1.本发明涉及一种β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体、表达系统、构建方法和应用。
背景技术：2.枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，具备生物安全性好(gras)、分子操作便利、遗传稳定性高、蛋白分泌能力强、培养鲁棒、发酵友好等诸多优点，被工业界广泛采用。1997年b.subtilis的完整基因组公布，随后其转录组、分泌蛋白质组、代谢及遗传调控网络等陆续得以深入研究和公开，在这些基础性研究工作的支撑下，b.subtilis成为优良底盘细胞的基础条件趋向成熟。
3.β-甘露聚糖酶(ec 3.2.1.78)，是能够水解β-1,4甘露糖苷键的内切水解酶，其水解产物为甘露寡糖(mos)，mos具有促进肠道益生菌、抑制病源微生物的繁殖及增强免疫能力等功效，作为功能性食品用于医药领域。中国专利cn112410322a公开了一种地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体，并利用枯草芽孢杆菌实现了其高效分泌表达。
4.目前，基因工程中常利用抗生素作为筛选标记，由于抗生素潜在的危害，限制了枯草芽孢杆菌等工程菌株所表达的外源蛋白或小分子代谢产物在医疗、食品、饲料等工业领域中的应用。食品级表达系统则可避免抗生素残留造成的危害，受到越来越多研究者的青睐。食品级表达系统要求满足2个条件，一是宿主菌来源应为食品安全的微生物，二是不能利用抗生素作为筛选标记。
技术实现要素：5.本发明的目的是提供可实现高酶活性及稳定性的地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体进行枯草芽孢杆菌食品级的表达载体、表达系统、构建方法以及应用并利用该酶制备甘露寡糖。
6.本发明采用如下技术方案：
7.一种β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体，在包含地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体编码基因的枯草芽孢杆菌表达载体上，用枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因(dal基因)替换抗生素抗性基因片段。
8.其中，所述抗生素抗性基因包括卡那霉素抗性基因和博来霉素抗性基因。
9.其中，所述β-甘露聚糖酶突变体为manbl(i91n/l211i)，编码基因的核苷酸序列如中国专利cn112410322a中公开的seq id no.2所示。
10.一种上述β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体的构建方法，其包括如下步骤：
11.(1)包含地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体编码基因的枯草芽孢杆菌表达载体为模板，扩增不包含抗生素抗性基因的片段；
12.(2)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因的片段；
13.(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的片段进行连接。
14.其中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌db104。
15.其中，步骤(3)使用重叠延伸pcr(poe-pcr)进行连接。
16.一种利用上述β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体的表达系统，其为敲除了枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因构建的枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞，所述枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞内包含β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体。
17.一种上述β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达系统的构建方法，其包括如下步骤：
18.(a)构建用于敲除枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因的质粒；
19.(b)使用步骤(a)得到的质粒，利用crispr/cpf1方法，构建枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞；
20.(c)使用β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体转化至步骤(b)构建的枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞。
21.一种上述β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达系统在制备甘露寡糖中的应用。
22.一种上述β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达系统在制备用于医疗、食品或饲料的甘露寡糖中的应用。
23.本发明的有益效果在于：本发明通过表达载体和表达系统的构建，实现了β-甘露聚糖酶突变体的食品级表达。该表达系统制备的β-甘露聚糖酶突变体符合食品级表达的要求，即所使用的宿主枯草芽孢杆菌为食品安全的gras菌种，无抗生素筛选标记，可用于制备医疗、食品、饲料等工业领域使用的甘露寡糖。
附图说明
24.图1为pcrf11质粒酶切结果
25.图1中泳道m为dna marker；泳道1为pcrf11质粒单酶切结果。
26.图2为dal基因上下游同源臂片段扩增结果
27.图2中泳道m为dna marker；泳道1为dal基因上游同源臂片段扩增结果；泳道2为dal基因下游同源臂片段扩增结果。
28.图3为soe-pcr扩增结果
29.图3中泳道m为dna marker；泳道1为soe-pc扩增结果。
30.图4为pcrf11-dal1质粒双酶切结果
31.图4中泳道m为dna marker；泳道1为pcrf11-dal1质粒双酶切结果。
32.图5为食品级表达宿主b.subtilis dbfg-1分子鉴定结果
33.图5中泳道m为dna marker；泳道1-15，17-22：枯草芽孢杆菌食品级表达宿主菌落pcr扩增产物；泳道16：同源臂片段扩增结果；泳道23：db104菌落pcr扩增结果。
34.图6为pwb-manbl(i91n/l211i)载体无抗生素片段扩增结果
35.图6中泳道m为dna marker；泳道1为载体扩增结果。
36.图7为枯草芽孢杆菌dal基因扩增结果
37.图7中泳道m为dna marker；泳道1为dal基因扩增结果。
38.图8为poe-pcr扩增结果
39.图8中泳道m为dna marker；泳道1-3为poe-pcr扩增结果。
40.图9为pwb-manbl(i91n/l211i)载体图谱。
41.图10为食品级β-甘露聚糖酶突变体总酶活力。
42.图11为不同菌株胞外蛋白电泳结果
43.图11中，m：蛋白marker；泳道1：ym102菌株发酵72h；泳道2：b.subtilis db104(pwb980)菌株发酵72h；泳道3：fgym102菌株发酵72h；泳道4：ym102菌株发酵120h；泳道5：b.subtilis db104(pwb980)菌株发酵120h；泳道6：fgym102菌株发酵120h。
44.图12为食品级β-甘露聚糖酶突变体manbl(i91n/l211i)降解魔芋胶
45.图12中，a为不同酶添加量60℃反应30min形成的mos；b为0.5u/ml酶添加量，60℃反应不同时间形成的mos。
具体实施方式
46.以下结合实施例对本发明的技术方案进行详细地阐述。以下实施例仅仅用于说明和解释本发明，而不构成对本发明技术方案的限制。
47.1材料与方法
48.1.1材料及试剂
49.本发明所用质粒、菌株及引物分别见表1、表2和表3。
50.表1本发明所用质粒
[0051][0052]
①
：wu,y.；liu,y.；lv,x.；li,j.；du,g.；liu,l.camers-b:crispr/cpf1 assisted multiple-genes editing and regulation system for bacillus subtilis.biotechnol bioeng 2020,117(6),1817
–
1825。
[0053]
表2本发明所用菌株
[0054]
[0055][0056]
②
：kawamura,f.；doi,r.h.construction of a bacillus subtilis double mutant deficient in extracellular alkaline and neutral proteases.j bacteriol 1984,160(1),442
–
444。
[0057]
表3本发明所用引物
[0058]
[0059][0060]
1.2敲除dal基因质粒的构建
[0061]
使用crispr-dt(http://bioinfolab.miamioh.edu/crispr-dt/)工具设计打靶dal基因的crrna。利用dna退火缓冲液分别溶解互补的两条dna寡核苷酸单链dal-crrna-f和dal-crrna-r，使其摩尔浓度相等。取dal-crrna-f和dal-crrna-r混合均匀，置于pcr仪中，设置反应条件：95℃变性2min，缓慢降温至25℃。使用eco31i酶对pcrf11质粒进行酶切，利用t4连接酶将crrna及pcrf11进行连接，构建pcrf11-dal1质粒。
[0062]
以枯草芽孢杆菌db104基因组为模板，以up-1、dalup-r为引物，扩增dal基因上游同源臂片段；以dn-2、daldn-f为引物，扩增dal基因下游同源臂片段；pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸30s。将dal基因上下游同源臂片段利用soe-pcr进行融合，pcr扩增程序：95℃预变形5min；95℃变形30s；55℃退火30s；72℃延伸1min。将pcrf11-dal1质粒用hind iii及pst i酶切，利用无缝克隆试剂盒对载体片段及融合片段进行无缝连接，构建pcrf11-dal2质粒。
[0063]
1.3枯草芽孢杆菌食品级表达宿主的构建
[0064]
取枯草芽孢杆菌db104感受态细胞与pht-xcr6质粒、pcrf11-dal2质粒混合均匀，37℃，200r/min振荡培养70min。向添加d-丙氨酸、卡那霉素、氯霉素的lb液体培养基加入木糖，使其总浓度为30g/l。将转化体系全部加入上述培养基，37℃，200r/min培养10h。取菌液涂布于添加d-丙氨酸、卡那霉素、氯霉素的lb固体培养基平板上，37℃倒置培养。挑取单菌落，以up-1、daldn-r为引物进行菌液pcr鉴定。pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸5min 30s。将菌落接种到含有0.005％sds的lb培养基中进行质粒丢失，得到敲除了枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因构建的枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞b.subtilis dbfg-1。
[0065]
1.4枯草芽孢杆菌食品级表达载体的构建
[0066]
以质粒pwb-manbl(i91n/l211i)为模板，以dalvec-3、vec-2为引物，扩增质粒pwb-manbl(i91n/l211i)除去抗生素基因的片段vmanbl。pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；49℃退火30s；72℃延伸2min。以枯草芽孢杆菌db104基因组为模板，以dal-1、dal-2为引物，扩增枯草芽孢杆菌dal基因。pcr扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；46℃退
火30s；72℃延伸1min 15s。将vmanbl和dal基因通过poe-pcr进行连接，得到载体pwb-d-manbl(i91n/l211i)。pcr扩增程序：95℃预变性5min；98℃变性10s；50℃退火30s；68℃延伸6min。
[0067]
1.5食品级枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化与鉴定
[0068]
将poe-pcr产物与b.subtilis dbfg-1感受态细胞混匀，于37℃，200r/min条件下培养1.5h，将菌液涂布于培养基中培养16h。挑取阳性重组子进行鉴定。
[0069]
1.6β-甘露聚糖酶酶活力测定
[0070]
按田庚等人热稳定性高β-甘露聚糖酶产生菌的筛选、鉴定及酶学性质研究，食品工业科技，41(19)：127-131中的方法测定β-甘露聚糖酶的酶活力。
[0071]
1.7枯草芽孢杆菌的培养
[0072]
接种不同枯草芽孢杆菌菌株单克隆于lb培养基，37℃180rpm培养12h，转接至发酵培养基(酵母粉20g/l，蛋白胨25g/l，k2hpo
4 3g/l，葡萄糖30g/l)，相同培养条件下继续培养5d。
[0073]
1.8甘露寡糖的制备
[0074]
(1)粗酶液的制备：将b.subtilis fgym102发酵4d的发酵液12,000rpm离心10min，所得上清液即为β-甘露聚糖酶突变体manbl(i91n/l211i)的粗酶液。
[0075]
(2)样品处理：0.5％的魔芋胶(kgm)，加入manbl(i91n/l211i)的粗酶液，使其终浓度为0.5u/ml、1u/ml、5u/ml、50u/ml置于60℃恒温水浴锅中反应30min，煮沸10min以停止反应；0.5％kgm加入0.5u/ml的酶液，置于60℃反应1h、2h、3h、6h、12h，煮沸10min。将0.5％kgm的酶解液12,000rpm离心10min后过0.22μm膜。
[0076]
(3)标准曲线的制备：标准溶液配制：分别准确称取甘露一糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖标准品各100mg，用纯水溶解，转移至10ml容量瓶中，以纯水定容至刻度，摇匀，即得到浓度为10g/l的标准溶液(具体操作步骤同样品)。
[0077]
(4)hplc检测分析：液相仪器：高效液相色谱仪1260；检测器：rid示差检测器；色谱柱：welch xtimate
tm sugar-ca column(7.8*300mm,8μm)；柱温：80℃；流动相：水；流速：0.3ml/min；进样体积：20μl。
[0078]
2实验结果
[0079]
2.1敲除dal基因质粒的构建结果
[0080]
将pcrf11质粒用eco31 i酶进行单酶切，载体片段大小为4400bp，结果如图1所示。酶切片段与dal-crrna-f和dal-crrna-r形成的互补片段进行连接，构建pcrf11-dal1，经测序验证，dal基因的crdna已连接至载体，说明pcrf11-dal1质粒构建正确。
[0081]
扩增的dal基因上游同源臂片段大小为946bp。扩增dal基因下游同源臂片段大小为963bp，结果如图2所示。融合片段大小为1658bp，结果如图3所示。
[0082]
pcrf11-dal1质粒双酶切结果如图4所示，经双酶切后的pcrf11-dal1质粒的大小为4344bp。此后利用无缝克隆试剂盒将载体片段和融合片段进行无缝连接，提取质粒并测序。测序结果表明，pcrf11-dal2质粒构建正确。
[0083]
2.2“无抗无痕”枯草芽孢杆菌食品级表达宿主的验证
[0084]
挑取单克隆进行培养，以单克隆及枯草芽孢杆菌db104菌液为模板，以up-1、daldn-r为引物，敲除dal基因的转化子扩增产物大小为1718bp，未敲除dal基因的扩增产物
大小为2888bp，结果如图5所示，泳道1-15、17-22条带所处的位置的大小与敲除dal基因的转化子扩增产物大小1718bp一致，说明枯草芽孢杆菌db104菌株的dal基因成功敲除，获得了b.subtilis dbfg-1。应用crispr/cpf1技术对宿主基因组dal基因敲除过程中，未引入外源抗生素抗性基因和其它筛选标记基因，是“无抗无痕”编辑，未改变枯草芽孢杆菌生物安全的属性，为进一步应用dal基因互补性构建枯草芽孢杆菌食品级表达系统提供了基础。
[0085]
2.3枯草芽孢杆菌食品级表达载体、表达系统的构建
[0086]
通过poe-pcr方法进行食品级表达载体的构建，载体的线性化通过pcr实现，结果如图6所示，3.5kb的dna条带与预期结果一致，是pwb-manbl(i91n/l211i)载体上除去抗生素基因的片段的大小，标记为vmanbl；扩增的枯草芽孢杆菌dal基因序列大小为1211bp，结果如图7所示。将载体片段vmanbl和枯草芽孢杆菌dal基因通过poe-pcr进行连接，结果如图8所示，poe-pcr产物为dna multimers，条带位于点样孔处。将poe-pcr产物转化至枯草芽孢杆菌宿主b.subtilis dbfg-1，通过dal基因的互补性进行筛选，获得了β-甘露聚糖酶突变体枯草芽孢杆菌表达系统b.subtilis dbfg-1(pwb-d-manbl(i91n/l211i))，该枯草芽孢杆菌表达系统中，(1)宿主为b.subtilis dbfg-1，是敲除了d-丙氨酸消旋酶dal基因的枯草芽孢杆菌，在dal基因敲除过程中未引入抗生素筛选标记基因和其它外源基因，是生物安全的菌株；(2)表达载体为pwb-d-manbl(i91n/l211i)，具备枯草芽孢杆菌复制起点和来源于枯草芽孢杆菌的d-丙氨酸消旋酶基因dal目的基因，地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体基因manbl(i91n/l211i)置于枯草芽孢杆菌p43启动子和sacb信号肽下游，避免了抗生素作为筛选标记，如图9所示。除目的基因外，其余序列均来自枯草芽孢杆菌，具备应用的安全性，属于食品级表达载体。因此，该食品级表达系统b.subtilis dbfg-1(pwb-d-manbl(i91n/l211i))符合食品级表达系统的规定，并将该基因工程菌株命名为b.subtilis fgym102，为实现β-甘露聚糖酶在枯草芽孢杆菌中的食品级表达奠定了基础。
[0087]
2.4β-甘露聚糖酶在食品级枯草芽孢杆菌中的表达
[0088]
β-甘露聚糖酶食品级表达菌b.subtilis fgym102在发酵培养基中进行培养，酶活力随发酵时间变化如图10所示，在发酵4d内，β-甘露聚糖酶的突变体酶活力随发酵时间的增加而逐渐提高，并于发酵4d时酶活力达到最高，β-甘露聚糖酶突变体的总酶活力为17601.3u/ml。比较了三个工程菌株b.subtilis db104(pwb980)、ym102和fgym102胞外蛋白，结果如图11所示，不含外源β-甘露聚糖酶突变体基因的空载菌株b.subtilis db104(pwb980)，在发酵72h(图11泳道2)和120h(图11泳道5)时，均未检测到40kd的目的条带，而含有外源β-甘露聚糖酶基因突变体的菌株ym102和食品级表达系统fgym102，均检测到明显的40kd的目的蛋白，且2个菌株在相同发酵时间，外源蛋白产量无明显差别(图11)。
[0089]
2.5甘露寡糖的制备
[0090]
为了将低值的魔芋胶转换为高附加值的甘露寡糖，应用食品级表达的β-甘露聚糖酶突变体对魔芋胶进行水解，通过hplc分析其水解产物，结果如图12所示。魔芋胶被β-甘露聚糖酶突变体水解后主要产物为甘露六糖和甘露三糖，随着酶添加量的增加(0.5u/ml-50u/ml)，形成的甘露寡糖占总的水解产物比例由80％升为85％(图12a)；随酶添加量的增加，dp6的含量下降而dp3和dp2的含量增加，如酶添加量为0.5u/ml时，dp6和dp3分别占总mos的90.8％和7.6％，而酶添加量为50u/ml时，dp6和dp3分别占总mos的75.1％和15.5％，说明dp6可被进一步分解为小分子的dp3或dp2。
[0091]
进一步研究了酶添加量为0.5u/ml时，魔芋胶随酶解时间延长形成的mos变化。随反应时间延长至1-6h和，魔芋胶降解形成的mos占总水解产物的比例基本保持在86％左右(图12b)，这可能是魔芋胶中甘露聚糖的含量，与添加50u/ml的β-甘露聚糖酶突变体反应30min，形成的mos总量为85％基本一致。另外，水解1h或更长时间，不仅所形成的mos总量变化不明显，且形成的dp6、dp3和dp2等甘露寡糖的比例也无明显变化。因此，为了降低生产成本，在mos制备过程中，可添加0.5u/ml的β-甘露聚糖酶突变体，在60℃反应1h。
技术特征：1.一种β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体，其特征在于，在包含地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体编码基因的枯草芽孢杆菌表达载体上，用枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因替换抗生素抗性基因片段。2.根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体，其特征在于，所述抗生素抗性基因包括卡那霉素抗性基因和博来霉素抗性基因。3.根据权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体，其特征在于，所述β-甘露聚糖酶突变体为manbl(i91n/l211i)。4.一种如权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)包含地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体编码基因的枯草芽孢杆菌表达载体为模板，扩增不包含抗生素抗性基因的片段；(2)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，扩增枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因；(3)将步骤(1)和步骤(2)获得的片段进行连接。5.一种利用权利要求1所述的β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体的表达系统，其特征在于，其为敲除了枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因构建的枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞，所述枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞内包含β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体。6.一种如权利要求5所述的β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达系统的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：(a)构建用于敲除枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因的质粒；(b)使用步骤(a)得到的质粒，利用crispr/cpf1方法，构建枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞；(c)将β-甘露聚糖酶突变体食品级枯草芽孢杆菌表达载体转化至步骤(b)构建的枯草芽孢杆菌食品级表达宿主细胞。7.一种如权利要求5所述的表达系统在制备甘露寡糖中的应用。8.一种如权利要求5所述的表达系统在制备用于医疗、食品或饲料的甘露寡糖中的应用。
技术总结本发明对地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体在枯草芽孢杆菌中进行食品级表达，通过CRISPR/Cpf1基因组编辑技术，敲除了枯草芽孢杆菌d-丙氨酸消旋酶基因dal，构建了枯草芽孢杆菌食品级表达宿主；用dal基因替换枯草芽孢杆菌表达载体上的抗生素抗性基因片段，构建了地衣芽孢杆菌β-甘露聚糖酶突变体的食品级表达载体；将该载体导入食品级表达宿主，实现了β-甘露聚糖酶的食品级表达，酶活力为17601.3U/mL；应用该0.5U/mL食品级β-甘露聚糖酶，在60℃降解0.5％的魔芋胶1h，降解产物中甘露寡糖含量占总水解产物的85％，并且甘露寡糖中主要成分是聚合度为六和三的甘露寡糖DP6和DP3。和DP3。和DP3。
技术研发人员：张春晓 王丽丽 陈赟 刘金龙 梁琪
受保护的技术使用者：河北科技大学
技术研发日：2022.04.22
技术公布日：2022/7/5
