淡紫紫孢菌Pth11基因及其功能验证方法

淡紫紫孢菌pth11基因及其功能验证方法
技术领域
1.本技术涉及病虫害生物防治领域，尤其是涉及淡紫紫孢菌pth11基因及其功能验证方法。


背景技术：

2.植物寄生性线虫为害水稻、小麦、玉米、大豆、蔬菜、烟草、果树等多种作物以及林木，据估计每年在全世界大约造成800亿美元的损失(jones et al 2013)。淡紫紫孢菌，原名淡紫拟青霉菌(purpureocillium lilacinum，原名paecilomyces lilacinus)是一种重要的线虫卵寄生菌，能寄生孢囊线虫、根结线虫和肾型线虫在内的多种植物病原线虫。该菌分布广泛，适应力强，是国内外线虫生物防治重要的利用和研究对象。
3.在国内外的市面上已有淡紫紫孢菌制剂商品，用于防治根结线虫、孢囊线虫，并有着良好的效果。然而，目前尚未对淡紫紫孢菌侵入线虫卵的过程进行深入研究，缺乏基因水平上的功能阐述。


技术实现要素：

4.本技术的目的在于提供两淡紫紫孢菌pth11基因——pth11-rg1和pth11-rg2，上述基因与稻瘟病跨膜蛋白编码基因pth11同源，与淡紫紫孢菌寄生线虫虫卵过程相关。进一步地，本技术还利用基因敲除技术将上述pth11基因进行功能屏蔽，获得了δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株，并利用上述基因工程菌株对淡紫紫孢菌pth11-rg1、pth11-rg2基因的功能进行验证，从而能够较为高效地进行基因水平上的功能的初步鉴定。
5.本技术的目的之一在于提供两淡紫紫孢菌pth11基因——pth11-rg1和pth11-rg2，其cdna序列如seq id no.1、seq id no.2所示。
6.上述两基因由稻瘟菌跨膜蛋白编码基因pth11作为指导，利用淡紫紫孢菌转录组和基因组测序数据筛选而得，再通过基因组pcr扩增得到其基因组全长，并对其基因结构进行预测，其对应的核酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示。
7.将淡紫紫孢菌接种于pda培养基培养15d后，用灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，并用mm培养液调节孢子浓度到1
×
107cfu/ml，培养24h得孢子液。将孢子液与分离悬浮的南方根结线虫卵液混合，调节卵的浓度为每毫升2个；同时，以不加卵的孢子液为空白对照，每个处理重复三次。分别在混合后的4h、8h、16h和24h后收集菌丝提取rna。利用qpcr实验测定pth11-rg1和pth11-rg2的相对表达量，结果如图1所示。由图1可知，8h时pth11-rg1和pth11-rg2的相对表达量均出现明显上升，至16h时达到高峰，分别是对照表达的6.56倍和5.52倍。由此可说明，pth11-rg1和pth11-rg2与淡紫紫孢菌寄生早期识别过程相关，其生物防治效果的发挥时期早于原始菌株。
8.本技术中，qpcr实验具体包括：
①
进行mrna反转录合成第一链cdna；
②
使用poweruptm sybrtm green master mix在20μl反应体系中扩增目的基因。其中，扩增程序为：94℃20s；94℃10s，60℃20s，共45cycles。pcr反应后，退火温度以每个循环0.5℃逐渐升
高温度至95℃，形成熔融曲线以检测特异性。目的基因引物为：
9.pth11-rg1-f-q：5
’‑
ggcgggagtcatgtttctca-3’；
10.pth11-rg1-r-q；5
’‑
gtcgggtttgtcgtgttagc-3’；
11.pth11-rg2-f-q：5
’‑
ctgctcgggtgtcttcatca-3’；
12.pth11-rg2-r-q：5
’‑
gttgatgccctgaatgtcgc-3’；
13.β-tubulin作为内参基因(yang et al 2011b)，引物为：
14.tubf：5
’‑
agaccatctctggcgagcat-3’；
15.tubr：5
’‑
gcatcagttgtccgtttaggca-3’。
16.本技术的目的之二在于提供两淡紫紫孢菌pth11-rg基因工程菌株，包括敲除了部分pth11-rg1或pth11-rg2的基因工程菌株δpth11-rg1或转化子δpth11-rg2。
17.本技术的目的之三在于提供利用上述淡紫紫孢菌pth11-rg基因工程菌株进行pth11-rg1、pth11-rg2基因功能验证的方法。
18.本技术的目的之四在于提供一种淡紫紫孢菌pth11基因功能验证方法，主要包括以下步骤：
19.s1.制备淡紫紫孢菌原生质体；
20.s2.以基因pth11-rg1或pth11-rg2的cdna序列为模板，分别扩增并制备prg-l+np与pt+prg-r片段(同源片段制备如图2所示)；
21.s3.混合步骤s1制备的淡紫紫孢菌原生质体和步骤s2制备的prg-l+np与pt+prg-r片段，采用peg介导淡紫紫孢菌原生质体转化，并在含g418抗生素的t-top培养基中培养3-4d，获得δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株；
22.s4.鉴定步骤s3所获得的δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株对植物寄生性线虫或其虫卵的处理能力。
23.进一步地，步骤s1具体包括：
24.s11.收集淡紫紫孢菌分生孢子，并将孢子液浓度调整至1
×
105cfu/ml；
25.s12.以体积份数比1:1000将步骤s11所得孢子液接种于tg培养基中，28℃、150rpm摇培24-36h后，收集菌丝；
26.s13.用浓度为0.7m的nacl溶液制备蜗牛酶浓度为1mg/ml、裂解酶浓度为10mg/ml的酶解液；
27.s14.向步骤s12所得菌丝中加入步骤s13制备的酶解液，30℃、150rpm裂解4-5h，过滤得滤液；
28.s15.4000rpm离心处理步骤s14所得滤液，弃上清后加入stc溶液重悬得沉淀，沉淀为淡紫紫孢菌原生质体；
29.其中，
30.步骤s15后，可采用stc溶液调整淡紫紫孢菌原生质体浓度为1
×
108个/ml，以体积份数比93：7向淡紫紫孢菌原生质体液相体系中加入dmso混匀，以冷冻管定容100μl分装，-80℃保存。
31.进一步地，步骤s2具体包括：
32.s21.通过pcr分别扩增prg-l、prg-r、np、pt片段，并使prg-l的3’端与np的5’端存在20bp重复序列、prg-r的5’端与pt的3’端存在20bp重复序列；
33.s22.通过融合pcr分别将步骤s21中prg-l与np、prg-r与pt进行融合，形成prg-l+np与pt+prg-r片段。
34.其中，步骤s21中的pcr引物包括：
35.pt-f：5
’‑
ctttgctacatccatactccatcct-3’)；
36.np-r：5
’‑
agaaggcactctttgctgcttggac-3’)；
37.步骤s22中形成的prg-l+np与pt+prg-r片段分别为：
38.pth11-rg1l-np-f：
[0039]5’‑
tcggcatattcaccggcatctctggcatgcggagagacggacg-3’；
[0040]
pt-pth11-rg1r-r：
[0041]5’‑
tgagaaacatgactcccgccctgtgcattctgggtaaacgact-3’；
[0042]
pth11-rg2l-np-f：
[0043]5’‑
cataatcgcctttgcggtccctctggcatgcggagagacggacg-3’；
[0044]
pt-pth11-rg2r-r：
[0045]5’‑
acagtagcaagtcgcagagcctgtgcattctgggtaaacgact-3’。
[0046]
进一步地，步骤s3具体包括：
[0047]
s31.取一冷冻管室温下自然解冻后，与10μl步骤s2制备的prg-l+np与pt+prg-r片段混合后，以tec溶液混匀、定容至160μl；
[0048]
s32.以体积份数比1:1向步骤s31定容溶液中滴加质量体积百分比浓度为60％的peg3350，混匀后静置20min；
[0049]
s33.以体积份数比1：3向步骤s32静置后的溶液中加入stc溶液，混匀后5000rpm离心，收集沉淀；
[0050]
s34.以250μl的stc溶液对步骤s33所得沉淀进行重悬，以重悬液涂布pdas平板，于28℃培养24h；
[0051]
s35.制备含有浓度为1.2mg/mlg418抗生素的t-top培养液，将其覆盖于步骤s34培养平板上，28℃继续培养3-4d。
[0052]
进一步地，步骤s4具体包括：
[0053]
s41.接种培养步骤s3所获得的δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株及原始菌株后，分别洗脱其分生孢子，并使用培养液培养分生孢子；
[0054]
s42.离心步骤s41所得分生孢子液，收集上清液，浸泡植物寄生性线虫，处理48h后观察植物寄生性线虫的存活情况；
[0055]
s43.制备植物寄生性线虫虫卵悬液，与步骤s41所得分生孢子液混合，共培养24h后观察植物寄生性线虫虫卵寄生情况。
[0056]
本技术中，在进行步骤s4前，可采用pcr、qrt-pcr等技术对δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株进行了基因表达情况鉴定，采用pda平板、产孢试验等方法对基因工程菌株的菌丝菌落形态和产孢能力进行了鉴定。
[0057]
具体地，包括：
[0058]
(1)pcr鉴定：
[0059]
采用dnazol试剂分提取δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株及原始菌株的dna，通过引物分别扩增对敲除子及原始菌株扩增pth11-rg1基因同源片段和pth11-rg2基
因同源片段，所用到的引物包括：
[0060]
pth11-rg1-f：5
’‑
ctcggcgctcgtttttgtg-3’；
[0061]
pth11-rg1-r：5
’‑
attcaacccttgtcgctggt-3’；
[0062]
pth11-rg2-f：5
’‑
acgttacagcctcgcatcaa-3’；
[0063]
pth11-rg2-r：5
’‑
ccaaggcctcatctccaagt-3’。
[0064]
(2)qrt-pcr鉴定：
[0065]
采用trzol试剂提取δpth11-rg1、δpth11-rg2的rna，并通过mrna反转录合成第一链cdna，通过qpcr扩增pth11-rg1和pth11-rg2，使用2-δδct评估靶标基因表达量，并使用r版本3.3.0进行分析，以观察基因表达情况。所用到引物引物同本技术目的之一所提供的qpcr实验。
[0066]
(3)pda平板测定菌丝生长：
[0067]
将δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株和原始菌株均接种于在pda培养基平板中心，28℃下培养，当对照原始菌株菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量基因工程菌株和原始菌株的菌落直径，取其平均值。并照相观察菌丝菌落形态变化。
[0068]
(4)产孢试验：
[0069]
将δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株和原始菌株分别接种于在pda培养基培养15天，然后用10ml灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用mm培养液调节孢子浓度到1
×
107cfu/ml，将该浓度的分生孢子20μl加入200ml的mm培养基上28℃，140rpm下分别培养7d，然后12000rpm离心收集分生孢子，用2ml灭菌蒸馏水重悬，显微镜下通过血球板计算法计算分生孢子浓度。
附图说明
[0070]
为了更清楚地说明本技术或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0071]
图1示出了采用qpcr实验时本技术两紫紫孢菌基因——pth11-rg1、pth11-rg2的表达动态变化情况。
[0072]
图2示出了本技术同源片段的制备示意图。
[0073]
图3示出了本技术实施例对基因工程菌株进行pcr鉴定的结果，其中，泳道1-2为δpth11-rg1阳性转化子，泳道3-4为δpth11-rg2阳性转化子，泳道5-6为原始菌株中pth11-rg1的扩增片段，泳道7为原始菌株中pth11-rg2的扩增片段。
[0074]
图4示出了本技术实施例对基因工程菌株进行qrt-pcr鉴定的结果。
[0075]
图5示出了本技术实施例中基因工程菌株与原始菌株菌丝的直径比较。
[0076]
图6示出了本技术实施例中基因工程菌株与原始菌株孢子数量比较。
[0077]
图7示出了本技术实施例中采用基因工程菌株与原始菌株上清液对水稻干尖线虫、南方根结线虫的杀伤效果分析。
具体实施方式
[0078]
在下文中，仅简单地描述了某些示例性实施例。正如本领域技术人员可认识到的那样，在不脱离本技术实施例的精神或范围的情况下，可通过各种不同方式修改所描述的实施例。因此，附图和描述被认为本质上是示例性的而非限制性的。
[0079]
实施例1
[0080]
本实施例在淡紫紫孢菌转录组和基因组测序数据中筛选得到一与稻瘟病跨膜蛋白编码基因同源的基因pth11-rg1，其cdna序列如seq id no.1所示，其核酸序列如seq id no.3所示。
[0081]
采用以下步骤制备敲除部分pth11-rg1的基因工程菌株δpth11-rg1并进行基因功能验证：
[0082]
①
常规培养淡紫紫孢菌后收集分生孢子，并将孢子液浓度调整至1
×
105cfu/ml。往100ml tg培养基中接种100μl上述孢子液，于28℃，150rpm摇培24-36h至出现细小菌丝球(此时的菌丝为幼嫩菌丝)。用4层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝，再用少量0.7m nacl溶液冲洗菌丝体以除去多余培养基，将菌丝体转移至50ml灭菌的锥形瓶中。
[0083]
②
用浓度为0.7m的nacl溶液制备蜗牛酶浓度为1mg/ml、裂解酶浓度为10mg/ml的酶解液。取10ml酶解液加入步骤
①
的锥形瓶中，30℃，150rpm裂解4-5h。镜检确认菌丝裂解程度后，过滤并用少量0.7m nacl冲洗擦镜纸以收集残留的原生质体，滤液于4℃，4000rpm离心15min。弃上清，加入1ml stc溶液轻柔重悬沉淀，4℃，4000rpm离心15min，所得沉淀即为原生质体。用stc溶液将原生质体浓度调整为1
×
108个/毫升，按照体积百分比7％的比例加入dmso，混匀后，分装成每管100μl，-80℃保存备用。
[0084]
③
通过pcr分别扩增prg-l、prg-r、np、pt片段，并使prg-l的3’端与np的5’端存在20bp重复序列、prg-r的5’端与pt的3’端存在20bp重复序列；通过融合pcr分别将步骤s21中所述prg-l与所述np、所述prg-r与所述pt进行融合，形成prg-l+np与pt+prg-r片段，
[0085]
其中，上述引物及片段序列分别为：
[0086]
pt-f：5
’‑
ctttgctacatccatactccatcct-3’；
[0087]
np-r：5
’‑
agaaggcactctttgctgcttggac-3’；
[0088]
pth11-rg1l-np-f：
[0089]5’‑
tcggcatattcaccggcatctctggcatgcggagagacggacg-3’；
[0090]
pt-pth11-rg1r-r：
[0091]5’‑
tgagaaacatgactcccgccctgtgcattctgggtaaacgact-3’。
[0092]
④
取一步骤
②
制得的冷冻管，室温下自然解冻后，与10μl步骤
③
制备的prg-l+np与pt+prg-r片段混合后，以tec溶液混匀、定容至160μl，向其中滴加160μl、质量体积百分比浓度为60％的peg3350，充分混匀后室温下静置20min。加入1ml stc溶液，轻微混匀，5000rpm离心10min，弃上清，沉淀用250μl stc轻柔重悬。每50μl涂布于一个pdas平板(原生质体不可涂布至皿边缘，需距离皿边缘0.5cm)。吹干后于28℃培养24h，在每个平板上覆盖10ml含有1.2mg/ml g418抗生素的t-top培养基，28℃继续培养3-4天。同时，按照相同转化方法在原生质体中仅加入60μl tec溶液作为对照组。
[0093]
⑤
采用dnazol试剂提取基因工程菌株δpth11-rg1及原始菌株的dna，通过引物分别扩增pth11-rg1基因同源片段，鉴定结果如图3所示。
[0094]
其中，引物分别为：
[0095]
prg1-f：5
’‑
ctcggcgctcgtttttgtg-3’；
[0096]
prg1-r：5
’‑
attcaacccttgtcgctggt-3’。
[0097]
⑥
采用trzol试剂提取基因工程菌株δpth11-rg1的rna，并通过mrna反转录合成第一链cdna。通过qpcr扩增pth11-rg1观察基因表达情况，以使用β-tubulin作为内参基因，使用2-δδct评估靶标基因表达量，并使用r版本3.3.0进行分析，鉴定结果如图4所示。
[0098]
其中，引物分别为：
[0099]
prg1-f-q：5
’‑
ggcgggagtcatgtttctca-3’；
[0100]
prg1-r-q：5
’‑
gtcgggtttgtcgtgttagc-3’；
[0101]
tubf：5
’‑
agaccatctctggcgagcat-3’；
[0102]
tubr：5
’‑
gcatcagttgtccgtttaggca-3’。
[0103]
⑦
将基因工程菌株δpth11-rg1和原始菌株接种于在pda培养基平板中心点，28℃下培养，当对照原始菌株菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量敲除菌株和原始菌株的菌落直径，取其平均值。并照相观察菌丝菌落形态变化，观察统计结果如图5所示。由图可知，基因工程菌株δpth11-rg1与原始菌株相比，在菌丝生长速度显著低于原始菌株，因此，可说明pth11-rg1基因与淡紫紫孢菌菌丝生长中起作用。
[0104]
⑧
将基因工程菌株δpth11-rg1和原始菌株接种于在pda培养基培养15d，然后用10ml灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用mm培养液调节孢子浓度到1
×
107cfu/ml。将该浓度的分生孢子20μl加入200ml mm培养基上28℃，140rpm下分别培养7d，12000rpm离心收集分生孢子，用2ml灭菌蒸馏水重悬，显微镜下通过血球板计算法计算分生孢子浓度，计算结果如图6所示。由图可知，基因工程菌株δpth11-rg1与原始菌株相比，在产孢速度上均显著低于原始菌株，因此，可说明pth11-rg1基因与淡紫紫孢菌产孢过程中起作用。
[0105]
⑨
将基因工程菌株δpth11-rg1和原始菌株接种于在pda培养基培养15d，然后用10ml灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用mm培养液调节孢子浓度到1
×
107cfu/ml，将该浓度的分生孢子20μl加入200mlmm培养基上28℃，140rpm下培养7天，然后12000rpm离心，收集上清液。于24孔板中分别加入100条南方根结线虫或水稻干尖线虫，将上清液原液和稀释2倍、4倍液取1ml加入对应的24孔板中，每个处理5次重复，处理48h后观察记录线虫的存活情况，以清水作为对照，实验平行重复三次，实验结果如图7所示。由图可知，基因工程菌株δpth11-rg1与原始菌株相比，对水稻干尖线虫的致死效果明显下降，对南方根结线虫致死效果上升。
[0106]
⑩
将基因工程菌株δpth11-rg1和原始菌株接种于在pda培养基培养15d，然后用10ml灭菌蒸馏水洗脱分生孢子用mm培养液调节孢子浓度到1
×
107cfu/ml，将分生孢子预培养24h。将预培养好的孢子液与分离悬浮的南方根结线虫或水稻干尖线虫卵液混合，调节卵的浓度为每毫升2个，以不加卵的孢子液为空白对照。分生孢子与线虫卵共培养24h后，轻柔混匀后，取10ml线虫卵液作为1个重复，置于凹面载玻片中，于显微镜下观察线虫卵寄生情况，记录总卵量和寄生卵量。每个处理5次重复，实验平行重复三次。结果中发现，基因工程菌株δpth11-rg1与原始菌株相比，对南方根结线虫或者对水稻干尖线虫卵寄生卵块寄生率明显下降。
[0107]
实施例2
[0108]
本实施例在淡紫紫孢菌转录组和基因组测序数据中筛选得到一与稻瘟病跨膜蛋白编码基因同源的基因pth11-rg2，其cdna序列如seq id no.2所示，其核酸序列如seq id no.4所示。
[0109]
采用以下步骤制备敲除部分pth11-rg2的基因工程菌株δpth11-rg2并进行基因功能验证：
[0110]
③
常规培养淡紫紫孢菌后收集分生孢子，并将孢子液浓度调整至1
×
105cfu/ml。往100ml tg培养基中接种100μl上述孢子液，于28℃，150rpm摇培24-36h至出现细小菌丝球(此时的菌丝为幼嫩菌丝)。用4层灭菌擦镜纸过滤收集菌丝，再用少量0.7m nacl溶液冲洗菌丝体以除去多余培养基，将菌丝体转移至50ml灭菌的锥形瓶中。
[0111]
④
用浓度为0.7m的nacl溶液制备蜗牛酶浓度为1mg/ml、裂解酶浓度为10mg/ml的酶解液。取10ml酶解液加入步骤
①
的锥形瓶中，30℃，150rpm裂解4-5h。镜检确认菌丝裂解程度后，过滤并用少量0.7m nacl冲洗擦镜纸以收集残留的原生质体，滤液于4℃，4000rpm离心15min。弃上清，加入1ml stc溶液轻柔重悬沉淀，4℃，4000rpm离心15min，所得沉淀即为原生质体。用stc溶液将原生质体浓度调整为1
×
108个/毫升，按照体积百分比7％的比例加入dmso，混匀后，分装成每管100μl，-80℃保存备用。
[0112]
③
通过pcr分别扩增prg-l、prg-r、np、pt片段，并使prg-l的3’端与np的5’端存在20bp重复序列、prg-r的5’端与pt的3’端存在20bp重复序列；通过融合pcr分别将步骤s21中所述prg-l与所述np、所述prg-r与所述pt进行融合，形成prg-l+np与pt+prg-r片段，
[0113]
其中，上述引物及片段序列分别为：
[0114]
pt-f：5
’‑
ctttgctacatccatactccatcct-3’；
[0115]
np-r：5
’‑
agaaggcactctttgctgcttggac-3’；
[0116]
pth11-rg2l-np-f：
[0117]5’‑
cataatcgcctttgcggtccctctggcatgcggagagacggacg-3’；
[0118]
pt-pth11-rg2r-r：
[0119]5’‑
acagtagcaagtcgcagagcctgtgcattctgggtaaacgact-3’。
[0120]
④
取一步骤
②
制得的冷冻管，室温下自然解冻后，与10μl步骤
③
制备的prg-l+np与pt+prg-r片段混合后，以tec溶液混匀、定容至160μl，向其中滴加160μl、质量体积百分比浓度为60％的peg3350，充分混匀后室温下静置20min。加入1ml stc溶液，轻微混匀，5000rpm离心10min，弃上清，沉淀用250μl stc轻柔重悬。每50μl涂布于一个pdas平板(原生质体不可涂布至皿边缘，需距离皿边缘0.5cm)。吹干后于28℃培养24h，在每个平板上覆盖10ml含有1.2mg/ml g418抗生素的t-top培养基，28℃继续培养3-4天。同时，按照相同转化方法在原生质体中仅加入60μl tec溶液作为对照组。
[0121]
⑤
采用dnazol试剂提取基因工程菌株δpth11-rg2及原始菌株的dna，通过引物分别扩增pth11-rg2基因同源片段，鉴定结果如图3所示。
[0122]
其中，引物分别为：
[0123]
prg2-f：5
’‑
acgttacagcctcgcatcaa-3’；
[0124]
prg2-r：5
’‑
ccaaggcctcatctccaagt-3’。
[0125]
⑥
采用trzol试剂提取基因工程菌株δpth11-rg2的rna，并通过mrna反转录合成第一链cdna。通过qpcr扩增pth11-rg2观察基因表达情况，以使用β-tubulin作为内参基因，
使用2-δδct评估靶标基因表达量，并使用r版本3.3.0进行分析，鉴定结果如图4所示。
[0126]
其中，引物分别为：
[0127]
prg2-f-q：5
’‑
ctgctcgggtgtcttcatca-3’；
[0128]
prg2-r-q：5
’‑
gttgatgccctgaatgtcgc-3’；
[0129]
tubf：5
’‑
agaccatctctggcgagcat-3’；
[0130]
tubr：5
’‑
gcatcagttgtccgtttaggca-3’。
[0131]
⑦
将基因工程菌株δpth11-rg2和原始菌株接种于在pda培养基平板中心点，28℃下培养，当对照原始菌株菌落长满培养皿时，用十字交叉法测量敲除菌株和原始菌株的菌落直径，取其平均值。并照相观察菌丝菌落形态变化，观察统计结果如图5所示。由图可知，基因工程菌株δpth11-rg2与原始菌株相比，在菌丝生长速度显著低于原始菌株，因此，可说明pth11-rg2基因与淡紫紫孢菌菌丝生长中起作用；同时，基因工程菌株δpth11-rg2在pda平板生长过程中没有产生紫色色素，由此，pth11-rg2基因还可能与色素产生过程相关。
[0132]
⑧
将基因工程菌株δpth11-rg2和原始菌株接种于在pda培养基培养15d，然后用10ml灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用mm培养液调节孢子浓度到1
×
107cfu/ml。将该浓度的分生孢子20μl加入200ml mm培养基上28℃，140rpm下分别培养7d，12000rpm离心收集分生孢子，用2ml灭菌蒸馏水重悬，显微镜下通过血球板计算法计算分生孢子浓度，计算结果如图6所示。由图可知，基因工程菌株δpth11-rg2与原始菌株相比，在产孢速度上均显著低于原始菌株，因此，可说明pth11-rg2基因与淡紫紫孢菌产孢过程中起作用。
[0133]
⑨
将基因工程菌株δpth11-rg2和原始菌株接种于在pda培养基培养15d，然后用10ml灭菌蒸馏水洗脱分生孢子，用mm培养液调节孢子浓度到1
×
107cfu/ml，将该浓度的分生孢子20μl加入200mlmm培养基上28℃，140rpm下培养7天，然后12000rpm离心，收集上清液。于24孔板中分别加入100条南方根结线虫或水稻干尖线虫，将上清液原液和稀释2倍、4倍液取1ml加入对应的24孔板中，每个处理5次重复，处理48h后观察记录线虫的存活情况，以清水作为对照，实验平行重复三次，实验结果如图7所示。由图可知，基因工程菌株δpth11-rg2与原始菌株相比，对水稻干尖线虫的致死效果明显下降，对南方根结线虫致死效果无明显变化。
[0134]
⑩
将基因工程菌株δpth11-rg2和原始菌株接种于在pda培养基培养15d，然后用10ml灭菌蒸馏水洗脱分生孢子用mm培养液调节孢子浓度到1
×
107cfu/ml，将分生孢子预培养24h。将预培养好的孢子液与分离悬浮的南方根结线虫或水稻干尖线虫卵液混合，调节卵的浓度为每毫升2个，以不加卵的孢子液为空白对照。分生孢子与线虫卵共培养24h后，轻柔混匀后，取10ml线虫卵液作为1个重复，置于凹面载玻片中，于显微镜下观察线虫卵寄生情况，记录总卵量和寄生卵量。每个处理5次重复，实验平行重复三次。结果中发现，基因工程菌株δpth11-rg2与原始菌株相比，对南方根结线虫或者对水稻干尖线虫卵寄生卵块寄生率明显下降。
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]

技术特征：
1.淡紫紫孢菌pth11基因，其特征在于，在淡紫紫孢菌转录组和基因组测序数据中筛选得到与稻瘟病跨膜蛋白编码基因同源的两基因pth11-rg1和pth11-rg2，两基因的cdna序列分别如seq id no.1、seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的淡紫紫孢菌pth11基因，其特征在于，pth11-rg1和pth11-rg2的核酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4所示。3.淡紫紫孢菌pth11-rg基因工程菌株，其特征在于，包括：敲除部分权利要求1或2所述的pth11-rg1的基因工程菌株δpth11-rg1；或敲除部分权利要求1或2所述的pth11-rg2的基因工程菌株δpth11-rg2。4.淡紫紫孢菌pth11-rg基因工程菌株的应用，其特征在于，用于验证权利要求1或2所述淡紫紫孢菌pth11基因功能。5.一种淡紫紫孢菌pth11基因功能验证方法，其特征在于，包括以下步骤：s1.制备淡紫紫孢菌原生质体；s2.以权利要求1所述的淡紫紫孢菌pth11基因的cdna序列为模板，分别扩增并制备prg-l+np与pt+prg-r片段；s3.混合步骤s1制备的淡紫紫孢菌原生质体和步骤s2制备的prg-l+np与pt+prg-r片段，采用peg介导淡紫紫孢菌原生质体转化，并在含g418抗生素的t-top培养基中培养3-4d，获得δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株；s4.鉴定步骤s3所获得的δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株对植物寄生性线虫或其虫卵的处理能力。6.根据权利要求5所述的淡紫紫孢菌pth11基因的应用方法，其特征在于，步骤s1具体包括：s11.收集所述淡紫紫孢菌分生孢子，并将孢子液浓度调整至1
×
105cfu/ml；s12.以体积份数比1:1000将步骤s11所得孢子液接种于tg培养基中，28℃、150rpm摇培24-36h后，收集菌丝；s13.用浓度为0.7m的nacl溶液制备蜗牛酶浓度为1mg/ml、裂解酶浓度为10mg/ml的酶解液；s14.向步骤s12所得菌丝中加入步骤s13制备的酶解液，30℃、150rpm裂解4-5h，过滤得滤液；s15.4000rpm离心处理步骤s14所得滤液，弃上清后加入stc溶液重悬得沉淀，所述沉淀为淡紫紫孢菌原生质体；其中，步骤s15后，可采用stc溶液调整所述淡紫紫孢菌原生质体浓度为1
×
108个/ml，以体积份数比93：7向淡紫紫孢菌原生质体液相体系中加入dmso混匀，以冷冻管定容100μl分装，-80℃保存。7.根据权利要求5所述的淡紫紫孢菌pth11基因的应用方法，其特征在于，步骤s2具体包括：s21.通过pcr分别扩增prg-l、prg-r、np、pt片段，并使prg-l的3’端与np的5’端存在20bp重复序列、prg-r的5’端与pt的3’端存在20bp重复序列；
s22.通过融合pcr分别将步骤s21中所述prg-l与所述np、所述prg-r与所述pt进行融合，形成prg-l+np与pt+prg-r片段。8.根据权利要求7所述的淡紫紫孢菌pth11基因的应用方法，其特征在于，pcr引物包括：pt-f：5
’‑
ctttgctacatccatactccatcct-3’；np-r：5
’‑
agaaggcactctttgctgcttggac-3’；形成的prg-l+np与pt+prg-r片段分别为：pth11-rg1l-np-f：5
’‑
tcggcatattcaccggcatctctggcatgcggagagacggacg-3’；pt-pth11-rg1r-r：5
’‑
tgagaaacatgactcccgccctgtgcattctgggtaaacgact-3’；pth11-rg2l-np-f：5
’‑
cataatcgcctttgcggtccctctggcatgcggagagacggacg-3’；pt-pth11-rg2r-r：5
’‑
acagtagcaagtcgcagagcctgtgcattctgggtaaacgact-3’。9.根据权利要求6所述的淡紫紫孢菌pth11基因的应用方法，其特征在于，步骤s3具体包括：s31.取一所述冷冻管室温下自然解冻后，与10μl所述步骤s2制备的prg-l+np与pt+prg-r片段混合后，以tec溶液混匀、定容至160μl；s32.以体积份数比1:1向步骤s31定容溶液中滴加质量体积百分比浓度为60％的peg3350，混匀后静置20min；s33.以体积份数比1：3向步骤s32静置后的溶液中加入stc溶液，混匀后5000rpm离心，收集沉淀；s34.以250μl的stc溶液对步骤s33所得沉淀进行重悬，以重悬液涂布pdas平板，于28℃培养24h；s35.制备含有浓度为1.2mg/mlg418抗生素的t-top培养液，将其覆盖于步骤s34培养平板上，28℃继续培养3-4d。10.根据权利要求5所述的淡紫紫孢菌pth11基因的应用方法，其特征在于，步骤s4具体包括：s41.接种培养步骤s3所获得的δpth11-rg1、δpth11-rg2基因工程菌株及原始菌株后，分别洗脱其分生孢子，并使用培养液培养分生孢子；s42.离心步骤s41所得分生孢子液，收集上清液，浸泡所述植物寄生性线虫，处理48h后观察所述植物寄生性线虫的存活情况；s43.制备所述植物寄生性线虫虫卵悬液，与步骤s41所得分生孢子液混合，共培养24h后观察所述植物寄生性线虫虫卵寄生情况。

技术总结
本申请提供了两个与稻瘟病跨膜蛋白编码基因pth11同源的淡紫紫孢菌基因Pth11-rg1和Pth11-rg2，利用基因敲除技术将上述Pth11基因进行功能屏蔽，获得了ΔPth11-rg1、ΔPth11-rg2基因工程菌株，并利用上述基因工程菌株对淡紫紫孢菌Pth11-rg1、Pth11-rg2基因的功能进行验证，从而能够较为高效地进行基因水平上的功能的初步鉴定。功能的初步鉴定。


技术研发人员：姬红丽 谢家廉 杨芳 徐幸 于文娟
受保护的技术使用者：四川省农业科学院植物保护研究所
技术研发日：2022.03.30
技术公布日：2022/7/5