害。调查表明，内生菌对寄主植物具有不同的生态功能，如促进植物生长发育、提高植物对病原菌的抗性、协助植物在恶劣条件下的生长发育。此外，有些植物内生菌还产生具有抗菌特性的新次生代谢物，保护植物免受细菌、真菌和昆虫等的侵害。
3.目前，国内外主要利用黑附球菌等植物内生菌孢子菌剂防治植物病虫害。菌剂在田间应用时，其生防效果依赖于菌剂的菌量和活性。因此，菌剂的应用效果受到保存条件、田间环境、植物微生态、自然环境等田间的影响很大，需要在合适的时机和条件下施用。具有较高知识水平的农业技术员可以掌握使用方法，从而达到很好的菌剂施用效果。但基层农民往往受限于知识、精力和经济条件，对菌剂的施用存在看天吃饭的心态。因此活体菌剂因其施用方法复杂，不符合基层农民对简约式、集成式施用的需求。
4.部分生防微生物是依靠产生有活性的代谢产物来抑制病原微生物的发生和扩展，因此，开发微生物发酵液及其制剂是生防菌应用的重要途径。在菌株发酵液制备时，一是要充分考虑开发低成本的生防微生物菌株发酵工艺，二是要开发生态型的微生物发酵液制剂加工工艺。制剂一般开发为水剂、颗粒剂、可湿性粉剂等方便施用的剂型。目前，关于黑附球菌的发酵液及其制剂对植物病害的防治效果的应用未有报道。
技术实现要素：5.鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种黑附球菌发酵产物、制备方法及其应用，可以应用于植物病害的防治，尤其是有效防控小麦赤霉病，具有防控效果好、受环境影响小、施用方法简单和成本低廉等优点。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
7.一种黑附球菌发酵产物，黑附球菌的拉丁文名称为epicoccum nigrum，保藏编号为cgmcc no.40003。本发明提供的黑附球菌，分离自北京市种植的玉米叶片经纯化培养筛选获得，在本发明实施例中将其命名为黑附球菌38l1，于2021年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址为：中国，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.该菌株为发明人意外分离获得，经验证具有拮抗多种病原真菌的优点，例如，对禾谷镰刀菌、灰霉菌、炭疽病菌、灰霉菌、核盘菌等多种病原菌具有优异的抑制作用，具有良好的应用前景。
9.优选地，上述黑附球菌发酵产物不含有黑附球菌菌体(包括菌体产生的孢子)。本
发明首次提出该菌株发酵产物可作为制剂，用来防治镰刀菌引发的小麦赤霉病。与黑附球菌孢子菌剂相比，本发明利用黑附球菌发酵产物及其制剂受环境影响小，具有施用方法简单，成本低廉等优点。通过开发高效的黑附球菌发酵液及其制剂，能够有效防控农业生产病害，并且对环境友好，保障农民稳产增收。
10.目前还没有黑附球菌发酵产物防治小麦赤霉病的报道，本发明首次通过开发有价值的黑附球菌菌株资源，开发发酵产物制备方法，评价应用效果。
11.本发明对发酵产物的形态没有特殊要求，可以为液体也可以为固体。
12.本发明还提供一种黑附球菌发酵产物的制备方法，包括以下步骤：将上述黑附球菌发酵培养，除去菌体，获得黑附球菌发酵产物。
13.进一步，可以通过过滤和/或离心的方法除去菌体。
14.进一步，将上述黑附球菌经马铃薯葡萄糖液体培养基发酵培养。
15.例如，可以将黑附球菌菌株38l1在pda培养基中活化培养10天，之后取菌块接种液体培养基。在25℃摇床以175rpm培养5天。可以采用过滤，离心等方法，得到不含孢子的发酵液。
16.本发明提供一种生物制剂，包括上述黑附球菌发酵产物和载料。本发明对生物制剂的剂型没有特殊要求，可以为液体制剂也可以为固体制剂，例如：颗粒制剂、粉剂(包括可湿性粉剂)、喷雾制剂以及其他剂型。优选的，可湿性粉剂更便于使用且效果更好。
17.采用上述生物制剂可以用于植物病虫害的防治，尤其是有效防控小麦赤霉病，具有防控效果好、受环境影响小、施用方法简单和成本低廉等优点。
18.进一步，所述载料可以选择一种或多种，例如：白炭黑、硅藻土、膨润土、十二烷基磺酸钠、润湿剂、可溶性淀粉、高岭土等等。用于进一步提高生物制剂的性能。
19.具体的，生物制剂可以包括以下重量份组分：上述黑附球菌发酵产物的粉剂10份、白炭黑40份、硅藻土30份、膨润土10份、十二烷基磺酸钠5份、润湿剂5份。
20.本发明提供上述生物制剂的制备方法，可以包括以下步骤：将生物制剂的各组分混合。
21.可湿性粉剂的制备方法也可以包括以下步骤：使用硅藻土对黑附球菌发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂。
22.也可以将所得到的黑附球菌发酵液进行喷雾干燥，通过加热喷嘴喷雾而雾化发酵液，在干燥室底部收集发酵液的内容物，具体如下：进口温度180℃，出口温度80℃，加入喷雾载体可溶性淀粉。将以下原料按照重量百分比混合均匀：发酵液粉剂10％、白炭黑40％、硅藻土30％、膨润土10％、十二烷基磺酸钠5％、润湿剂5％。控制水分含量≤5％，得到黑附球菌发酵液的可湿性粉剂。
23.本发明提供上述黑附球菌发酵产物或上述生物制剂在抑制禾谷镰刀菌的生长和/或繁殖中的应用。
24.本发明提供上述述黑附球菌发酵产物或上述生物制剂在防治植物病害中的应用。
25.进一步，上述黑附球菌发酵产物或上述生物制剂可以用于防治禾谷镰刀菌引发的小麦赤霉病。具有防治效果好等优点。
26.本发明提供一种防治小麦赤霉病的方法，包括以下步骤：将上述黑附球菌发酵产物或上述生物制剂使用在小麦。
27.进一步，在小麦扬花期前，将上述黑附球菌的发酵产物或上述生物制剂形成溶液后喷淋小麦。
28.发明人在研究中意外的发现，黑附球菌发酵产物或上述生物制剂可以用于植物病害防治，有效防控小麦赤霉病，可以作为田间防控小麦赤霉病的新制剂，利用黑附球菌发酵液及其制剂受环境影响小，施用方法简单，成本低廉。
附图说明
29.图1为本发明实施例1中，从玉米分离的内生菌菌株38l1的表型和遗传发育关系。图1a为38l1在pda培养基培养5天后的正面和反面生长表型；图1b为菌株38l1的遗传发育树。
30.图2为本发明实施例3中，添加不同浓度的黑附球菌38l1发酵液制剂在pda培养基中对禾谷镰刀菌的抑制作用的实验结果。
31.图3为本发明实施例4中，黑附球菌38l1发酵液制剂对禾谷镰刀菌孢子萌发的抑制作用的实验结果。
32.图4为本发明实施例5中，黑附球菌38l1发酵液制剂对禾谷镰刀菌引发的小麦赤霉病的防治作用的实验结果。
具体实施方式
33.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
34.本发明实施例中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
35.实施例中，
36.pda培养基的配方包括：每1000毫升蒸馏水添加马铃薯200克、葡萄糖20克,琼脂15-20克。
37.pdb培养基的配方除了不添加琼脂外，其他同pda培养基。
38.yepd培养基的配方包括：1％酵母膏粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，其余为蒸馏水。
39.禾谷镰刀菌菌株ph-1为模式菌株，保存于发明人所在实验室，可由公众获取仅用于非商业目的重复本发明实施例。
40.实施例1黑附球菌38l1的分离、鉴定
41.1.1菌株的分离方法，包括以下步骤：
42.随机在中国北京玉米产区采集玉米植株叶片。首先进行表面消毒，将样品在70％的酒精中浸泡1分钟，然后转移到2％的次氯酸钠中浸泡2分钟，最后在70％的酒精中浸泡30秒。该处理之后，用无菌蒸馏水清洗三次，放于无菌滤纸上进一步干燥。将样品剪成小片段(约5mm)，放于马铃薯葡萄糖琼脂(pda)的培养基表面，培养基中添加氨苄青霉素(50μg/ml)，以抑制细菌在pda培养基中的生长。取表面消毒的最后一步所洗脱的水100μl同样加于pda培养基表面，以评估表面灭菌的效率。将所有培养基置于25℃黑暗的培养箱中培养。待菌丝长出后，取菌落尖端的菌丝，转移到不含抗生素的新pda平板上进行初步纯化培养。对
菌落进行3次传代，获得纯培养，命名为菌株38l1。将培养菌株保存在4℃的pda斜面上，并同时放置于25％甘油中进行-80℃低温保存，以供进一步使用。
43.1.2菌株38l1的形态鉴定和分子生物学鉴定，包括以下步骤：
44.(1)菌株38l1的形态鉴定
45.将实验室低温保存的菌株38l1在pda培养基中活化培养，培养条件为25℃黑暗培养5天。之后在活化培养菌落边缘用打孔器打取5mm直径菌饼，置于新鲜配置的pda培养基，同样的培养条件培养5天。观察拍照菌落的正面和反面。
46.图1的图1a为38l1在pda培养基培养5天后的正面和反面生长表型的结果，从图1a中可以看出，黑附球菌38l1菌株在pda培养基表面菌丝致密，扇形分布，反面因其色素分泌而呈黄褐色。
47.(2)提取dna和pcr扩增
48.提取dna：菌株38l1在pda培养基培养7天后，用dneasy plant mini kit(青岛科生物科技有限公司)提取基因组dna。用nanodrop光谱仪测定所提取dna浓度。
49.采用pcr特异扩增内转录间隔子(its)、大亚基(lsu)和β-微管蛋白(tub)基因。
50.特异性pcr反应总体积为25μl，反应体系包括：1μl dna模板，每个引物1μl,2
×
taq mix(全式金，北京，中国)12.5μl和9.5μl ddh2o。
51.特异性pcr反应条件包括:94℃变性5分钟；94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸1分钟，35个循环；72℃延伸10分钟。
52.使用含0.01％(v/v)goldview核酸染色的1％琼脂糖凝胶(w/v)对pcr产物分离纯化，在120v，400a下电泳30分钟。扩增条带在紫外灯下使用凝胶成像系统(biorad,chemi doc,mp)进行观察。单一条带送往北京青岛生物技术有限公司纯化测序。
53.内转录间隔子(its)的序列已提交genbank网站，登录号为mz578163；大亚基(lsu)的序列已提交genbank网站，登录号为ol441037；β-微管蛋白(tub)基因的序列已提交genbank网站，登录号为ol634847。
54.(3)内生真菌38l1株的系统发育评价
55.根据测序结果和ncbi比对结果，选择附球菌相关的菌株构建系统发育树，采用基于tamura 3-参数模型的最大似然方法进行多位点连接比对，1000次重复的bootstrap分析来估计进化距离，系统发育关系结果如图1的图1b所示，菌株38l1与黑附球菌的几个菌株归为一枝，表明菌株38l1归属为黑附球菌菌株。
56.实施例2制备黑附球菌38l1的生物制剂
57.2.1制备黑附球菌菌株38l1的发酵液制剂，包括以下步骤：
58.将黑附球菌38l1活化培养：将实验室低温保存的黑附球菌38l1在pda培养基中活化培养，该菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmcc no.40003。培养条件为25℃黑暗培养5天。之后在活化培养菌落边缘用打孔器打取5mm直径菌饼，置于新鲜配置的pda培养基，同样的培养条件培养10天，活化培养的温度为25℃。pda培养基的配方包括：每1000毫升蒸馏水添加马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂15-20克；
59.活化培养10天后用灭菌的打孔器打取菌块。以三个菌块接种500毫升pdb培养基(配方除了不添加琼脂外，其他同pda培养基)的比例，接种所需体积的液体培养基。接种后，在25℃摇床以175rpm培养5天。之后用灭菌滤布过滤菌株培养液，得到液体培养液。之后，将
液体培养液以10,000转的速度离心10分钟以去除培养液中固体杂质。之后，将上步的液体培养液用0.22um的滤膜过滤，通过上述方法除去菌体(包括菌体产生的孢子)，得到不含菌体的发酵液，该发酵液可作为生物制剂直接使用。
60.2.2制备黑附球菌菌株38l1粉剂，包括以下步骤：将所得到的的发酵液进行喷雾干燥得到粉剂。
61.也可以使用硅藻土对发酵液进行吸附、离心或板框过滤、干燥，形成可湿性粉剂。
62.也可以将所得到的的发酵液进行喷雾干燥，通过加热喷嘴喷雾而雾化发酵液，在干燥室底部收集发酵液的内容物，具体方法可以包括以下步骤：进口温度180℃，出口温度80℃，加入喷雾载体可溶性淀粉。将以下原料按照重量百分比混合均匀：发酵液粉剂10％、白炭黑40％、硅藻土30％、膨润土10％、十二烷基磺酸钠5％、润湿剂5％。控制水分含量≤5％，得到发酵液的可湿性粉剂。
63.实施例3对禾谷镰刀菌生长的抑制作用效果验证
64.验证本发明的黑附球菌菌株38l1的发酵液制剂对禾谷镰刀菌生长的抑制作用，具体方法如下。
65.按照25％、50％、75％(v/v)的比例将黑附球菌38l1发酵液加入到冷却至60℃左右的pda培养基中混合，得到混合物，将约20ml的混合物倒入9cm的培养皿中放置30分钟凝固。从活化培养3天的禾谷镰刀菌菌株ph-1边缘取一个直径5mm的菌饼接种于上述含发酵液的pda平板中心。每个浓度设3个重复，试验进行3次。用无菌pdb代替黑附球菌38l1发酵液作为对照。25℃黑暗培养7天后，在两个垂直方向上测定每个平板上的菌落直径，观察统计菌株生长抑制作用。
66.实验结果如图2所示，随着培养基所含发酵液浓度的升高，禾谷镰刀菌的生长受抑制程度增高，表明黑附球菌38l1发酵液对禾谷镰刀菌的生长有明显的抑制作用。
67.发明人还将制备的黑附球菌38l1发酵产物的非液体制剂溶解后加入到冷却至60℃左右的pda培养基中混合，采用上述的方法进行验证，也得到与上述一致的结论。
68.实施例4对禾谷镰刀菌孢子萌发的抑制作用的验证
69.验证本发明的菌株黑附球菌38l1发酵液制剂对禾谷镰刀菌孢子萌发的抑制作用，具体方法如下。
70.将实施例2制备的5ml黑附球菌38l1发酵液和禾谷镰刀菌ph-1孢子悬浮液(1
×
107孢子/ml)按1:1(v/v)的比例加入25ml无菌管中。与以液体培养基pdb与孢子悬浮液的混合液作为对照。与以液体培养基yepd与孢子悬浮液的混合液作为对照。所有试管在25℃黑暗条件下振荡培养(150转/分钟)，分别在培养4小时和8小时后检测孢子萌发率。试验共进行3次，每个处理组50个分生孢子萌发。
71.如图3所示，孢子悬浮液在含黑附球菌38l1发酵液的混合液中培养4h和8h后，大多数孢子均没有明显的萌发，而相同时间的对照处理，孢子则萌发明显，长出较长的新菌丝，表明黑附球菌38l1发酵液及其制剂对禾谷镰刀菌孢子萌发具有显著的抑制作用，4h和8h的萌发抑制率分别为69％和30％。
72.发明人还将制备的黑附球菌38l1发酵产物非液体制剂溶解后采用上述方法进行验证，得到与上述一致的结论。
73.实施例5防治小麦赤霉病的效果验证
74.验证本发明所述的菌株黑附球菌38l1发酵液及其制剂防治小麦赤霉病的应用，具体方法如下。
75.麦穗分别进行如下处理：
76.第一种处理组：黑附球菌38l1的发酵液制剂和禾谷镰刀菌菌株ph-1(1
×
107孢子/ml)孢子按照1:1比例混合注射小穗。
77.第二种处理组：在麦穗上喷施黑附球菌38l1的发酵液制剂，6小时后，接种禾谷镰刀菌菌株ph-1(1
×
107孢子/ml)孢子液。
78.第三种处理组：在麦穗上喷施黑附球菌38l1的发酵液制剂，12小时后，接种禾谷镰刀菌菌株ph-1(1
×
107孢子/ml)孢子液。
79.上述处理中，分别采用培养液pdb作为菌株38l1的发酵液制剂的对照，相同的处理流程和时间进行对照。每组共接种15个穗粒，接种后的麦穗分别套上塑料袋，25℃、80％相对湿度，光照16h/黑暗8h。接种后保持发病条件10天，观察统计发病的小穗数，重复试验2次。
80.实验结果如图4所示，由左到右分别为：共施用(第一种处理组)、提前6小时施用(第二种处理组)和提前12小时施用(第三种处理组)。
81.三种处理组中，由于接种禾谷镰刀菌的侵染，对照组小麦穗均发生枯黄，品质和产量均受到影响；而对于使用了黑附球菌38l1发酵液制剂的实验组，除接种点外，其他小麦穗没有出现枯黄的发病症状，三种处理时间(共施用、提前6小时施用、提前12小时施用)黑附球菌38l1发酵液制剂均表现出很好的防治效果。实验表明，黑附球菌38l1发酵液制剂能够防治禾谷镰刀菌引发的小麦赤霉病。
82.发明人还将制备的黑附球菌38l1非液体制剂溶解后采用上述方法进行验证，得到与上述一致的结论。
83.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种黑附球菌发酵产物，其特征在于，黑附球菌的拉丁文名称为epicoccum nigrum，保藏编号为cgmcc no.40003。2.一种黑附球菌发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：权利要求1所述黑附球菌发酵培养，除去菌体，获得黑附球菌的发酵产物。3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，发酵培养后，通过过滤和/或离心除去菌体。4.根据权利要求2或3所述制备方法，其特征在于，将权利要求1所述黑附球菌经马铃薯葡萄糖液体培养基发酵培养。5.一种生物制剂，其特征在于，包括权利要求1所述黑附球菌发酵产物和载料。6.根据权利要求5所述生物制剂，其特征在于，包括以下重量份组分：权利要求1所述黑附球菌发酵产物的粉剂10份、白炭黑40份、硅藻土30份、膨润土10份、十二烷基磺酸钠5份、润湿剂5份。7.权利要求5或6所述生物制剂的制备方法，其特征在于，将生物制剂的各组分混合。8.权利要求1所述黑附球菌发酵产物或权利要求5或6所述生物制剂在抑制禾谷镰刀菌的生长和/或繁殖中的应用。9.权利要求1所述黑附球菌发酵产物或权利要求5或6所述生物制剂在防治植物病害中的应用。10.一种防治小麦赤霉病的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述黑附球菌发酵产物或权利要求5或6所述生物制剂使用在小麦。
技术总结本发明涉及一种黑附球菌发酵产物、制备方法及其应用。黑附球菌的保藏编号为CGMCC No.40003，可以应用于植物病害的防治，施用该发酵液及其制剂够有效防控小麦赤霉病。与黑附球菌孢子菌剂相比，本发明利用黑附球菌发酵产物及其制剂受环境影响小，具有施用方法简单，成本低廉等优点。成本低廉等优点。成本低廉等优点。
技术研发人员：王双超 郭立华 可莱
受保护的技术使用者：中国农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2022.02.15
技术公布日：2022/7/5
