1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用。
背景技术：2.聚磷酸盐激酶1(polyphosphate kinase 1，ppk1)由聚磷酸盐激酶基因1编码，是大肠杆菌内负责催化atp脱磷酸残基形成聚磷酸盐的一种主要激酶。ppk1具有广泛的应用：ppk1利用atp末端的磷酸基合成长链磷酸基聚合；也可以利用多聚磷酸盐(poly p)末端磷酸基使adp生成atp。ppk1还是生产腺嘌呤核苷酸(amp)、鸟嘌呤核苷酸(gmp)、胞嘧啶核苷酸(cmp)、尿嘧啶核苷酸(ump)、胸腺嘧啶核苷酸(tmp)等产品都会用到的一种酶。
3.ppk1在应用中存在的主要问题有：ppk1的酶活一般在650u/mg左右，仍有待进一步的提高；并且ppk1对ph控制较为严格，在生产5＇-单磷酸核苷酸(特别是腺苷单磷酸)时，ppk1和腺苷激酶的最适ph不同但需要混合投料，这进一步影响了ppk1在实际应用中酶活的发挥。
技术实现要素：4.针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.本发明的第一方面，提供一种聚磷酸盐激酶1突变体，其氨基酸序列如seq id no.3所示。具体如下：
7.mgqeklyiekelswlsfnervlqeaadksnpliermrflgiysnnldefykvrfaelkrriiiseeqgsnshsrhllgkiqsrvlkadqefdglynelllemarnqiflinerqlsvnqqnwlrhyfkqylrqhitpilinpdtdlvqflkddytylaveiirgdtiryalleipsdkvprfvnlppeaprrrkpmilldnilryclddifkgffdydalnaysmkmtrdaeydlvhemeaslmepvssslkqrltaepvrfvyqrdmpnalvevlrekltisrydsivpggryhnfkdfinfpnvgkanlvnkplprlrhiwfdkaqfrngfdairerdvllyypyhtfehvlellrqasfdpsvlaikiniyrvakdsriidsmihaahngkkvtvvvelqarfdeeanihwakrlteagvhvifsapglkihaklflisrkengevvryahigtgnfnektarlytdyslltadaritnevrrvfnfienpyrpvtfdylmvspqnsrrllyemvdreianaqqglpsgitlklnnlvdkglvdrlyaasssgvpvnllvrgmcslipnlegisdniraisivdrylehdrvyifenggdkkvylssadwmtrnidyrievatplldprlkqrvldiidilfsdtvkaryidkelsnryvprgnrrk vraqlaiydy iksleqpe。
8.本发明通过gromacs对野生型聚磷酸盐激酶1(其氨基酸序列如seq id no.1所示)进行拓扑并分析，定义立方体并填充水分子，得到溶剂化体系，构建盒子，然后在盒子中添加抗衡离子，再在charmm力场下进行能量最小化，然后进行nvt平衡和npt平衡，再对成品进行1ns的md模拟，最终将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的l突变为p，第247位的m突变为v，得到聚磷酸盐激酶1突变体。
9.本发明的聚磷酸盐激酶1突变体，其酶活性达800-850u/mg，与野生型聚磷酸盐激酶1相比，其酶活性有了显著的提高；而且，本发明的聚磷酸盐激酶1突变体所适应的ph范围广，在ph5.0-ph9.3之间均能保持较高的酶活性，更适合工业化生产。
10.本发明的第二方面，提供编码上述聚磷酸盐激酶1突变体的基因。
11.优选的，编码上述聚磷酸盐激酶1突变体的基因经密码子优化处理，优化后编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。
12.本发明的第三方面，提供一种聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的构建方法，包括以下步骤：
13.(1)将pqe-60质粒用bspeⅰ和aflⅲ双酶切，再连接上序列如seq id no.5所示的片段，构建得到质粒pqe-n；用accⅲ和sphⅰ对质粒pqe-n双酶切，再将编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pqe-ppk1；
14.(2)将获得的重组表达载体pqe-ppk1导入到大肠杆菌中，构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。
15.优选的，步骤(1)中，质粒pqe-n的核苷酸序列如seq id no.6所示。
16.由于pqe-60质粒太大，而太大的质粒既不利于自身复制，也会在表达较小的外源基因时难以进行重组体的筛选。因此，本技术对pqe-60质粒进行了改造，切掉了对发酵生产而言无用的元件，同时还引入了新的酶切位点，以便于连入编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因。
17.优选的，步骤(1)中，重组表达载体pqe-ppk1的核苷酸序列如seq id no.7所示。
18.优选的，步骤(2)中，所述大肠杆菌为e.coli k-12。
19.本发明的第四方面，提供上述方法构建得到的聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。
20.本发明的第五方面，提供上述聚磷酸盐激酶1突变体生产菌在发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体中的应用。
21.本发明的有益效果：
22.(1)本发明首先对大肠杆菌聚磷酸盐激酶1进行了突变改造处理，将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的l突变为p，第247位的m突变为v，获得了聚磷酸盐激酶1突变体。本发明的聚磷酸盐激酶1突变体具有如下突出的优势：
23.①
本发明的聚磷酸盐激酶1突变体的酶活性达800-850u/mg，与野生型聚磷酸盐激酶1相比，酶活提高了23％-33％。
24.②
本发明的聚磷酸盐激酶1突变体对ph的适应范围广，能够在ph5.0-ph9.3之间均能保持较高的酶活性，更适合工业化生产。
25.③
本发明的聚磷酸盐激酶1突变体的亲水性增加，酶的溶解度上升，更有利于酶的工业化应用。
26.(2)针对聚磷酸盐激酶1突变体，本发明还构建了聚磷酸盐激酶1突变体的生产菌。本发明的生产菌能够特异性外源表达高活性的聚磷酸盐激酶1突变体，极大丰富了聚磷酸盐激酶1突变体的来源。
附图说明
27.图1：nvt平衡图。
28.图2：npt平衡图(压力变化)。
29.图3：npt平衡图(密度变化)
30.图4：通过分子动力学模拟软件分析野生型聚磷酸盐激酶1的亲水性。
31.图5：通过分子动力学模拟软件分析聚磷酸盐激酶1突变体的亲水性。
32.图6：密码子优化前的ppk1基因的密码子相对适应度。
33.图7：密码子优化后的ppk1基因的密码子相对适应度。
34.图8：质粒pqe-n的结构示意图。
35.图9：重组表达载体pqe-ppk1的结构示意图。
36.图10：琼脂糖凝胶电泳验证图；图中，m：marker；泳道1：pqe-n；泳道2：pqe-ppk1双酶切。
37.图11：诱导表达后蛋白的sds-page检测结果；图中，m：marker；泳道1：未添加诱导剂iptg；泳道2-7：分别为诱导表达6h、8h、10h、12h、14h、16h的检测结果。
38.图12：纯化蛋白的western blot检测结果。
39.图13：聚磷酸盐激酶1突变体与野生型聚磷酸盐激酶1的酶活与ph之间的关系；图中，1为聚磷酸盐激酶1突变体，2为野生型聚磷酸盐激酶1。
具体实施方式
40.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
41.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
42.本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
43.本实施例和对比例中所使用的大肠杆菌为e.coli k-12(atcc 25404)。
44.需要说明的是，本发明聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的构建方法，是本领域技术人员能够重复实施的方法，故无需对生产菌进行生物保藏。
45.实施例1：聚磷酸盐激酶1突变处理及密码子优化
46.发明人从现有数据库中获得野生型聚磷酸盐激酶1氨基酸序列如seq id no.1所示；编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。对其进行拓扑并分析，构建盒子，在charmm力场下进行能量最小化，然后进行nvt平衡(图1)和npt平衡(图2、图3)，对成品进行1ns的md模拟，最终选择将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的l突变为p，第247位的m突变为v；突变后的聚磷酸盐激酶1突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
47.通过分子动力学模拟软件分析突变前后聚磷酸盐激酶1的亲水性，结果分别如图4和图5所示。结果表明：突变后的聚磷酸盐激酶1突变体的亲水性提高。
48.在获得聚磷酸盐激酶1突变体后，发明人尝试利用原核表达系统对聚磷酸盐激酶1突变体进行外源表达。为了使编码聚磷酸盐激酶1突变体的ppk1基因能够更适用于大肠杆菌表达系统，本发明对ppk1基因的核苷酸序列组成进行了密码子优化。
49.经密码子优化后的ppk1基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；优化前的密码子
相对适应度图如图6所示；优化后的密码子相对适应度图如图7所示。
50.由图7可以看出，经密码子优化后的ppk1基因的密码子相对适应度最高可以达到1.0，显著提高了蛋白编码基因在大肠杆菌表达系统中的适应性。
51.实施例2：重组表达载体的构建
52.对pqe-60质粒用bspeⅰ和aflⅲ双酶切，再连接上序列如下的大小为124bp的片段
53.tccggactcgagaaatcataaaaaatttatttgctttgtgagcggataacaattataatagattcaattgtgagcggataacaatttcacacagaattcattaaagaggagaaattaagcatgc；(seq id no.5)
54.构建得到质粒pqe-n(结构示意图如图8所示)，其核苷酸序列如seq id no.6所示。
55.用accⅲ和sphⅰ对质粒pqe-n双酶切，把优化后的编码聚磷酸盐激酶1突变体的ppk1基因(核苷酸序列如seq id no.4所示)连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pqe-ppk1(结构示意图如图8所示)，其核苷酸序列如seq id no.7所示。
56.将构建的重组表达载体pqe-ppk1用accⅲ和sphⅰ两个酶进行酶切验证，结果如图10所示。结果表明：ppk1基因(seq id no.4所示)已成功整合到质粒pqe-n上。
57.实施例3：聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的构建
58.将实施例2构建的重组表达载体pqe-ppk1导入到到大肠杆菌中，获得转化子。将转化子在含有100μg/ml氨苄青霉素(amp)的lb平板上涂布，挑出能够长的单菌落，将其作为阳性转化子。
59.将阳性转化子接种至含有100μg/ml氨苄青霉素的lb培养基中，33℃培养至od
600
＝0.6，缓慢降温至22℃，加入iptg(使iptg的终浓度为0.2mmol/l)，诱导培养16h。诱导培养结束后，超声破菌，离心，分离上清液，进行sds-page验证，其结果如图11所示。在80.3kda处有表达条带，与外源插入的目的基因ppk1所表达蛋白的理论计算得到的分子量一致。
60.采用his-镍亲和层析柱对目的蛋白进行分离纯化，得到的纯化蛋白。对纯化蛋白进行western blot检测，结果如图12所示。
61.由图12可以看出，采用本发明的聚磷酸盐激酶1突变体生产菌可以成功表达聚磷酸盐激酶1突变体。
62.由此证明：本实施例已成功构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。
63.对比例1：
64.将seq id no.2所示的ppk1基因通过常规基因工程的手段整合到质粒pqe-n中，构建得到重组表达载体；然后将构建的重组表达载体导入到大肠杆菌中，获得转化子，按实施例3的方法筛选阳性转化子，并进行验证，构建得到聚磷酸盐激酶1生产菌。
65.试验例1：
66.1.发酵培养生产聚磷酸盐激酶1：
67.将实施例3、对比例1构建的生产菌接入同样组成的发酵培养基中，发酵培养基的组成为：
68.蛋白胨12g/l、葡萄糖5g/l、甜菜糖蜜5g/l、酵母膏8g/l、氯化钠3g/l、硫酸铵2.5g/l、三水磷酸氢二钾4g/l、柠檬酸铁铵0.3g/l、柠檬酸2.1g/l、七水硫酸镁0.5g/l、氨苄青霉素100ppm。
69.在相同条件下进行发酵培养，发酵培养的初始温度为33℃，ph为6.9-7.0，罐压0.05mpa，ph7.0，转速200rpm；
70.发酵培养至发酵液稀释100倍后的od
600
值为0.4时，降温至22℃，向体系中加入iptg，使iptg在体系中的终浓度为0.2mmol/l，诱导培养24h；
71.培养过程中需要进行补料，当体系中残糖降至1g/l时进行补料(补加葡萄糖)，通过补料将残糖控制在0.5-1g/l。
72.收集诱导表达后的菌液，于4℃，10000rpm离心20min，收集菌体加入裂解液(20mmol/l na2hpo4，500mmol/l nacl，20mmol/l咪唑，ph 7.4)重悬菌体冰浴超声破菌。4℃，15000离心30min收集上清，加样至预先用结合缓冲液(20mmol/lna2hpo4，500mmol/l nacl，20mmol/l咪唑，8mol/l尿素，ph7.4)平衡的his-镍亲和层析柱。用洗涤缓冲液a(20mmol/l na2hpo4，500mmol/l nacl，20mmol/l咪唑，8mol/l尿素，ph7.4)和洗涤缓冲液b(20mmol/l na2hpo4，500mmol/l nacl，30mmol/l咪唑，8mol/l尿素，ph7.4)洗脱杂蛋白，再用洗脱缓冲液(20mmol/l na2hpo4，500mmol/lnacl，500mmol/l咪唑，8mol/l尿素，ph7.4)洗脱目的蛋白，收集洗脱液，得到纯化蛋白。
73.2.聚磷酸盐激酶1的酶活检测：
74.参考“多聚磷酸盐激酶的原核表达、纯化及酶活性测定”(中国生物制品学杂志，2020年5月第33卷第5期)的方法对不同生产菌在相同条件下培养后得到的上清液中的聚磷酸盐激酶1的酶活进行检测，具体检测方法如下：
75.根据dapi染色法，在波长为415nm处激发，550nm处检测dapi-polyp复合物的荧光，测定ppk催化生成的polyp含量，从而计算出ppk酶活性浓度。
76.酶催化作用反应体系：50mmol/l hepes-koh(ph 7.2)，40mmol/l硫酸铵，4mmol/lmgcl，22mmol/l磷酸肌酸，20μg/ml肌酸激酶，10μgppk。37℃孵育15或30min加入40mmol/ledta终止反应，使用10umol/l dapi与纯化蛋白酶按1：1混合，于415nm处激发550nm处测定每个反应重复3次。以不同反应条件得到的最大值为蛋白酶活性。配制1000、500、250、125、62.5、0ng/ml系列浓度的polyp标准品采用dapi染色法测定以poly p标准品浓度为横坐标以荧光强度为纵坐标建立poly p标准曲线，根据poly p标准曲线计算polyp的浓度取均值并按下式计算酶活性。ppk酶活性(u/mg)定义为在测定条件下每分钟每毫克酶催化1pmol磷酸盐掺入poly p中的量。
77.酶活性(u/mg)＝poly p(pmol/l)*v/(m*t)
78.式中v为反应总体积(l)，m为待测酶的质量(mg)，t为反应时间(min)。
79.结果见表1。
80.表1：
81.生产菌聚磷酸盐激酶1的酶活(u/mg)实施例3构建的生产菌840-850对比例1构建的生产菌630-645
82.试验例2：
83.将试验例1中得到的纯化蛋白(即聚磷酸盐激酶1突变体和野生型聚磷酸盐激酶1)在不同ph条件下测试其酶活，酶活测定方法参考试验例1。
84.结果如图13所示，结果表明：与野生型聚磷酸盐激酶1相比，本发明的聚磷酸盐激酶1突变体对ph的适应范围广，能够在ph5.0-ph9.3之间均能保持较高的酶活性，更适合工业化生产。
85.以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。
技术特征：1.一种聚磷酸盐激酶1突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.3所示。2.编码权利要求1所述聚磷酸盐激酶1突变体的基因。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。4.一种聚磷酸盐激酶1突变体生产菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将pqe-60质粒用bspeⅰ和aflⅲ双酶切，再连接上序列如seq id no.5所示的片段，构建得到质粒pqe-n；用accⅲ和sphⅰ对质粒pqe-n双酶切，再将编码聚磷酸盐激酶1突变体的基因连接到酶切后的质粒上，获得重组表达载体pqe-ppk1；(2)将获得的重组表达载体pqe-ppk1导入到大肠杆菌中，构建得到聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，质粒pqe-n的核苷酸序列如seq id no.6所示。6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，重组表达载体pqe-ppk1的核苷酸序列如seq id no.7所示。7.由权利要求4-6任一项所述的构建方法构建的聚磷酸盐激酶1突变体生产菌。8.权利要求7所述的聚磷酸盐激酶1突变体生产菌在发酵生产聚磷酸盐激酶1突变体中的应用。
技术总结本发明公开了聚磷酸盐激酶1突变体及其生产菌的构建与应用，属于基因工程技术领域。本发明对大肠杆菌聚磷酸盐激酶1进行了突变改造处理，将野生型聚磷酸盐激酶1第246位的L突变为P，第247位的M突变为V，获得了聚磷酸盐激酶1突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。与野生型聚磷酸盐激酶1相比，本发明的聚磷酸盐激酶1突变体的酶活、pH适应性和亲水性都有了显著提高。针对聚磷酸盐激酶1突变体，本发明还构建了聚磷酸盐激酶1突变体的生产菌。本发明的生产菌能够特异性外源表达高活性的聚磷酸盐激酶1突变体，极大丰富了聚磷酸盐激酶1突变体的来源。的来源。的来源。
技术研发人员：岳明瑞 谢沛 曹华杰 郭永胜
受保护的技术使用者：新泰市佳禾生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/7/5
