一种
β-葡萄糖苷酶突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。
背景技术：2.β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases ec 3.2.1.21)，全称β-d-葡萄糖苷水解酶，属水解酶类，又称纤维二糖酶、龙胆二糖酶或苦杏仁苷酶。该酶可以水解结合于末端的非还原性的β-d-糖苷键，同时释放出β-d-葡萄糖以及相应的配基。β-葡萄糖苷酶因对多种糖苷类化合物具有水解活性，可作用于多种生物活性物质，其水解产生的配基多为功能性苷元或芳香成分；有的β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，可转化生成功能性低聚糖，因此在食品保健，生物能源等领域具有广阔的应用前景。
3.由于在实际生产过程中，酶常处于不利环境，β-葡萄糖苷酶受到产物-葡萄糖的影响，导致生产效率低下，底物反映不充分等问题的出现。通常采用增加酶量、同步糖化发酵法(ssf)等措施来缓解产物的抑制作用，但这些方法工艺复杂，污染大、成本较高。为使催化反应高效地进行，目前亟需获得具有高耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。同时葡萄糖耐受性作为β-葡萄糖苷酶的关键性质在生物燃料、食品保健和生物合成等生产过程中也越来越受到重视。具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶因可降低葡萄糖对酶活力的抑制作用，而显示出独特的应用潜能。cn102220302a以来自海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶为基础，通过pcr定点突变，获得突变基因，相对野生型β-葡萄糖苷酶蛋白，获得的突变蛋白的葡萄糖耐受浓度提高了13倍。cn103266096a通过将β-葡萄糖苷酶基因pbgl的386位的色氨酸突变成半胱氨酸，得到β-葡萄糖苷酶突变体pbgl-w386c，葡萄糖的耐受性是突变前的11.88倍，提高了10.88倍。cn105754973a通过将链霉菌的β-葡萄糖苷酶s-bgl6分子上的233位色氨酸突变成天冬氨酸而得到β-葡萄糖苷酶突变体，和突变前相比，葡萄糖的耐受性提高了208.9倍。cn107142254a将来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌alicyclobacillus sp.a4的β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，得到较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体，在相同条件下，葡萄糖对突变体和野生型的酶活促进作用分别为212％和163％。
技术实现要素：4.针对当前产业需求和现有技术的不足，本发明主要目的是通过定点突变技术构建一种具有良好的葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶突变体。
5.为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
6.第一方面，本发明提供一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如seq id no：4所示。
7.第二方面，本发明提供编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。
8.第三方面，本发明提供包含所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因的载体。
9.第四方面，本发明提供包含如上所述基因或载体的重组菌株。
10.第五方面，本发明提供如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的用途，其用于水解糖苷或寡糖化合物非还原性末端的β-d-葡萄糖苷键，产生β-d-葡萄糖与相应配基；并且，所述突变体相比野生型具有提高的葡萄糖耐受性。
11.第六方面，本发明提供制备如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因或本发明所述载体进行基因重组和表达。
12.第七方面，本发明提供一种水解糖苷类化合物尤其是纤维二糖或纤维寡糖的方法，该方法包括使糖苷类化合物与本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体或与本发明所述重组菌株接触的步骤，在能够通过所述β-葡萄糖苷酶突变体或所述重组菌株的酶促催化作用水解化合物的β-d-葡萄糖苷键的条件下进行。
13.有益效果：
14.本发明通过定点突变技术获得的β-葡萄糖苷酶突变体，通过基因工程技术在毕赤酵母系统中进行了重组和表达，相同条件下，本发明突变体可在400mmol/l葡萄糖的激活下最高达到239.0％的相对活力，在葡萄糖浓度为1.5mol/l时，其相对活力仍能达到112.61％，相比野生型具有显著提高的葡萄糖耐受能力。本发明的突变体在生物燃料、食品保健和生物合成等领域具有较高的应用价值。
附图说明
15.图1：实施例中野生型β-葡萄糖苷酶基因的pcr扩增电泳图；其中：1为阴性对照，2为dna marker，3为野生型bglhi基因。
16.图2：实施例中野生型与突变体在不同浓度葡萄糖激活下的相对酶活力。
17.图3：实施例中突变体的纯化蛋白电泳验证；其中：1为蛋白marker，2、3为重组菌株gs115/ppic9k-bglhim，4为对照菌株gs115/ppic9k。
18.图4：本发明β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列。
具体实施方式
19.下面通过具体的实施方案进一步叙述本发明。除非特别说明，以下实施方案所涉及的技术手段、材料等均可以是本领域技术人员所公知的，可以在已知的能解决相应技术问题的手段和材料中选择合适的。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
20.第一方面，本发明提供一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如seq id no：4所示。
21.第二方面，本发明提供编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。
22.根据本发明一种优选的实施方式，所述基因的核苷酸序列如seq id no：3所示。
23.第三方面，本发明提供包含所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因的载体。所述载体可以是本领域技术人员已知的通过基因重组制备蛋白质的载体之一，例如表达载体。
24.根据本发明一种优选的实施方式，所述载体是ppic9k质粒。
25.第四方面，本发明提供包含如上所述基因或载体的重组菌株。所述重组菌株可以
是适合于从本发明的基因或载体生产本发明的β-葡萄糖苷酶突变体的任何宿主，例如毕赤酵母。
26.根据本发明一种优选的实施方式，所述宿主是毕赤酵母gs115。
27.根据本发明另一种具体实施方式，所述宿主是大肠杆菌jm109。
28.第五方面，本发明提供如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的用途，其用于水解糖苷或寡糖化合物非还原性末端的β-d-葡萄糖苷键，产生β-d-葡萄糖与相应配基；并且，所述突变体相比野生型具有提高的葡萄糖耐受性。
29.第六方面，本发明提供制备如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因或本发明所述载体进行基因重组和表达。可以使用本领域技术人员已知的基因重组方法和表达宿主，并选择适合于宿主表达的培养基和培养条件。所述方法还可以包括回收所述β-葡萄糖苷酶突变体的步骤，该回收步骤可能涉及了将β-葡萄糖苷酶突变体从宿主的培养物或表达产物中进行分离或纯化的步骤，可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行。
30.根据本发明一种优选的实施方式，所述突变体的制备方法如下：将突变体基因与质粒ppic9k进行经ecor i和avr ii相同双酶切并连接获得重组载体，转化入大肠杆菌宿主jm109中，质粒经sac i线性化后最终电转到毕赤酵母gs115中进行表达，经阴离子交换柱等纯化蛋白并验证其酶活力，获得了一种相比野生型具有提高的葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶突变体。
31.第七方面，本发明提供一种水解糖苷类化合物尤其是纤维二糖或纤维寡糖的方法，该方法包括使糖苷类化合物与本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体或与本发明所述重组菌株接触的步骤，在能够通过所述β-葡萄糖苷酶突变体或所述重组菌株的酶促催化作用水解化合物的β-d-葡萄糖苷键的条件下进行。
32.本发明中采用如下定义：
33.1、氨基酸和dna核酸序列的命名法
34.氨基酸残基使用公认iupac命名法，用三字母缩写或单字母符号形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。
35.2、β-葡萄糖苷酶突变体的标识
36.采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示β-葡萄糖苷酶突变体中突变的氨基酸。本发明突变体是如seq id no：2所示的β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中第331位的苏氨酸(t)替换成谷氨酰胺(q)，以t331q或thr331gln表示。突变体的基因突变位点如下：
[0037][0038]
以下将通过具体的实施例对本发明进行更详细描述。如无特别说明，以下实施例中：
[0039]
本发明所用培养基及酶活测定方法：
[0040]
lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l，固体培养基加入琼脂18g/l，其他成分一致。
[0041]
md固体培养基：葡萄糖20g/l，琼脂18g/l。
[0042]
ypd培养基：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l，固体培养基加入琼脂18g/l，其他成分一致。
[0043]
ypg培养基：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，丙三醇20g/l。
[0044]
bmgy培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g溶于700ml水121℃灭菌20min，使用时60℃下加入100ml ph 6.0，1mol/l磷酸钾缓冲溶液，100ml 10
×
ynb，2ml 500
×
生物素，100ml 10
×
甘油。
[0045]
bmmy培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g溶于700ml水121℃灭菌20min，使用时60℃下加入100ml 1mol/l磷酸钾缓冲液ph 6.0，100ml10
×
ynb，2ml 500
×
生物素，2.5ml甲醇。
[0046]
mes缓冲液：称重3.91gmes溶于水，用tris碱溶液调节ph至6.5，加水定容至1l。
[0047]
buffer a：终浓度为20mmol/l、ph 6.5mes缓冲液，过除菌膜备用。
[0048]
buffer b：终浓度为20mmol/l、ph 6.5mes缓冲液和终浓度为1mol/l的nacl溶液，过0.22μm除菌膜备用。
[0049]
g418筛选培养基：按照浓度(0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml)融化ypd培养基于55℃左右下加入混匀使用；其他抗性筛选培养基加入相应浓度的抗性。
[0050]
大肠杆菌感受态制备培养基
[0051]
大肠杆菌复苏，lb培养基。
[0052]
洗液培养基：每升中加入cacl
2 11.1g；
[0053]
重悬液培养基：1.5ml甘油，8.5ml 11.1g/l cacl2溶液；
[0054]
毕赤酵母感受态制备培养基：
[0055]
ypd培养基：蛋白胨20g/l，酵母粉10g/l，葡萄糖20g/l；
[0056]
无菌水：过膜水经121℃，20min灭菌；
[0057]
1mol/l山梨醇：每100ml去离子水溶解18.21g山梨醇，121℃灭菌20min，4℃保存备用。
[0058]
本发明所用β-葡萄糖苷酶的酶活检测主要是基于酶解反应释放的配基与葡萄糖，以人工合成底物对硝基苯基-β-d-吡喃葡萄糖苷(pnpg)为底物，其水解产物为对硝基苯(pnp)和葡萄糖，对硝基苯在400nm下有特异的吸光值。
[0059]
具体检测方法如下：取100μl适当稀释的酶液与2.9ml底物溶液(pnpg溶解在磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，终浓度为3mmol/l，ph 5.0)混合，50℃下反应4min，加入1ml 1mol/l na2co3溶液终止反应。以100℃煮沸10min的灭活发酵液上清液作为对照。测定反应液od
400 nm的值，参照标准曲线计算pnp的含量。将反应体系中每分钟产生1μmol对硝基苯(pnp)所需的酶量定义为1个酶活力单位(u)。
[0060]
对硝基苯(pnp)标准曲线如下；配制0.1mg/ml对硝基苯酚母液，分别稀释到浓度为0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.010mg/ml的稀释液，以无菌水为空白，在400nm下测定吸光值。以od值为纵坐标，pnp浓度(mg/ml)为横坐标，做出pnp标准曲线，其线性回归方程y＝40.8x-0.026；r2＝0.9988。
[0061]
其中，酶液和底物溶液混合之前，底物溶液需在50℃水浴中预热2min以上。
[0062]
β-葡萄糖苷酶酶活力计算公式：酶活力s＝x
×v1
×
1000
×
n/139
×
t
×v2
[0063]
式中，x为p-np的量(mg/ml)；v1为反应液体积(ml)；v2为酶液的体积(ml)；n为酶液稀释倍数；t为反应时间(min)。
[0064]
酶活力定义：在50℃条件下将反应体系中每分钟产生1μmol对硝基苯(pnp)所需的酶量定义为1个酶活力单位(u)。
[0065]
实施例1：野生型β-葡萄糖苷酶bglhi重组菌株的构建
[0066]
1.1 合成并扩增野生型β-葡萄糖苷酶基因bglhi
[0067]
根据genbank:kf588650.1获得特异腐质霉(humicola insolens)来源的野生型β-葡萄糖苷酶bglhi基因序列，为了适用于毕赤酵母表达，进行了密码子的优化，优化后的核苷酸序列如seq id no：1所示，委托生物公司合成其序列，并通过pcr进行扩增，引物序列如下：
[0068]
引物p1：f 5
’‑
atgtctttgcctccagacttc-3’；
[0069]
引物p2：r 5
’‑
cgactctttgattagaaaggagtaa-3’；
[0070]
以p1和p2作为上、下游引物，以bglhi的野生型基因为模板进行扩增；
[0071]
其扩增的反应体系为：
[0072]
上游引物p11.5μl下游引物p21.5μldna模板2μlprimestar酶25μlddh2o20μl
[0073]
扩增程序的设置为：预变性：95℃5min；变性：98℃10s；退火：50℃20s；延伸：72℃10s；反应32个循环；延伸：72℃10min。
[0074]
将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，可以看到野生型β-葡萄糖苷酶基因的条带，共1431bp(如图1所示)，再由小量dna回收试剂盒回收pcr产物，得到了野生型β-葡萄糖苷酶基因，即bglhi。
[0075]
1.2 表达载体的线性化
[0076]
提取ppic9k质粒，其提取过程参照试剂盒的操作手册进行。经ecor i和avr ii双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，再由dna凝胶回收试剂盒回收产物，得到了线性化载体序列。
[0077]
1.3 重组菌株的构建
[0078]
将经ecor i和avr ii双酶切的目标片段(bglhi)和载体片段连接形成重组质粒ppic9k-bglhi，将重组质粒转化进大肠杆菌jm109中，经测序验证序列如seq id no：1。
[0079]
实施例2：利用定点突变方法获得β-葡萄糖苷酶突变体
[0080]
2.1基于定点突变技术进行定向突变，构建新型β-葡萄糖苷酶突变体，设计引物如下：
[0081]
引物p3：5
’‑
cagttgttctacaacaagtacggtgattgtatcggtcca g-3’；
[0082]
引物p4：r 5
’‑
ctccaagtttcccaaaaagtcgtcctc-3’；
[0083]
在定点突变pcr反应体系中，以p3和p4作为上下游引物，以重组质粒ppic9k-bglhi为模板，进行定向突变pcr。
[0084]
其扩增的反应体系为：
[0085]
上游引物p31.5μl下游引物p41.5μldna模板2μl
primerstar酶25μlddh2o20μl
[0086]
扩增条件为：预变性：95℃5min；变性：98℃10s；退火：62℃20s；延伸：72℃1min；反应32个循环；延伸：72℃10min。
[0087]
2.2将获得的带有β-葡萄糖苷酶突变体基因的线性质粒自连成环，得到重组质粒ppic9k-bglhim，并化转入大肠杆菌jm109中，将重组质粒ppic9k-bglhi和ppic9k-bglhim转化毕赤酵母中，获得能表达β-葡萄糖苷酶突变体的重组菌株gs115/ppic9k-bglhim。
[0088]
实施例3：β-葡萄糖苷酶突变体的验证
[0089]
3.1 摇瓶验证
[0090]
将实施例2获得的重组菌株参考《毕赤酵母表达手册》，从筛选出高拷贝的重组酵母中划线分离单菌落，并将其与对照菌p.pastoris gs115/ppic9k的单菌落分别接到30ml ypg培养基(含有终浓度为50μg/ml卡那霉素)中，30℃、180r/min培养16-18h；按2％接种量分别将种子液接入50ml bmgy液体培养基中，30℃，180r/min培养至od
600
达到5-6(约16-20h)；收集菌液于灭菌的50ml离心管中，8000r/min，离心5min，倒掉上清，用20ml bmmy培养基重悬菌体进行细胞洗涤，重复洗涤3次，最后用bmmy培养基重悬菌体(菌体终浓度od
600
＝1)；饥饿1h后开始添加诱导剂甲醇，每隔24h加入0.5％甲醇诱导表达，并定时取样分析，即可制备获得β-葡萄糖苷酶酶液。
[0091]
分别测定上述酶液的β-葡萄糖苷酶对葡萄糖耐受能力，将突变体与野生型β-葡萄糖苷酶在不同葡萄糖浓度下的耐受能力比较，得到1株β-葡萄糖苷酶对葡萄糖耐受能力显著强于野生型的菌株。
[0092]
3.2摇瓶复验、纯化及酶活性研究
[0093]
将上述重组菌株其与对照菌p.pastoris gs115/ppic9k的单菌落分别接到30ml ypg培养基(含有终浓度为50μg/ml卡那霉素)中，30℃、180r/min培养16-18h；按2％接种量分别将种子液接入50ml bmgy液体培养基中，30℃，180r/min培养至od
600
达到5-6(约16-20h)；收集菌液于灭菌的50ml离心管中，8000r/min，离心5min，倒掉上清，用20ml bmmy培养基重悬菌体进行细胞洗涤，重复洗涤3次，最后用bmmy培养基重悬菌体(菌体终浓度od
600
＝1)；饥饿1h后开始添加诱导剂甲醇，每隔24h加入0.5％甲醇诱导表达，培养96h。将发酵液置于50ml无菌离心管中，于4℃，12000r/min离心20min，除去菌体；将发酵液上清过0.22μm除菌膜后置于30kd超滤管中进行超滤浓缩，4℃，5000r/min离心60min，大约制取1ml浓缩液。将浓缩后的发酵液转移到透析袋中进行透析，将透析袋放入装有去离子水的烧杯中，在4℃磁力搅拌下透析除去发酵液中的盐离子。将透析好的酶液置于10ml离心管中，8000r/min，4℃离心10min，去除不溶的底部杂质并过0.22μm的水系膜除去不溶杂质；平衡阴离子交换柱(sourses)：20mmol/l的mes缓冲液作为buffer a，用buffer a冲洗柱子，冲洗3-5个柱体积，以平衡阴离子交换柱；上样：将样品全部上样至已平衡好的柱子中，上样流速设为0.5ml/min，用buffer a开始冲洗3-5个柱体积，自上样完成起即开始收集蛋白峰。样品平衡好后，用buffer b进行洗脱，并设置不同的梯度，直到达到100％nacl浓度。洗脱流速设为1ml/min，每出现一个洗脱峰，换一个收集管，收集所有洗脱峰并分别编号。将纯化后的酶液上样进行5％浓缩胶、12％分离胶的聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析，结果如图3所示。图3的泳道4为对照菌株gs115/ppic9k的发酵上清液，对照组基本无蛋白分泌，因为毕赤酵母
gs115经过特异性改造，已经很少或不分泌任何胞外蛋白，泳道2或3为重组菌株gs115/ppic9k-bglhim的纯化后的酶液，可看见明显的蛋白条带，其表观分子量约为60kda。测定纯化后的酶液的β-葡萄糖苷酶酶活力和葡萄糖耐受能力，得到一种β-葡萄糖苷酶突变体t331q，其β-葡萄糖苷酶酶活力可在400mmol/l葡萄糖的激活下最高达到239.0％的相对活力，在葡萄糖浓度为1.5mol/l时，其相对活力仍能达到112.61％(酶活力对比如图2所示)。
[0094]
实施例4：β-葡萄糖苷酶突变体测序
[0095]
将上述重组菌株提取β-葡萄糖苷酶基因序列，并进行测序(金唯智生物科技有限公司)，结果表明，扩增得到了β-葡萄糖苷酶突变体基因核苷酸序列如seq id no：3所示，将该编码基因命名为bglhim。
[0096]
将上述获得的β-葡萄糖苷酶bglhim的氨基酸序列分别与野生型β-葡萄糖苷酶bglhi的氨基酸序列seq id no：1进行对比分析，结果显示：与野生型β-葡萄糖苷酶bglhi相比，β-葡萄糖苷酶bglhim的第331位氨基酸由thr突变为gln(如图4所示)。
[0097]
虽然本发明已经以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和原理的情况下，可以对这些实施例进行各种形式和细节的变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物所限定。
技术特征：1.一种β-葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如seq id no：4所示。2.编码权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。3.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求2所述基因。4.一种重组菌株，其特征在于，包含权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体。5.如权利要求3所述重组载体，其特征在于，所述载体是ppic9k质粒。6.如权利要求4所述重组菌株，其特征在于，所述菌株是毕赤酵母gs115或大肠杆菌jm109。7.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体用于水解糖苷或寡糖化合物非还原性末端的β-d-葡萄糖苷键生成β-d-葡萄糖和相应配基的用途。8.一种制备权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体的方法，包括如下步骤：(1)将核苷酸序列如seq id no：3所示的β-葡萄糖苷酶突变体基因与线性化载体ppic9k经ecor i和avr ii双酶切后连接，得到含有β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组载体；(2)所述重组载体转化入毕赤酵母gs115中，得到含有β-葡萄糖苷酶突变体基因的重组菌株；(3)在适宜条件下培养所述重组菌株，诱导表达，从表达产物中收集并纯化获得β-葡萄糖苷酶突变体。9.一种水解糖苷类化合物的方法，该方法包括使糖苷类化合物与权利要求1所述β-葡萄糖苷酶突变体接触的步骤，在能够通过所述β-葡萄糖苷酶突变体的酶促催化作用水解化合物的β-d-葡萄糖苷键的条件下进行。
技术总结本发明主要利用定点突变技术构建来源于特异腐质霉的β-葡萄糖苷酶的突变体菌株，获得了一种葡萄糖耐受能力提高的β-葡萄糖苷酶突变体T331Q，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。相同条件下，本发明突变体可在400mmol/L葡萄糖的激活下最高达到239.0％的相对活力，在葡萄糖浓度为1.5mol/L时，其相对活力仍能达到112.61％，具有良好的葡萄糖耐受能力。本发明中的突变体在生物燃料、食品保健和生物合成等领域具有较高的应用价值。领域具有较高的应用价值。领域具有较高的应用价值。
技术研发人员：李玉 李庆刚 王茂军 史超硕 刘逸寒 路福平
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2022.04.02
技术公布日：2022/7/5
