一种牛cry1基因的indel标记在繁殖性状早期选择中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失多态性(indel)的检测，特别涉及快速、精准的检测与奶牛繁殖力相关的cry1基因indel标记。
背景技术：2.动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术以及以dna多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，标记辅助选择(marker-assisted selection，mas)育种技术根据与遗传性状显著相关的dna标记进行性状选择，通过在dna水平上分析个体的遗传组成，实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性，在早期选择、无损害性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与性状的相关性，是标记辅助选择技术应用的前提和关键。
3.插入/缺失多态性(insertion/deletion,indel)是指dna序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起的dna序列的改变，插入或缺失片段的长度在1-50bp之间。从dna水平上对小片段核苷酸的差异进行indel检测，利用indel分析个体基因组，可以更好地解释个体的表型差异，在动物分子育种中具有重要意义。
4.随着比较基因组学的深入研究，indel为理论研究和遗传育种应用提供了大量的遗传信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具snp的优点。indel与snp均是源于单突变事件，突变频率较低，相对比较稳定；在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(《50bp)。作为一种重要的遗传标记来源，indel遍布于整个基因组，频率仅次于snp，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。
5.2005年schnabel等人结合ssr标记和indel标记对控制奶牛产奶量进行了研究，并成功进行了精细定位。indel的研究目前多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米等)的基因组研究中，对反刍家畜的功能性基因的indel标记的挖掘与应用亟待深入。
6.同时提高产奶量和提升奶牛繁殖力，一直是养殖行业的难题之一。为改善奶牛产奶量增加但繁殖力持续低下的现状，需要在dna水平上筛查和检测与奶牛繁殖力密切相关的dna标记。隐花色素1(cryptochrome 1,cry1)基因是生物钟基因之一，为生物钟负调控系统的重要组成。
7.目前尚未见到牛cry1基因上用于卵巢相关性状标记辅助选择的dna标记的报道。
技术实现要素：8.本发明的目的在于提供一种牛cry1基因的indel标记在繁殖性状早期选择中的应用，通过对牛cry1基因indel标记的检测，从而可以利用分子标记辅助选择加快奶牛良种选育速度。
9.为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
10.一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：
11.以待测牛(例如中国荷斯坦牛)个体全基因组dna为模板，以引物对p1为引物，通过pcr扩增包含cry1基因6-bp插入/缺失多态性位点(nc_037332.1:g.70335656-70335661位)的片段；对pcr的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定个体在该插入/缺失多态性位点的基因型。
12.优选的，所述引物对p1为：
13.上游引物：5
’‑
cgtatgtgttctaactccttccct-3’；
14.下游引物：5
’‑
atctagacagaaaagaccccagt-3’。
15.优选的，所述pcr采用的反应体系包括50ng/μl的基因组dna1.0μl以及10pmol/μl的上、下游引物各0.5μl。
16.优选的，所述pcr采用的扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。
17.优选的，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0％的琼脂糖凝胶。
18.优选的，根据琼脂糖凝胶电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(ii)表现为199bp的一条带纹，插入/缺失基因型(id)表现为199bp和193bp的两条带纹，缺失/缺失基因型(dd)表现为193bp的一条带纹。
19.上述牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法在奶牛分子标记辅助选择育种中的应用。
20.牛cry1基因nc_037332.1第70335656-70335661位插入/缺失多态性位点检测试剂在奶牛分子标记辅助选择育种中的应用。
21.优选的，所述试剂包括pcr的扩增引物对(例如上述引物对p1)。
22.优选的，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(ii)可以作为提高奶牛繁殖力的dna标记(具体为indel标记)。
23.一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括牛cry1基因nc_037332.1第70335656-70335661位插入/缺失多态性位点检测试剂，所述试剂包括上述引物对p1。
24.本发明的有益效果体现在：
25.本发明通过pcr扩增和琼脂糖凝胶电泳，可以对牛cry1基因插入/缺失多态性位点(nc_037332.1:g.70335656-70335661位)进行基因分型鉴定，根据对该插入/缺失多态性位点与卵巢相关性状进行关联分析的结果，首次发现牛cry1基因与卵巢相关性状显著相关，并具有可提高奶牛繁殖力的dna标记。本发明的检测方法简单、快速、成本低，可用于精准建立繁殖力优异的奶牛种群，从而加快奶牛繁殖性状的标记辅助选择育种进程。
附图说明
26.图1为中国荷斯坦牛cry1基因pcr扩增(引物对p1)产物3.0％琼脂糖凝胶电泳的结果；其中：m为marker i泳道，其他个别泳道出现的三条带表示存在非特异性扩增，但并不影响对基因型的识别。
27.图2为中国荷斯坦牛cry1基因pcr扩增产物测序图；其中：上半部分表示基因型为
ii，下半部分表示基因型为id，黑色方框标出的部分表示6-bp缺失序列(nc_037332.1:g.70335656-70335661del gtgtgt)。
具体实施方式
28.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
29.本发明利用pcr及琼脂糖凝胶电泳的方法，对奶牛代表性品种中国荷斯坦牛cry1基因70335656-70335661位(nc_037332.1)产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与奶牛卵巢相关性状进行关联分析，确定了可以作为奶牛分子育种中辅助选择的候选分子标记。
30.1.实验药品与试剂
31.1.1生化试剂与生物学试剂
32.①
taq dna聚合酶(购自fermantas，即mbi公司)；
②
蛋白酶k(购自华美生物工程公司)；
③
marker i(购自天根生化科技(北京)有限公司)。
33.1.2普通试剂
34.普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、tris、edta、nacl、naoh、kcl、na2hpo4、kh2po4、tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(sds)、溴化乙锭(eb)、溴酚蓝、二甲基苯氰ff、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。
35.1.3溶液与缓冲液
36.所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034
×
105pa)、25min。配制方法均参考sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。
37.1)提取组织样dna所用溶液
38.①
2mol/l nacl：11.688g nacl溶于水，定容至100ml，高压灭菌。
39.②
组织dna提取液(100ml)：l mol/l tris-cl(ph 8.0)l ml，0.5mol/l edta(ph 8.0)20ml，2mol/l nacl 5ml，定容至100ml。
40.③
基因组dna提取时的公用溶液
41.2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液
42.①
0.5
×
tbe缓冲液：取10
×
tbe 50ml，定容至1000ml。
43.②
上样缓冲液：0.25％溴酚蓝及0.25％二甲基苯氰ff，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。2.奶牛cry1基因indel位点扩增引物
44.在ncbi上检索牛cry1基因的序列，并利用primer 6.0设计能够扩增cry1基因起始密码子上游区域indel位点(nc_037332.1:g.70335656-70335661位)的pcr引物对p1，具体引物序列如下：
45.上游引物：5
’‑
cgtatgtgttctaactccttccct-3’；
46.下游引物：5
’‑
atctagacagaaaagaccccagt-3’。
47.理论上，所述70335656-70335661位的6-bp序列(gtgtgt)缺失时，pcr产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果为一条193bp的带纹；所述70335656-70335661位的6-bp序列(gtgtgt)存在时，pcr产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果为一条199bp的带纹；所述70335656-70335661位的6-bp序列(gtgtgt)在配对的两个染色体中仅有一个发生上述缺失的情况时，pcr产物
的琼脂糖凝胶电泳检测结果为199bp和193bp的两条带纹。因此，cry1基因70335656-70335661位突变位点，理论上存在三种基因型：ii基因型表现为199bp的一条带纹，id基因型表现为199bp和193bp的两条带纹，dd基因型表现为193bp的一条带纹。
48.3.pcr扩增待测奶牛cry1基因片段
49.3.1奶牛卵巢组织样品的采集
50.本实验从中国荷斯坦牛个体采集卵巢样品1020份，于2019年3月至2020年6月间采样(采样地点：陕西西安屠宰场)，用统一标准同组测定样本的形态表型，包括卵巢中成熟卵泡数量、成熟卵泡直径、白体数量、白体直径；其中，直径采用游标卡尺或双尺测量。考虑到卵巢的大小取决于发情周期的阶段，仅对相同年龄阶段(5-6岁)的中国荷斯坦牛进行采样。根据其线粒体dna的d-loop区域比对结果可确定所有卵巢确实来源于不同的牛个体。样品用70％乙醇保存于低温冰盒，带回实验室后置于-80℃冻存。
51.3.2卵巢组织样品中基因组dna的提取
52.1)取约10mg卵巢组织，放于1.5ml的离心管中，用剪刀尽量剪碎。
53.2)加入600μl组织dna提取液，保证卵巢组织样均匀地分布在组织dna提取液中，加入10％sds至终浓度为1％，加入蛋白酶k至终浓度为100μg/ml，55.0℃消化过夜。
54.3)将消化后溶液冷却至室温，加入等体积的tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。
55.4)取上清液，加入等体积的酚:氯仿(1:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。
56.5)取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。
57.6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/l醋酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，并出现白色絮状dna。
58.7)挑出dna，放进一个1.5ml的离心管中，加入500μl 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇。
59.8)再一次向离心管中加入500μl 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。
60.9)待dna干燥后，加入60μl灭菌超纯水，4℃保存过夜，使dna完全溶解，待测。
61.3.3琼脂糖凝胶电泳检测dna
62.1)将电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。
63.2)称取1.2g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入0.5
×
tbe 40ml使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次后取出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/ml的eb，轻微摇动，防止出现气泡。
64.3)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液到入电泳槽内。如出现气泡，立即用移液器移出。
65.4)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸。
66.5)向电泳槽中加入1
×
tbe缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。
67.6)取dna溶液2～4μl，加2μl上样缓冲液后混匀，上样，并将dna marker加在一边。
68.7)80v电压电泳2h。
69.8)在紫外分析仪上观察，如果有rna则需要纯化，如果有明显降解，则需重新提取相应样品的dna。
70.3.4dna的纯化
71.1)500μl的dna溶液中加入10％sds，使sds终浓度为0.1％，加入蛋白酶k至终浓度达到100μg/ml。
72.2)55℃保温10h左右。
73.3)等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次。
74.4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。
75.5)加入1/10体积3mol/l醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀dna。
76.6)倒掉液体，70％乙醇洗涤，待dna晾干，加入60μl灭菌超纯水溶解，4℃保存，待检测。
77.3.5分光光度法检测dna
78.用紫外光光度计测定dna样品在260nm、280nm处的od值。计算od
260
/od
280
的比值。如od
260
/od
280
比值小于1.6，说明样品dna中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除rna纯化。
79.dna浓度(ng/μl)＝50
×
od
260
值
×
稀释倍数
80.dna检测合格后，取出一定的量dna溶液，稀释至50ng/μl作为模板dna，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。
81.3.6pcr扩增
82.pcr反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的pcr反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5ml离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2ml eppendorf pcr管中，然后加入模板dna，再瞬时离心后进行pcr扩增。
83.pcr反应体系(13μl)：2
×
taq pcr supermix(包括taq dna聚合酶、dntps和反应缓冲液，浓度为2
×
)6.5μl、上游引物0.5μl、下游引物0.5μl(上、下游引物浓度分别为10pmol/μl)、模板dna(浓度为50ng/μl)1.0μl，及去离子水4.5μl。
84.pcr反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。
85.4.pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析
86.4.1琼脂糖凝胶电泳检测
87.1)制作3.0％的琼脂糖凝胶，使用eb核酸染料染色，点样4μl，120v电压电泳1～1.5h；
88.2)分子量不同的dna片段分离后，即可在bio-rad gel doc 2000凝胶成像系统成像；
89.3)根据琼脂糖凝胶电泳结果对基因型进行分析。
90.4.2鉴定indel位点的基因型
91.参见图1、图2，通过bio-rad gel doc 2000凝胶成像系统对电泳结果进行照相分析，分析结果表明，利用引物对p1对中国荷斯坦牛基因组进行扩增，并对扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行分析，能够实现对中国荷斯坦牛cry1基因70335656-70335661位(nc_
037332.1)的6-bp插入/缺失多态性位点进行快速、准确的分型鉴定(包括基因型：ii、id)。
92.5.奶牛cry1基因indel位点的频率统计分析
93.基因型频率是指一个群体中某种基因型的个体数占总个体数的比率。中国荷斯坦牛cry1基因在上述6-bp插入/缺失多态性位点的基因型频率统计结果如表1所示。
94.表1.中国荷斯坦牛cry1基因indel位点基因频率分布
[0095][0096]
6.奶牛cry1基因indel位点基因效应的关联分析
[0097]
基因型数据：通过pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳识别的基因型(ii、id)
[0098]
繁殖数据：卵巢相关性状(成熟卵泡数量和直径；白体数量和直径)
[0099]
利用spss(23.0)软件分析indel位点与卵巢相关性状的相关性。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，利用spss软件的t-检验进行分析。分析结果具体参见表2。
[0100]
表2.cry1基因indel位点与中国荷斯坦牛卵巢相关性状的相关性分析
[0101][0102]
由表2可以看出，中国荷斯坦牛cry1基因插入/缺失多态性位点(nc_037332.1:g.70335656-70335661位)的不同基因型对卵巢成熟卵泡直径和白体直径有显著影响(p《0.05)，基因型为ii的个体优于基因型为id的个体。因此，上述插入/缺失多态性位点的ii基因型可以作为提高奶牛繁殖性状(例如，卵巢相关性状)的候选遗传标记。
技术特征：1.一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以待测牛基因组dna为模板，通过pcr扩增包含cry1基因nc_037332.1:g.70335656-70335661位6-bp插入/缺失多态性位点的片段；对pcr的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定该插入/缺失多态性位点的基因型。2.根据权利要求1所述一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述pcr的扩增引物为：上游引物：5
’‑
cgtatgtgttctaactccttccct-3’；下游引物：5
’‑
atctagacagaaaagaccccagt-3’。3.根据权利要求1所述一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述pcr的反应体系包括50ng/μl的基因组dna 1.0μl以及10pmol/μl的上、下游引物各0.5μl。4.根据权利要求1所述一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述pcr的扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。5.根据权利要求1所述一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0％的琼脂糖凝胶。6.根据权利要求1所述一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：根据琼脂糖凝胶电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型表现为199bp的一条带纹，插入/缺失基因型表现为199bp和193bp的两条带纹，缺失/缺失基因型表现为193bp的一条带纹。7.如权利要求1所述的牛cry1基因插入/缺失多态性的检测方法在奶牛分子标记辅助选择育种中的应用。8.牛cry1基因nc_037332.1第70335656-70335661位插入/缺失多态性位点检测试剂在奶牛分子标记辅助选择育种中的应用。9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型可以作为提高奶牛繁殖力的dna标记。10.一种牛cry1基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增牛cry1基因nc_037332.1第70335656-70335661位插入/缺失多态性位点的引物。
技术总结本发明公开了一种牛CRY1基因的InDel标记在繁殖性状早期选择中的应用。以待测奶牛全基因组DNA为模板，通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，鉴定CRY1基因NC_037332.1:g.70335656-70335661位InDel位点的基因型。根据CRY1基因InDel位点的不同基因型与卵巢相关性状的关联分析结果，确定了CRY1基因InDel位点的基因型可作为提高奶牛繁殖力的DNA标记。本发明通过快速、精准的检测与繁殖力密切相关的InDel标记，可快速建立奶牛优势遗传资源群体，从而加快奶牛繁殖性状的标记辅助选择育种进程。快奶牛繁殖性状的标记辅助选择育种进程。
技术研发人员：蓝康澍 李雪兰 张珂菁 蓝昕蕊 吕润语 蓝贤勇 王勇胜 潘传英
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2022.03.22
技术公布日：2022/7/5
