一株嗜热链球菌菌株wgy001，其复合菌株及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株嗜热链球菌菌株 wgy001，其复合菌株及其在生产开发活菌型常温酸奶中的应用。
背景技术：2.乳制品是除母乳外，营养最为全面的食品，他在人们膳食结构中有着其他食品无法代替的地位和作用，而发酵是人类用于延长乳制品保存时间的最古老方法之一，虽然没有酸奶起源的详细记载，酸奶源于久远的过去并对人类营养和健康产生了深远影响是毋庸置疑的。酸奶是乳制品中的重要部分，因其风味独特、营养价值高以及对人体健康有特殊的作用，从而倍受人们青睐。
3.酸奶是含活菌的乳制品，正常发酵结束后，为保证产品在贮存、运输、销售、食用过程中因产品中乳酸菌继续生长繁殖导致的后酸化使产品感官质量下降问题，在酸奶制品的贮存、运输及销售过程中均需使用冷链运输。这极大地增加了企业的成本，同时也不利于环境的保护。因此，筛选开发活菌型的常温酸奶对于产品货架期、产品贮存、运输、销售环节具有重要意义。
技术实现要素：4.针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一株嗜热链球菌菌株lse-202002ae320011-wgy001，其复合菌株及其在生产开发活菌型常温酸奶中的应用，使酸奶在28℃条件下保存21天后滴定酸度保持在90
°
t以下。
5.为实现上述目的，本发明所述的应用于活菌型常温酸奶开发的一 株嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001的筛选方法为：采集乳 扇制作过程中的乳扇，用mrs、tja液体培养基富集培养，然后通 过平板划线的方法对菌株进行分离纯化，得到不同菌株的纯培养物， 并对分离纯化菌株进行滴定酸度、粘度、胞外多糖产量等特性测定， 最后得到一株低后酸球菌lse-202002ae320011-wgy001(简称菌株 wgy001)，菌株保藏编号为cgmcc no.21846，其分类命名为：嗜 热链球菌(streptococcus thermophilus)，于2021年3月1日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称： cgmcc，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科 学院微生物研究所。将获得的菌株进行16s rrna鉴定，最终鉴定结 果表明菌株wgy001为嗜热链球菌，其16s rrna基因序列如seq idno.1所示。
6.本发明还从毛豆腐卤水中分离得到一株德氏乳杆菌保加利亚(lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)菌株lsr-l-l11，所述德氏乳杆菌保加利亚菌株保藏编号为cgmcc no.14755，于2017年9 月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称：cgmcc，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明中德氏乳杆菌保加利亚菌株 lsr-l-l11在10％脱脂乳培养基中，38℃发酵18h胞外多糖产量为 120-150mg/l。
7.本发明还提供一种复合发酵菌种，所述复合发酵菌种含有所述的嗜热链球菌wgy001及德氏乳杆菌(lactobacillus delbrueckii subsp)菌株lsr-l-l11。
8.优选地，所述嗜热链球菌菌株wgy001与德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11的比例为9～19∶1。
9.优选地，所述嗜热链球菌菌株wgy001与德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11的比例为19∶1，所获得的酸奶产品在28℃条件下保存21天滴定酸度低于90
°
t。
10.本发明还提供将嗜热链球菌菌株wgy001在生产活菌型常温酸奶中的应用。
11.本发明还提供将所述的复合发酵菌种在生产活菌型常温酸奶中的应用。
12.与现有技术相比，本发明的有益效果有：
13.1、本发明菌株嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001于38 ℃条件下发酵4h后凝乳，发酵120h滴定酸度为92
°
t。德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11于38℃条件下发酵8h后凝乳，发酵120h滴定酸度为150
°
t。
14.2、本发明中德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11在10％脱脂乳培养基中，38℃发酵18h胞外多糖产量为120-150mg/l。
15.3、嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001与德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11产香好、酸味柔和、粘度高。组合后发酵产品在 28℃条件下保存21天滴定酸度低于90
°
t。
16.4、本发明可有效解决现有活菌型发酵乳制品在储存、运输及销售过程中受冷链要求限制导致产品后酸上升快等问题。与此同时，该方法可有效降低活菌型发酵乳制品在储存、运输及销售过程中因冷链保护所带来的高昂成本。
附图说明
17.图1为嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001经革兰氏染色后的显微图片。
18.图2为嗜热链球菌qmq004经革兰氏染色后的显微图片。
19.图3为不同温度对嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001生长情况的影响。
20.图4为不同温度对德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11生长情况的影响。
21.图5为不同温度对嗜热链球菌qmq004生长情况的影响。
22.图6为嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001、qmq004和德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11于38℃条件下，在10％脱脂乳中发酵120h滴定酸度变化情况。
23.图7为嗜热链球菌qmq004与德氏乳杆菌保加利亚菌株 lsr-l-l11以不同比例发酵酸奶基料在28℃保存条件下滴定酸度变化情况。
24.图8为嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001与德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11以不同比例发酵酸奶基料在28℃保存条件下滴定酸度变化情况。
25.图9为嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001与德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11发酵产品与常规使用的搅拌型菌株发酵酸奶基料在28℃保存条件下滴定酸度对比。
具体实施方式
26.下面结合实施例，进一步阐述本发明，但不限于实施例。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均
可从商业途径得到。
27.实施例1
28.一种常温型活菌酸奶的菌株分离以及制作，所述方法是用mrs 及tja两种培养基分离纯化乳扇乳扇中的乳酸菌，具体包括下述步骤：
29.(1)制作mrs液体培养基：具体方法为向1000ml水中加入20g 葡萄糖、10g酪蛋白质胨、10g牛肉浸膏、5g酵母浸粉、5g无水乙酸钠、2g柠檬酸三铵、2g磷酸氢二钾、1ml吐温-80、0.25g硫酸锰及 0.58g硫酸镁，硫酸镁及硫酸锰分开溶解后与其余成分混合，调节ph 值6.4
±
0.2，121℃灭菌15min，备用。mrs固体培养基配制方法为向 mrs培养基中添加1.5％(质量体积比)琼脂。
30.(2)制作tja液体培养基：50ml番茄汁，5g酵母浸粉，10g 牛肉浸膏，20g乳糖，2g葡萄糖，2g磷酸氢二钾，1ml吐温-80，5g 无水乙酸钠，纯净水定容到1000ml，调节ph值6.8
±
0.2，121℃灭菌 15min，备用。tja固体培养基配制方法为向tja培养基中添加1.5％(质量体积比)琼脂。
31.(3)按5％的接种量将采集获得的乳扇制作过程中的乳扇接种于mrs和tja液体培养基中进行富集，38℃培养18h。用接种环挑取富集液在mrs和tja固体培养基上划线，在38℃下培养48h。用接种环挑取样品在mrs和tja固体培养基上划线，在38℃下培养 48h。
32.(4)挑取单菌落，接种于mrs和tja液体培养基中，38℃培养 18h。用接种环挑取富集液在mrs和tja固体培养基上划线，38℃培养48h，重复上述操作直到获得纯培养菌株为止。
33.(5)对纯培养的菌株进行革兰氏染色，舍弃革兰氏阴性菌，保留革兰氏阳性菌。
34.革兰氏染色方法：取菌液常规涂片、干燥、固定；滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)染色1-2min，水洗；用碘液冲去残水，并用碘液覆盖1min，水洗；用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗；用番红液复染2min，水洗；干燥后，用油镜观察。
35.(6)将获得的纯培养菌株革兰氏阳性菌株分别转移至mrs和 tja斜面培养基中，于4℃条件下保藏。
36.实施例2
37.一种常温型活菌酸奶的菌株分离以及制作，所述方法是通过分子生物学方法鉴定分离菌株，具体包括下述步骤：
38.(1)制作mrs和tja液体和固体培养基：同实施例1。
39.(2)纯培养菌株接种至mrs和tja液体培养基中，38℃静置培养18h，充分活化。
40.(3)基因组dna提取：
①
取活化好的菌液1ml加入1.5ml离心管中，室温8000rpm离心1min，弃上清，收集菌体。
②
加入100μlbuffer digestion和80μl溶菌酶溶液重悬菌液，37℃水浴30min。
③
加入20μl proteinase k溶液，震荡混匀。56℃水浴30min至细胞完全裂解。
④
水浴后加入20μl的rnase a(10mg/ml)，室温放置2-5min。
⑤
加入200μl buffer bd，充分颠倒混匀，70℃水浴10min。
⑥
加入 200μl的无水乙醇，充分颠倒混匀。
⑦
将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再12000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500μl pw solution，10000rpm离心30s倒掉滤液。将吸附柱放回收集管，加入500μl wash solution，10000rpm离
心30s倒掉滤液。将吸附柱放回收集管，于12000rpm室温离心2min，离去残留的 wash solution。取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入 50-100μl ce buffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集dna 溶液，放-20℃保存。
41.(4)16s rrna片段扩增：在无菌结净的pcr管中配制反应溶液。
42.表1 50μlpcr反应体系
[0043][0044][0045]
轻轻混匀后短暂离心，置于pcr仪中进行反应。pcr反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸 1.5min，循环结束后72℃延伸10min。反应完成后，将样品置于-20 ℃保存，并将样品送于华大基因进行测序鉴定。
[0046]
表2球菌测序结果
[0047]
菌株编号测序鉴定结果qmq001乳酸乳球菌qmq002嗜热链球菌qmq003乳酸乳球菌qmq004嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001嗜热链球菌wgy002乳酸乳球菌wgy003嗜热链球菌wgy004唾液链球菌
[0048]
实施例3
[0049]
一种常温型活菌酸奶的菌株分离以及制作，所述方法是通过发酵脱脂乳来筛选低后酸的菌株，具体包括下述步骤：
[0050]
(1)制作mrs液体培养基：同实施例1。
[0051]
(2)制作tja液体培养基：同实施例1。
[0052]
(3)10％脱脂乳的配制：10g脱脂奶粉溶于90g 50℃水中，根据实验所需要的10％
脱脂乳的量称取所需量的脱脂奶粉溶于所需量的 50℃水中，待奶粉全部溶化后，115℃灭菌15min，冷却至38℃后备用。
[0053]
(4)将保存好的纯菌株取出，用mrs培养基和tja培养基使其充分活化，按2％接种量接种于10％脱脂乳中，38℃发酵24h。取出测定其酸度。
[0054]
(5)滴定酸度测定方法为：准确称取相应时间段发酵基料10.0 g，加入20ml水，摇匀后加入2ml酚酞指示剂，以1.0mol/l氢氧化钠进行滴定，记录消耗氢氧化钠体积。滴定酸度(
°
t)＝消耗氢氧化钠体积(ml)
×
10。
[0055]
表3分离出的菌株24h酸度结果
[0056][0057][0058]
根据后酸结果选取lse-202002ae320011-wgy001和qmq004与现有菌株lsr-l-l11进行后续的试验。
[0059]
lse-202002ae320011-wgy001在tja固体培养基上的菌落为乳白色、湿润光滑、不透明，为革兰氏染色阳性菌，显微镜观察结果为链状球菌，革兰氏染色镜检照片见图1。
[0060]
qmq004的菌落在mrs固体培养基上的菌落为乳白色、不透明小圆点，为革兰氏染色阳性菌，显微镜观察结果为短链球，qmq004 革兰氏染色镜检照片见图2。
[0061]
lse-202002ae320011-wgy001和qmq004两株菌株为嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)，lse-202002ae320011-wgy001 16srrna序列如seq id no.1所示。
[0062]
实施例4
[0063]
一种常温型活菌酸奶的菌株分离以及制作，所述方法是测定两株菌株嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001和qmq004以及德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11的发酵性能，具体包括下述步骤：
[0064]
(1)制作mrs和tja液体和固体培养基：同实施例1。
[0065]
(2)活化lse-202002ae320011-wgy001、qmq004和lsr-l-l11：吸取甘油管保存的菌
液50μl，按体积比为2％的接种量接种至mrs 和tja液体培养基中，38℃静置培养18h。
[0066]
(3)10％脱脂乳的配制：10g脱脂奶粉溶于90g 50℃水中，根据实验所需要的10％脱脂乳的量称取所需量的脱脂奶粉溶于所需量的50℃水中，待奶粉全部溶化后，115℃灭菌15min，冷却至38℃后备用。
[0067]
(4)以300μl的样品量为基准按2％接种量接于样品孔中，加样完毕后放入生长曲线仪，分别测定不同温度下(32℃、38℃、42℃)两株菌株的生长曲线，培养时间为24h。
[0068]
(5)酸度曲线测定：分别测定发酵0h、2h、4h、6h、8h、10h、 12h、24h、48h、72h、96h、120h时的滴定酸度。按步骤(1)、(2)、(3)准备lse-202002ae320011-wgy001和lsr-l-l11和10％脱脂奶乳，按2％接种量将活化好的菌液接入10％脱脂乳中于38℃发酵。滴定酸度测定方法为：准确称取相应时间段发酵基料10.0g，加入20ml水，摇匀后加入2ml酚酞指示剂，以1.0mol/l氢氧化钠进行滴定，记录消耗氢氧化钠体积。滴定酸度(
°
t)＝消耗氢氧化钠体积(ml)
×
10。
[0069]
三株菌株生长曲线结果如图3、图4和图5所示。lsr-l-l11在 38℃时od值最高，即最适生长温度为38℃； lse-202002ae320011-wgy001在32℃和38℃时都能达到最大od值，但32℃延滞期较长，所以其最适生长温度为38℃；qmq004在38 ℃和42℃发酵前6h生长速率无显著性差异，发酵6h后，38℃条件下生长速率优于42℃发酵条件下生长速率。32℃条件下发酵最大od 值与在38℃和42℃条件下发酵无显著性差别，但是此条件下发酵延滞期较长，所以其最适生长温度为38℃。
[0070]
38℃时lse-202002ae320011-wgy001、qmq004和lsr-l-l11 在10％脱脂乳中发酵120h的产酸曲线结果见图6。lsr-l-l11发酵8h 左右凝乳，凝乳时滴定酸度为60
°
t，发酵120h时滴定酸度为150
°
t； lse-202002ae320011-wgy001发酵4h左右凝乳，凝乳时滴定酸度为 50
°
t，发酵120h时滴定酸度为92
°
t；qmq004发酵2h开始出现凝乳现象，4h完全凝乳，酸度为65
°
t，发酵120h时滴定酸度为88
°
t。
[0071]
实施例5
[0072]
一种常温型活菌酸奶的菌株分离以及制作，所述方法是测定德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11的胞外多糖产量，具体包括下述步骤：
[0073]
胞外多糖在酸奶中可以改善酸奶常出现的凝胶易断裂，粘稠度低，乳扇易于析出等质量问题，发酵好的酸奶粘稠度与胞外多糖的含量成正相关，lsr-l-l11转接的奶管能看到明显的拉丝状态所以测其胞外多糖的含量。
[0074]
(1)制作mrs和tja液体和固体培养基：同实施例1。
[0075]
(2)活化lsr-l-l11：同实施例4。
[0076]
(3)10％的脱脂乳配制：同实施例3。
[0077]
(4)按2％的接种量接种于含10％的脱脂乳中，38℃培养18h取出测定其胞外多糖含量。胞外多糖含量的测定方法如下：将发酵好的样品经100℃水浴加热15min，冷却，以失活降解多糖的酶，加入 80g/100ml三氯乙酸至终质量浓度为4g/100ml，4℃恒温静置18h，后离心(12000rpm，20min，4℃)，去除沉淀蛋白和菌体，上清液添加 95％乙醇至终浓度为75％，摇匀，4℃静置22h，离心(12000rpm，20min， 4℃)，沉淀用去离子水溶解，所得的溶液使用3500mw透析袋进行透析，每天换一次水，共透析3天。透析完成后，冷冻干燥所得样品。
[0078]
lsr-l-l11用10％脱脂乳在38℃下培养18h后，发酵液胞外多糖含量测定结果为
138.9mg/l。
[0079]
实施例6
[0080]
一种常温型活菌酸奶的菌株分离以及制作，所述方法是测定不同比例组合两株菌株嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001、 qmq004和德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11在脱脂乳中发酵成工作发酵剂发酵产品的后酸对比，具体包括下述步骤：
[0081]
(1)制作mrs和tja液体和固体培养基：同实施例1。
[0082]
(2)活化lse-202002ae320011-wgy001、qmq004和lsr-l-l11：同实施例4。
[0083]
(3)10％脱脂乳的配制：同实施例3。
[0084]
(4)基料配制：称取相应的辅料、糖、牛奶，牛奶加热到60℃备用，搅拌机中放入辅料和糖，加入60℃的牛奶，开启搅拌混合10 分钟，搅拌完毕后与剩余牛奶混合，定容到所需的量，在20mpa条件下进行均质，然后分装在玻璃瓶中，进行水浴杀菌，水沸后开始计时，半小时后拿出冷却备用。
[0085]
(5)将活化好的lse-202002ae320011-wgy001、qmq004和 lsr-l-l11，按体积比为2％的接种量接种至10％的脱脂奶管中，38 ℃下静置培养18h。脱脂奶瓶按接种量1％(其中 lse-202002ae320011-wgy001：lsr-l-l11和qmq004：lsr-l-l11 的比例为1∶1、9∶1、19∶1)接种在10％脱脂奶瓶中，38℃下静置培养8h，4℃后熟后作为酸奶生产发酵剂。
[0086]
(6)步骤4中基料加热到40℃，按1％接种量接入步骤5中制备的工作发酵剂，放入38℃温箱发酵6h，发酵结束后破乳冷却，放入冰箱后熟。后熟后放入28℃的恒温箱测其21天的后酸，滴定酸度方法同实施例2。
[0087]
表4成品粘度
[0088][0089]
28℃恒温保存21天后酸情况见图7、图8，qmq004：lsr-l-l11 的比例为1∶1时后酸为142
°
t，9∶1时后酸为117
°
t，19∶1后酸为110
°
t。 lse-202002ae320011-wgy001：lsr-l-l11的比例为1∶1时后酸为 108
°
t，9∶1时后酸为94
°
t，19∶1后酸为80
°
t。
[0090]
实验结果表明，qmq004：lsr-l-l11组合后不管是何种比例后酸都高于lse-202002ae320011-wgy001：lsr-l-l11组合，随着球杆比增大成品的粘度是在下降的，为了保证成品粘度，满足后酸低于90
°
t 的要求所以选取lse-202002ae320011-wgy001：lsr-l-l11比例为 19∶1的组合作为生产发酵剂。
[0091]
实施例7
[0092]
一种常温型活菌酸奶的菌株分离以及制作，所述方法是测定两株菌株嗜热链球菌lse-202002ae320011-wgy001和德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11以19∶1组合后做发酵工作发酵剂，用此工作发酵剂发酵基料的后酸变化情况，具体包括下述步骤：
[0093]
(1)制作mrs和tja液体和固体培养基：同实施例1。
[0094]
(2)活化lse-202002ae320011-wgy001和lsr-l-l11：同实施例4。
[0095]
(3)基料制作：同实施例6步骤(4)。
[0096]
(4)制作工作发酵剂：工作发酵剂一同实施例6中步骤(5)，工作发酵剂二为常规使
用的搅拌型菌株。
[0097]
(5)将步骤(3)中的基料加热到40℃，按1％接种量接入步骤(4)中的工作发酵剂，38℃发酵6h，发酵结束后破乳冷却，于4℃温度下后熟。后熟后放入28℃的恒温箱测其21天的后酸，滴定酸度方法同实施例4。
[0098]
28℃恒温保存21天后酸情况见图7，常规使用的搅拌型菌株发酵的酸奶后酸在第四天超过了100
°
t，最高后酸为120
°
t， lse-202002ae320011-wgy001与lsr-l-l11后酸保持在90
°
t以下。
技术特征：1.一株嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)菌株wgy001，其特征在于，所述菌株保藏编号为cgmcc no.21846。2.如权利要求1所述的一株嗜热链球菌菌株wgy001，其特征在于，所述菌株16s rrna基因序列如seq id no.1所示。3.一种复合发酵菌种，其特征在于，所述复合发酵菌种含有权利要求1或2所述的嗜热链球菌wgy001及德氏乳杆菌保加利亚(lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)菌株lsr-l-l11，所述德氏乳杆菌保加利亚菌株保藏编号为cgmcc no.14755。4.如权利要求3所述的一种复合发酵菌种，其特征在于，所述嗜热链球菌菌株wgy001与德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11的比例为9～19∶1。5.如权利要求4所述的一种复合发酵菌种，其特征在于，所述嗜热链球菌菌株wgy001与德氏乳杆菌保加利亚菌株lsr-l-l11的比例为19∶1。6.如权利要求1或2所述的嗜热链球菌菌株wgy001在生产活菌型常温酸奶中的应用。7.如权利要求3～5任一项所述的复合发酵菌种在生产活菌型常温酸奶中的应用。
技术总结本发明提供一株嗜热链球菌菌株WGY001及其应用，其特征在于，所述菌株保藏编号为CGMCC No.21846，本发明还提供一种复合发酵菌种及其应用，所述复合发酵菌种含有所述的嗜热链球菌WGY001及德氏乳杆菌保加利亚菌株LSR-L-L11，所述德氏乳杆菌保加利亚菌株保藏编号为CGMCC No.14755。本发明菌株嗜热链球菌WGY001及复合发酵菌种可有效解决现有活菌型发酵乳制品在储存、运输及销售过程中受冷链要求限制导致产品后酸上升快等问题，使酸奶在28℃条件下保存21天后滴定酸度保持在90
技术研发人员：吴文娟 赵世伟 郝亚琴 李路梅 李琼莹 尹柯茹 王爱梅 王博文 何开旺 王建军
受保护的技术使用者：云南皇氏来思尔乳业有限公司
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/7/5
