paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用
技术领域
1.本发明属于保健食品技术领域，尤其涉及一种paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用。
背景技术：2.目前，肠-脑轴是将大脑和肠道功能整合的双向信息交流系统，中枢神经系统、肠道神经系统和胃肠道之间的双向相互作用也越来越受到重视。肠道微生物参与肠脑轴的功能反应，在肠道与大脑的信息交流中发挥着非常重要的作用，因此医学科学家们提出了“微生物-肠-脑轴”(the brain-gut-microbiome axis)的概念。肠脑轴功能改变参与多种胃肠道疾病的发生，比如肠易激综合征以及相关的功能性胃肠道疾病；最近的研究也发现，肠脑轴功能紊乱也参与许多脑部疾病的发生，包括自闭症、帕金森、情绪和情感障碍以及慢性疼痛等等。
3.一般来说衰老、更年期、老年痴呆、脑供血不足等都会造成机体特别是脑部的功能衰退，引起学习和记忆力的下降，现代医学认为与脑部海马体的功能下降有关，在医学试验中常常采用东莨菪碱阻断其神经通络，但是现有技术中关于能够拯救东莨菪碱诱导的记忆缺陷的生物活性肽的相关研究尚未见报道。关于通过调节肠道微生物-代谢-神经递质轴的研究未见先关报道。
4.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术中关于能够通过改善色氨酸神经递质通路改善东莨菪碱诱导的记忆缺陷的生物活性肽的相关研究尚未见报道。
5.解决以上问题及缺陷的难度为：老年痴呆症因其记忆力下降的原因较复杂，多数营养补充剂从抗氧化的角度出发进行研究，而未能深入挖掘记忆下降与肠道菌群、代谢及神经递质之间的关系。在研究中，多数植物提取物具有较好的改善记忆效果，然而植物提取物的制备工艺复杂，引入有机试剂，成本较高。
6.解决以上问题及缺陷的意义为：通过从凤尾鱼中靶向分离得到的神经保护肽paycs，其制备工艺绿色简单，通过本发明的实施，能够明确生物活性多肽从调节肠道菌群、肠道代谢及脑神经递质角度实现对记忆损伤的改善作用。
技术实现要素：7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用。
8.本发明是这样实现的，一种paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，所述paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用包括：
9.paycs通过靶向氧化和炎症应激以及调节肠道微生物-代谢物-脑神经递质轴来拯救东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍。
10.所述paycs制备的蛋白酶的酶解工艺条件为：料液比1:3，加酶量1.3％，ph 7.2，反应温度60℃，反应时间50min；碱性蛋白酶酶解工艺条件为：加酶量0.32％，ph 7.3，反应温
度63℃，反应时间77min。
11.进一步，碱性蛋白酶进行二次酶解，待二次酶解反应结束，调节加热器温度，利用hcl调节物料ph至所需，添加糖化酶使多糖降解；
12.灭酶反应结束后，物料进行96℃充分灭酶，关闭加热器和均质泵及阀门，打开冷却水循环泵促进物料的冷却，待温度降为43℃时，关闭所有的泵和阀门，打开出料阀门，用料桶盛放酶解液。
13.进一步，脱色，将酶解液在4100xrpm下离心22min，利用11kda超滤膜对酶解；上清液进行脱色，超滤膜进口压力0.09mpa，出口压力0.07mpa，物料温度26℃，整个过程采用循环冷却水以避免物料温度上升，膜通量的测定采用测定时间内流出透过液体积计算。
14.进一步，膜的清洗，正向清洗：首先用清水将膜系统中残余滤渣排除干净，洗至澄清后加入膜清洗剂循环清洗61min，排除清洗液，再用清水洗至澄清无泡沫，ph值为中性；反向清洗：先用清水将膜系统中残余滤渣清洗后，将超滤膜拆下，将膜与初始反方向放置并安装好，再以正向清洗操作进行清洗；
15.将喷雾干燥机清洗后，打开吹风机和加热器，将干燥机内部水份烘干；打开雾化器和进料泵，再对物料进行喷雾。进口温度为150℃，雾化器为370hz，蠕动泵转速为18rpm。
16.进一步，所述paycs-l和h在ad模型小鼠中表现出不同的记忆缓解作用。
17.进一步，所述paycs对肝脏和血清赤字均有积极作用。
18.进一步，所述paycs-h具有较好的抗氧化和抗炎作用。
19.进一步，所述paycs-l重组健忘症小鼠肠道微生物群的丰度。
20.进一步，所述paycs对健忘症小鼠的脑神经递质和粪便代谢产物具有调节作用。
21.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用中，paycs通过靶向氧化和炎症应激以及调节肠道微生物-代谢物-脑神经递质轴来拯救东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍。
22.从鳀鱼水解物中提取的生物活性肽paycs(pro-ala-tyr-cys-ser)已被证明具有改善记忆的作用。肠道微生物-脑轴在脑功能中起着重要作用，营养补充可影响其功能。在东莨菪碱诱导的ad小鼠模型中，paycs-l(0.2g/kg
·
bw)治疗3周后，在行为测试的训练部分表现出较好的记忆增强作用，而paycs-h(0.4g/kg
·
bw)治疗3周后，在测试部分表现出较好的认知功能改善作用。paycs可显著降低血清mda、ldh水平，显著提高肝脏sod含量。paycs-h能抑制肝脏tnf-α和il-1β的升高，而paycs-l仅能降低肝脏tnf-α的含量。16s rrna分析结果表明，paycs-l改变了拟杆菌/拟杆菌的比例，paycs提高了仙人掌科、普氏草科等植物的相对丰度。值得注意的是，与记忆相关的代谢物(如三七皂苷和胆碱酸)和神经递质(如ach、gaba、glu、hisa和kyn)明显上调。因此，不同剂量的paycs通过不同途径表现出记忆缓解作用。paycs-l部分通过调节肠道微生物-代谢物-脑神经递质轴逆转失忆小鼠的记忆缺陷。paycs-h逆转肝脏和血清的氧化和炎症应激可能是其增强记忆的关键途径，并对肠道微生物群和粪便代谢产物进行重新调节。paycs提高了仙人掌科(cacteroidaceae)、普雷沃氏菌科(prevotellaceae)等植物的相对丰度，改善了脑内色氨酸代谢相关神经递质。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使
用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1是本发明实施例提供的paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠行为学的影响示意图。
25.图1a是本发明实施例提供的跳台试验的测定结果示意图。
26.图1b是本发明实施例提供的游泳速度的测定结果示意图。
27.图1c是本发明实施例提供的游泳距离的测定结果示意图。
28.图1d是本发明实施例提供的目标平台穿越次数的测定结果示意图。
29.图1e是本发明实施例提供的目标象限穿越次数的测定结果示意图。
30.图1f是本发明实施例提供的训练过程中的逃避潜伏期和错误次数的测定结果示意图。
31.图1g是本发明实施例提供的分别进行游动距离、速度和目标象限穿越次数的测定结果示意图。
32.图1h是本发明实施例提供的目标平台穿越次数和逃避潜伏期示意图。
33.图2是本发明实施例提供的paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠肝脏和血清氧化指数的影响示意图。
34.图2a是本发明实施例提供的小鼠肝脏和血清中mda的测定结果示意图。
35.图2b是本发明实施例提供的小鼠肝脏和血清中ldh的测定结果示意图。
36.图2c是本发明实施例提供的小鼠肝脏和血清中sod的测定结果示意图。
37.图2d是本发明实施例提供的小鼠肝脏和血清中gp(x)的测定结果示意图。
38.图3是本发明实施例提供的paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠肝脏和血清炎症指数的影响示意图。
39.图3a是本发明实施例提供的小鼠肝脏和血清中il-1β含量测定结果示意图。
40.图3b是本发明实施例提供的小鼠肝脏和血清tnf-α含量测定结果示意图。
41.图4是本发明实施例提供的paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠肠道微生物区系的影响示意图。
42.图4a是本发明实施例提供的otu水平α多样性的venn图。
43.图4b是本发明实施例提供的chao指数的学生检验示意图。
44.图4c是本发明实施例提供的门水平的群落差异柱形图。
45.图4d是本发明实施例提供的对照与模型的物种水平微生物区系差异分析示意图。
46.图4e是本发明实施例提供的pyacs-l与模型的物种水平微生物区系差异分析示意图。
47.图4f是本发明实施例提供的pycs-h与模型的物种水平微生物区系差异分析示意图。
48.图5是本发明实施例提供的paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠粪便代谢产物的影响示意图。
49.图5a是本发明实施例提供的不同代谢物的venn图。
50.图5b是本发明实施例提供的代谢物聚类分析热图。
51.图5c是本发明实施例提供的对照与模型代谢产物的差异分析示意图。
52.图5d是本发明实施例提供的模型与paycs-l代谢产物的差异分析示意图。
53.图5e是本发明实施例提供的模型与paycs-h代谢产物的差异分析示意图。
54.图6是本发明实施例提供的paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠脑神经递质的影响示意图。
55.图7是本发明实施例提供的实验设计评价paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠学习记忆功能的影响示意图。
56.图8是本发明实施例提供的paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠脑神经递质的影响示意图。
57.图9是本发明实施例提供的家庭层面的社区差异柱状图。
58.图10是本发明实施例提供的肠道微生物群与粪便代谢产物在物种水平上的相关分析示意图。
59.图11是本发明实施例提供的肠道微生物群与脑神经递质在属水平上的相关性分析示意图。
60.图12是本发明实施例提供的粪便代谢物与脑神经递质的相关性分析图。
61.图13是本发明实施例提供的paycs在拯救东莨菪碱诱导的小鼠记忆缺陷中的作用机制原理示意图。
具体实施方式
62.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
63.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，下面结合具体实施例对本发明作详细的描述。paycs是一种来源鱼凤尾鱼酶解产物的多肽类物质，补充paycs能够通过改善血清、肝脏氧化应激和炎症损伤，调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质轴实现改善东莨菪碱诱导的小鼠记忆损伤功效。paycs可以算作一个药物或者补充剂。而补充paycs可以通过这个靶向氧化和炎症应激以及调节肠道微生物-代谢物-脑神经递质轴来拯救东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍。
64.paycs制备的蛋白酶的酶解工艺条件为：料液比1:3，加酶量1.3％，ph 7.2，反应温度60℃，反应时间50min；碱性蛋白酶酶解工艺条件为：加酶量0.32％，ph 7.3，反应温度63℃，反应时间77min。
65.碱性蛋白酶进行二次酶解，待二次酶解反应结束，调节加热器温度，利用hcl调节物料ph至所需，添加糖化酶使多糖降解；
66.灭酶反应结束后，物料进行96℃充分灭酶，关闭加热器和均质泵及阀门，打开冷却水循环泵促进物料的冷却，待温度降为43℃时，关闭所有的泵和阀门，打开出料阀门，用料桶盛放酶解液。
67.脱色，将酶解液在4100xrpm下离心22min，利用11kda超滤膜对酶解；上清液进行脱色，超滤膜进口压力0.09mpa，出口压力0.07mpa，物料温度26℃，整个过程采用循环冷却水以避免物料温度上升，膜通量的测定采用测定时间内流出透过液体积计算。
68.膜的清洗，正向清洗：首先用清水将膜系统中残余滤渣排除干净，洗至澄清后加入膜清洗剂循环清洗61min，排除清洗液，再用清水洗至澄清无泡沫，ph值为中性；反向清洗：先用清水将膜系统中残余滤渣清洗后，将超滤膜拆下，将膜与初始反方向放置并安装好，再以正向清洗操作进行清洗；
69.将喷雾干燥机清洗后，打开吹风机和加热器，将干燥机内部水份烘干；打开雾化器和进料泵，再对物料进行喷雾。进口温度为150℃，雾化器为370hz，蠕动泵转速为18rpm。
70.如图13所示，paycs通过靶向氧化和炎症应激以及调节肠道微生物-代谢物-脑神经递质轴来拯救东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍。
71.从鳀鱼水解物中提取的生物活性肽paycs(pro-ala-tyr-cys-ser)已被证明具有改善记忆的作用。肠道微生物-脑轴在脑功能中起着重要作用，营养补充可影响其功能。在东莨菪碱诱导的ad小鼠模型中，paycs-l(0.2g/kg
·
bw)治疗3周后，在行为测试的训练部分表现出较好的记忆增强作用，而paycs-h(0.4g/kg
·
bw)治疗3周后，在测试部分表现出较好的认知功能改善作用。paycs可显著降低血清mda、ldh水平，显著提高肝脏sod含量。paycs-h能抑制肝脏tnf-α和il-1β的升高，而paycs-l仅能降低肝脏tnf-α的含量。16s rrna分析结果表明，paycs-l改变了拟杆菌/拟杆菌的比例，paycs提高了仙人掌科、普氏草科等植物的相对丰度。值得注意的是，与记忆相关的代谢物(如三七皂苷和胆碱酸)和神经递质(如ach、gaba、glu、hisa和kyn)明显上调。因此，不同剂量的paycs通过不同途径表现出记忆缓解作用。paycs-l部分通过调节肠道微生物-代谢物-脑神经递质轴逆转失忆小鼠的记忆缺陷。paycs-h逆转肝脏和血清的氧化和炎症应激可能是其增强记忆的关键途径，并对肠道微生物群和粪便代谢产物进行重新调节。
72.下面结合附图对本发明作详细的描述。
73.图1是paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠行为学的影响，测定了跳台试验(a)、游泳速度(b)、游泳距离(c)、目标平台穿越次数(d)、目标象限穿越次数(e)和训练过程中的逃避潜伏期和错误次数(f)；测试部分分别测定了游动距离、速度、目标象限穿越次数(g)、目标平台穿越次数和逃避潜伏期(h)；#：与对照组比较，p《0.05；与对照组比较，p《0.01；*：vs模型组，p《0.05；**：与模型组比较，p《0.01。
74.图2是paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠肝脏和血清氧化指数的影响，测定小鼠肝脏和血清中mda(a)、ldh(b)、sod(c)、gp(x)(d)水平；#：与对照组比较，p《0.05；*：与模型组比较，p《0.05。
75.图3是paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠肝脏和血清炎症指数的影响，测定小鼠肝脏和血清中il-1β(a)和tnf-α(b)的含量；#：与对照组比较，p《0.05；*：与模型组比较，p《0.05。
76.图4是paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠肠道微生物区系的影响，给出了otu水平α多样性的venn图(a)、chao指数的学生检验(b)、门水平的群落差异柱形图(c)以及对照与模型(d)、pyacs-l与模型(e)、pycs-h与模型(f)的物种水平微生物区系差异分析；*和**分别代表p《0.05和p《0.01。
77.图5是paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠粪便代谢产物的影响，不同代谢物的venn图(a)、代谢物聚类分析热图(b)、对照与模型(c)、模型与paycs-l(d)和模型与paycs-h(e)、**、***的投影重要度(vip)得分分别为p《0.05、p《0.01和p《0.001。
78.图6是paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠脑神经递质的影响；#：与对照组比较，p《0.05；*：与模型组比较，p《0.05。
79.图7是实验设计评价paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠学习记忆功能的影响。
80.图8是paycs-l和paycs-h对东莨菪碱所致失忆小鼠脑神经递质的影响。
81.图9是家庭层面的社区差异柱状图。
82.图10是肠道微生物群与粪便代谢产物在物种水平上的相关分析；一个控件vs模型；图10(b)是paycs-l vs模型，图10(c)是paycs-h vs模型；*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
83.图11是肠道微生物群与脑神经递质在属水平上的相关性分析；*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
84.图12是粪便代谢物与脑神经递质的相关性分析；一个控件vs模型；图12(b)是paycs-lvs模型，图12(c)是paycs-h vs模型；*、**、***分别代表p《0.05、p《0.01、p《0.001。
85.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，其特征在于，所述paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用包括：paycs靶向氧化和炎症应激以及调节肠道微生物-代谢物-脑神经递质轴；所述paycs制备的蛋白酶的酶解工艺条件为：料液比1:3，加酶量1.3％，ph 7.2，反应温度60℃，反应时间50min；碱性蛋白酶酶解工艺条件为：加酶量0.32％，ph 7.3，反应温度63℃，反应时间77min。2.如权利要求1所述的paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，其特征在于，碱性蛋白酶进行二次酶解，待二次酶解反应结束，调节加热器温度，利用hcl调节物料ph至所需，添加糖化酶使多糖降解；灭酶反应结束后，物料进行96℃充分灭酶，关闭加热器和均质泵及阀门，打开冷却水循环泵促进物料的冷却，待温度降为43℃时，关闭所有的泵和阀门，打开出料阀门，用料桶盛放酶解液。3.如权利要求2所述的paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，其特征在于，脱色，将酶解液在4100xrpm下离心22min，利用11kda超滤膜对酶解；上清液进行脱色，超滤膜进口压力0.09mpa，出口压力0.07mpa，物料温度26℃，整个过程采用循环冷却水以避免物料温度上升，膜通量的测定采用测定时间内流出透过液体积计算。4.如权利要求3所述的paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，其特征在于，膜的清洗，正向清洗：首先用清水将膜系统中残余滤渣排除干净，洗至澄清后加入膜清洗剂循环清洗61min，排除清洗液，再用清水洗至澄清无泡沫，ph值为中性；反向清洗：先用清水将膜系统中残余滤渣清洗后，将超滤膜拆下，将膜与初始反方向放置并安装好，再以正向清洗操作进行清洗；将喷雾干燥机清洗后，打开吹风机和加热器，将干燥机内部水份烘干；打开雾化器和进料泵，再对物料进行喷雾；进口温度为150℃，雾化器为370hz，蠕动泵转速为18rpm。5.如权利要求1所述paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，其特征在于，所述paycs-l和h在ad模型小鼠中表现出不同的记忆缓解作用。6.如权利要求1所述paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，其特征在于，所述paycs对肝脏和血清赤字均有积极作用。7.如权利要求1所述paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，其特征在于，所述paycs-h具有较好的抗氧化和抗炎作用。8.如权利要求1所述paycs在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，其特征在于，所述paycs-l重组健忘症小鼠肠道微生物群的丰度；所述paycs对健忘症小鼠的脑神经递质和粪便代谢产物具有调节作用。
技术总结本发明属于保健食品技术领域，公开了一种PAYCS在调节肠道菌群、代谢物及脑神经递质中的应用，PAYCS通过改善氧化和炎症应激以及调节肠道微生物-代谢物-脑神经递质轴来拯救东莨菪碱诱导的小鼠记忆障碍。PAYCS通过肠道微生物-代谢物及神经递质轴改善记忆的这个通路PAYCS可显著降低血清MDA、LDH水平，显著提高肝脏SOD含量；PAYCS-H能抑制肝脏TNF-α和IL-1β的升高，而PAYCS-L仅能降低肝脏TNF-α的含量；因此PAYCS-L改变了拟杆菌/拟杆菌的比例，PAYCS提高了仙人掌科、普雷沃氏菌科等植物的相对丰度，改善了脑内色氨酸代谢相关神经递质。质。质。
技术研发人员：赵甜甜 张业辉 张友胜 焦文娟 刘伟峰 陈帅
受保护的技术使用者：广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所
技术研发日：2022.02.17
技术公布日：2022/7/5
