1.本发明涉及免疫分析技术领域，尤其涉及一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法。
背景技术：2.血栓四项包括血栓调节蛋白、凝血酶-抗凝血酶复合物、纤溶酶-a2纤溶酶抑制物复合物和组织型纤溶酶原激活物-纤溶酶原激活物抑制剂-1复合物，这4种物质均在凝血、纤溶系统的启动阶段明显升高。其中血栓调节蛋白（thrombomodulin，tm）存在血管内皮细胞表面，是常用的内皮损伤伤指标之一，具有抗凝作用。血栓调节蛋白与凝血酶具有高亲和力并与之1:1结合成凝血酶-血栓调节蛋白复合物，先活化蛋白c，再在蛋白 s 的作用下使 fviiia、fva失活，具有抑制纤维蛋白的形成和血小板的活化作用。血栓在形成过程中往往伴有血管内皮细胞的破坏，这使血栓调节蛋白从内皮细胞表面脱落入血，从而导致血浆中血栓调节蛋白浓度升高，所以血浆中血栓调节蛋白的值可以作为评估血管内皮损伤程度和病情严重性的敏感指标。血浆血栓调节蛋白值越高，说明凝血酶浓度就越高，血栓形成的风险性也会越高。因此,检测血栓调节蛋白值对于血栓性疾病患者的病前诊断、治疗及预后评估至关重要。
3.目前临床上已有的检测血栓调节蛋白的方法主要是ria法、酶联免疫吸附法和化学发光法。ria法和酶联免疫吸附法存在明显的缺陷，其中ria法参考值高，灵敏度低，且有放射性污染；酶联免疫吸附法检测时间长、敏感度低、特异性差、批间差等多个问题，而化学发光免疫分析技术其灵敏度和精确度与传统的ria法和酶联免疫吸附法高出几个数量级。其以灵敏度高、特异性强、试剂稳定、监测范围宽、操作简单等优点被广大研究人员所认可，并证逐渐替代传统的生物检测技术。
4.血栓调节蛋白试剂在储存过程中会受多方面因素的影响，例如经过冻融后，会破坏试剂的性能，使试剂体系不稳定，从而影响测试灵敏度，同时也影响到试剂后续的长期稳定性。考虑我国南北地域跨度之大，在冬季运输过程中，因温度较低、零下温度时间过长等情况，会有存在试剂冻融的现象出现，故对试剂的运输带来较大的考验与难度，也对试剂到达客户端后的稳定性带来干扰。综上所述，提出一种灵敏度高、特异性强、稳定、抗冻融的血栓调节蛋白试剂是目前我们亟需解决的问题。
技术实现要素：5.本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法。
6.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒，包括r1试剂、r2试剂与r3试剂，所述r1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，所述r2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，所述r3试剂包括发光底物。
7.进一步地，在所述试剂盒中，优选所述磁微粒为超顺磁微粒，表面覆盖有羧基官能
团，粒径为1.0-3.0
µ
m。
8.进一步地，在所述试剂盒中，优选所述r1试剂还包括用于保存磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体的第一保存液，所述第一保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-2.0%丙三醇、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%afp134抗冻蛋白、0.05-1.0%黄原胶、0.01-0.05% proclin 300，余量为200-600mm的tris-hcl缓冲液，所述第一保存液的ph为7.2-7.4。
9.进一步地，在所述试剂盒中，优选所述r2试剂还包括用于保存碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体的第二保存液，所述第二保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%afp134抗冻蛋白、0.05-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.01-0.05% proclin 300，余量为30-100mm的hepes缓冲液，所述第二保存液的ph为7.0-7.4。
10.进一步地，在所述试剂盒中，优选所述r3试剂还包括用于保存发光底物的第三保存液，所述第三保存液包括以下质量百分比的组分：0.2-0.8%氯化钠、0.001-0.005% na2so3、0.001-0.085%的0.1-0.5mm没食子酸、0.01-0.05% proclin 300，余量为20-70mm的tris-hcl缓冲液，所述第三保存液的ph为7.8-8.3。
11.一种上述所述的测定血栓调节蛋白含量的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：s1、将经过羧基修饰的微粒溶液在磁场作用下磁分离，去上清，用活化缓冲液清洗，洗涤后的磁微粒用活化缓冲液重悬后加入第一活化剂进行活化，得到活化磁微粒；s2、取活化磁微粒、血栓调节蛋白抗体按比例混匀，得到磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，放至第一保存液中保存，得到r1试剂；s3、取血栓调节蛋白抗体、碱性磷酸酶分别与第二活化剂、第三活化剂进行活化，将活化后的碱性磷酸酶、活化后的血栓调节蛋白抗体按比例混匀，得到碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，放至第二保存液中保存，得到r2试剂；s4、取发光底物，放至第三保存液中，得到r3试剂；s5、将r1试剂、r2试剂、r3试剂组装，得到试剂盒。
12.进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤s1中，所述活化缓冲液为2-(n-吗啡啉)乙磺酸，浓度为10-100mm，ph为5.4-6.2。
13.进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤s1中，所述第一活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，浓度为8
ꢀ‑
12mg/ml，活化时间为40-100min。
14.进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤s2中，所述血栓调节蛋白抗体与所述活化磁微粒的配比为1:（5-20），两者的反应时间为1-5h。
15.进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤s3中，第二活化剂为2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0-20.0mg/ml，活化时间为5-20min；进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选第三活化剂为琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐，浓度为5.0-20.0mg/ml，活化时间为5-20min。
16.进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤s3中，活化后的血栓调节蛋白抗体与活化后的碱性磷酸酶配比为1:（5-20），两者的反应时间为15-48h。
17.进一步地，在所述的试剂盒的制备方法中，优选在步骤s4中，所述发光底物为lumi-phos plus，浓度为0.01-0.3mm。
18.本发明的有益效果：本发明提供的一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法，试剂盒包括r1试剂、r2试剂与r3试剂， r1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体， r2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，r3试剂包括发光底物；本发明为双抗体夹心法，应用磁微粒分离技术与化学发光免疫分析系统相结合定量检测血浆样本中血栓调节蛋白的含量，反应的技术原理为：磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体与碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体同待测样本中的的血栓调节蛋白发生免疫反应，结合形成
ꢀ“
三明治
”ꢀ
结构的复合物；随后在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质磁分离，去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物，底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，发光强度与样本中血栓调节蛋白的浓度成正比，可计算出样本中血栓调节蛋白的含量； 本发明采用磁微粒作为载体，提供了近似于均相的反应体系，选用碱性磷酸酶为标记物，具有反应快速、检测结果准确、使用方法简单、测定灵敏度高、特异性强、试剂稳定性好，尤其是短时间冻融后的稳定性好等优点，在临床检验和用药指导等方面有广阔的应用前景。
附图说明
19.下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：图1是本发明实施例1的试剂盒与参比试剂sysmex的检测结果的线性回归曲线。
具体实施方式
20.为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。
21.一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒，包括r1试剂、r2试剂与r3试剂，r1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，r2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，r3试剂包括发光底物。
22.本发明为双抗体夹心法，应用磁微粒分离技术与化学发光免疫分析系统相结合定量检测血浆样本中血栓调节蛋白的含量，反应的技术原理为：磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体与碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体同待测样本中的的血栓调节蛋白发生免疫反应，结合形成
ꢀ“
三明治
”ꢀ
结构的复合物，随后在外加磁场中直接沉淀，将免疫反应形成的复合物与未结合的其它物质磁分离，去上清后清洗沉淀的复合物，加入酶促化学发光底物，底物在酶作用下被催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，发光强度与样本中血栓调节蛋白的浓度成正比，可计算出样本中血栓调节蛋白的含量；本发明采用磁微粒作为载体，提供了近似于均相的反应体系，选用碱性磷酸酶为标记物，碱性磷酸酶具有反应快速、干扰因素较少、检测结果准确、使用方法简单、检验效率高等优点，r1试剂、r2试剂与r3试剂共同作用使得血栓调节蛋白含量测定反应快速、检测结果准确、使用方法简单、测定灵敏度高、特异性强、试剂稳定性好，尤其是短时间冻融后的稳定性好等优点，在临床检验和用药指导等方面有广阔的应用前景。
23.进一步地，磁微粒为超顺磁微粒，磁微粒可为磁性聚苯乙烯微球，表面覆盖有羧基
官能团，粒径为1.0-3.0
µ
m。超顺磁微粒具有高生物相容性，高饱和磁化强度，与血栓调节蛋白抗体的偶联效果好；羧基官能团提供的酸性环境，ph为5.4-6.2，在该ph条件下磁微粒的活化剂edc（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)的活化效果更好，在过低ph时活化剂edc（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）与羧酸形成的中间体不稳定，容易分解，但ph值过高时，部分不稳定中间物水解可能会释放出edc或者使半稳定的氨基反应活性中间物的产量减少从而造成蛋白质与中间物的取代反应速度下降，使与血栓调节蛋白抗体偶联量下降，故而优选磁微粒表面覆盖有羧基官能团。磁微粒的粒径控制在1.0-3.0
µ
m内能更好的满足r1试剂要求，粒径过小或过大都会不能很好的满足r1试剂要求。
24.进一步地， r1试剂还包括用于保存磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体的第一保存液，第一保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-2.0%丙三醇、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%afp134抗冻蛋白、0.05-1.0%黄原胶、0.01-0.05% proclin 300，余量为200-600mm的tris-hcl缓冲液，第一保存液的ph为7.2-7.4。本发明可以采用的缓冲液的类型不做具体限制，根据本发明的具体实例，采用tris-hcl缓冲液作为缓冲体系，通过采用该缓冲体系能够有效地将该磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体的ph维持在预定的范围内，即7.2-7.4，并且，通过采用该缓冲体系，不会对待检测样品中的血栓调节蛋白含量测定造成不利的影响；本发明添加有丙三醇、黄原胶、聚乙二醇6000、牛血清白蛋白、afp134抗冻蛋白等稳定剂，添加牛血清白蛋白能起到保护蛋白稳定、减少非特异性吸附的作用；添加糖类黄原胶，一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致r1试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面黄原胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇6000、丙三醇等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于包被血栓调节蛋白抗体的磁微粒均匀的悬浮于缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用，其中以丙三醇为例，还可作为防冻剂，有效降低凝固点，从而达到较好的抗冻融效果。添加afp134抗冻蛋白，该蛋白可吸附在水晶表面，改变冰晶的生长特性，从而抑制冰晶的生长，该蛋白在较低浓度便可起到明显的降低冰点和延缓结冰的效果，故可有效达到抗冻融效果，从而达到试剂稳定性高、运输稳定性好的需求；添加有防腐剂proclin 300，达到防腐效果，延长储存周期；本发明还添加有氯化钠等无机盐，无机盐的加入可以用于调节该磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体的渗透压，从而可以提高该磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体在测定抗凝血栓调节蛋白含量时的效率。第一保存液可更好的保存磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，使得r1试剂稳定性更好，尤其是使得短时间冻融后的稳定性更好。
25.进一步地， r2试剂还包括用于保存碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体的第二保存液，第二保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%afp134抗冻蛋白、0.05-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.01-0.05% proclin 300，余量为30-100mm的hepes缓冲液，第二保存液的ph为7.0-7.4。本发明可以采用的缓冲液的类型不做具体限制，根据本发明的具体实例，采用hepes缓冲液作为缓冲体系，通过采用该缓冲体系能够有效地将该碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体的ph维持在预定的范围内，即7.0-7.4，并且，通过采用该缓冲体系，不会对血栓调节蛋白含量测定造成不利的影响；本发明添加有黄原胶、聚乙二醇6000、牛血清白蛋白、afp134
抗冻蛋白等稳定剂，添加牛血清白蛋白能起到保护蛋白稳定、减少非特异性吸附的作用；添加糖类黄原胶，一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致r2试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面黄原胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇6000等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于包被血栓调节蛋白抗体的磁微粒均匀的悬浮于缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用；添加afp134抗冻蛋白，该蛋白可吸附在水晶表面，改变冰晶的生长特性，从而抑制冰晶的生长，该蛋白在较低浓度便可起到明显的降低冰点和延缓结冰的效果，故可有效达到抗冻融效果，从而达到试剂稳定性高、运输稳定性好的需求；添加有防腐剂proclin 300，达到防腐效果，延长储存周期；氯化钠等无机盐的加入可以用于调节该碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体的渗透压，从而可以提高该碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体在测定血栓调节蛋白含量时的效率。第二保存液可更好的保存碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，使得r2试剂稳定性更好，尤其是使得短时间冻融后的稳定性更好。
26.进一步地，发光底物可为鲁米诺发光底物液，例如luminol、isoluminol、itci等，优选发光底物为lumi-phos plus，使用该发光底物显色灵敏度强，更快速发生发光反应，有效提高血栓调节蛋白含量检测效率；发光底物类型不做具体限制，只要能够通过与血栓调节蛋白反应产生可检测的颜色变化即可；r3试剂还包括用于保存发光底物的第三保存液，第三保存液包括以下质量百分比的组分：0.2-0.8%氯化钠、0.001-0.005% na2so3、0.001-0.085%的0.1-0.5mm没食子酸、0.01-0.05% proclin 300，余量为20-70mm的tris-hcl缓冲液，第三保存液的ph为7.8-8.3。本发明可以采用的缓冲液的类型不做具体限制，根据本发明的具体实例，采用tris-hcl缓冲液作为缓冲体系，通过采用该缓冲体系能够有效地将该发光底物的ph维持在预定的范围内，即7.8-8.3，并且，通过采用该缓冲体系，不会对发光底物的显色、血栓调节蛋白含量测定造成不利的影响；氯化钠等无机盐的加入可以用于调节该发光底物溶液的渗透压，从而可以提高该发光底物溶液在测定血栓调节蛋白含量时的效率；添加有na2so3、没食子酸有利于提高r2试剂稳定性，添加有防腐剂proclin 300，可更好的保存发光底物，延长储存周期；第三保存液使得r3试剂稳定性更好，尤其是短时间冻融后的稳定性，具有极好的抗冻融性。
27.一种上述的测定血栓调节蛋白含量的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：s1、将经过羧基修饰的微粒溶液在磁场作用下磁分离，去上清，用活化缓冲液清洗，洗涤后的磁微粒用活化缓冲液重悬后加入第一活化剂进行活化，得到活化磁微粒；s2、取活化磁微粒、血栓调节蛋白抗体按比例混匀，得到磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，放至第一保存液中保存，得到r1试剂；s3、取血栓调节蛋白抗体、碱性磷酸酶分别与第二活化剂、第三活化剂进行活化，将活化后的碱性磷酸酶、活化后的血栓调节蛋白抗体按比例混匀，得到碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，放至第二保存液中保存，得到r2试剂；s4、取发光底物，放至第三保存液中，得到r3试剂；s5、将r1试剂、r2试剂、r3试剂组装，得到试剂盒。
28.进一步地，在步骤s1中，活化缓冲液为2-(n-吗啡啉)乙磺酸，浓度为10-100mm，ph为5.4-6.2。
29.进一步地，在步骤s1中，第一活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，浓度为8
ꢀ‑
12mg/ml，活化时间为40-100min。
30.进一步地，在步骤s2中，血栓调节蛋白抗体与活化磁微粒的配比为1:（5-20），两者的反应时间为1-5h。
31.进一步地，在步骤s3中，第二活化剂为2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0-20.0mg/ml，活化时间为5-20min；进一步地，第三活化剂为琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐，浓度为5.0-20.0mg/ml，活化时间为5-20min。
32.进一步地，在步骤s3中，活化后的血栓调节蛋白抗体与活化后的碱性磷酸酶配比为1:（5-20），两者的反应时间为15-48h。
33.进一步地，在步骤s4中，发光底物浓度为0.01-0.3mm，在该浓度下发光底物可更好的参与显色反应。
34.实施例1一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒，包括r1试剂、r2试剂和r3试剂。
35.r1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体和第一保存液；其中，磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体：血栓调节蛋白抗体与磁微粒质量比为1:20；第一保存液：1.0% nacl、5.0%牛血清白蛋白、2.0%丙三醇、1.0%聚乙二醇6000、1.0% afp134抗冻蛋白、1.0%黄原胶、0.05% proclin300，余量为600mmol/l tris-hcl缓冲液，ph为7.4。
36.r2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体和第二保存液；其中，碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体：碱性磷酸酶与血栓调节蛋白抗体的质量比为1:20；第二保存液： 1.0% nacl、5.0%牛血清白蛋白、2.0%甘露醇、1.0%聚乙二醇6000、1.0%afp134抗冻蛋白、1.0%黄原胶、0.05% proclin300，余量为100mmol/l的hepes缓冲液，ph为7.4。
37.r3试剂包括发光底物和第三保存液；发光底物溶液为0.3mm lumi-phos plus；第三保存液： 0.8% nacl、0.005% na2so3、0.085%的0.5mm没食子酸、0.05% proclin300，余量为70mm tris-hcl缓冲液，ph为8.3。
38.该试剂盒的制备方法包括以下步骤：s1、取1ml 10mg/ml 羧基修饰微粒溶液在磁场作用下磁分离3分钟，去上清，分离的磁微粒用活化缓冲液100mmol/l的2-(n-吗啡啉)乙磺酸（mes），ph6.2缓冲液清洗3次。将洗涤后磁微粒用ph 6.0的活化缓冲液100mmol/l mes充分混匀及加入活化剂12.0mg/ml edc（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），室温混悬反应40分钟，得到活化磁微粒。
39.s2、将2.0mg/ml的血栓调节蛋白抗体按1:20的比例加入到活化后的磁微粒混合液中，轻摇混匀，在4℃混悬条件下反应1小时，使得血栓调节蛋白（血栓调节蛋白）抗体被共价偶联在磁微粒表面，得到磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，将该磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体放至到第一保存液中，第一保存液以600mmol/l tris-hcl缓冲液为缓冲体系，将磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体的浓度稀释至0.1
µ
g/ml，tris-hcl第一保存液中含有1.0% nacl、5.0%牛血清白蛋白、2.0%丙三醇、1.0%聚乙二醇6000、1.0% afp134抗冻蛋白、1.0%黄原胶、0.05% proclin300，ph调整为7.4，得到r1试剂。
40.s3、取1.0mg 的血栓调节蛋白抗体，浓缩至2.0mg/ml，加入浓度为20.0mg/ml的活
化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应5min，使用sephadex g25凝胶柱子除盐，收集活化后的血栓调节蛋白抗体；取1.2mg碱性磷酸酶(alp)，浓缩至2.5mg/ml，加入浓度为20.0mg/ml的活化剂smcc（琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐）溶液，室温反应5min。使用sephadex g25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶；将活化后血栓调节蛋白抗体与活化后的碱性磷酸酶(alp)按1：20比例混合，放置4℃下反应15小时，使用supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的血栓调节蛋白抗体和碱性磷酸酶(alp)，得到碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，放至第二保存液中保存，第二保存液以100mmol/l的hepes缓冲液作为缓冲体系，将碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体稀释至0.3
µ
g/ml，其中第二保存液包括1.0% nacl、5.0%牛血清白蛋白、2.0%甘露醇、1.0%聚乙二醇6000、1.0%afp134抗冻蛋白、1.0%黄原胶、0.05% proclin300，ph调整为7.4，得到r2试剂。
41.s4、取0.3mm 发光底物lumi-phos plus，放至第三保存液中，第三保存液以70mm tris-hcl缓冲液为缓冲体系，第三保存液包括0.8% nacl、0.005% na2so3、0.085%的0.5mm没食子酸、0.05% proclin300，ph 调整为8.3，得到r3试剂。
42.s5、将r1试剂、r2试剂、r3试剂组装，得到试剂盒；含量测定时需搭配清洗液（清洗液：ph为7.4的tris缓冲液，其中加入0.9%氯化钠，1%吐温80,0.02%proclin）使用。
43.实施例2一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒，包括r1试剂、r2试剂和r3试剂。
44.r1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体和第一保存液；其中，磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体：血栓调节蛋白抗体与磁微粒质量比为1:5；第一保存液：0.75% nacl、2.75%牛血清白蛋白、1.05%丙三醇、0.55%聚乙二醇6000、0.52% afp134抗冻蛋白、0.52%黄原胶、0.03% proclin300，余量为400mmol/l tris-hcl缓冲液，ph为7.3。
45.r2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体和第二保存液；其中，碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体：碱性磷酸酶与血栓调节蛋白抗体的质量比为1:8；第二保存液： 0.75% nacl、2.75%牛血清白蛋白、1.05%甘露醇、0.55%聚乙二醇6000、0.52%afp134抗冻蛋白、0.52%黄原胶、0.03% proclin300，余量为65mmol/l的hepes缓冲液，ph为7.2。
46.r3试剂包括发光底物和第三保存液；发光底物溶液为0.155mm lumi-phos plus；第三保存液： 0.5% nacl、0.003% na2so3、0.043%的0.3mm没食子酸、0.03% proclin300，余量为40mm tris-hcl缓冲液，ph为8.05。
47.该试剂盒的制备方法包括以下步骤：s1、取1ml 10mg/ml 羧基修饰微粒溶液在磁场作用下磁分离3分钟，去上清，分离的磁微粒用活化缓冲液10mmol/l的2-(n-吗啡啉)乙磺酸（mes），ph5.4缓冲液清洗3次。将洗涤后磁微粒用ph5.4的活化缓冲液10mmol/l mes充分混匀及加入活化剂8mg/ml edc（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），室温混悬反应100分钟，得到活化磁微粒。
48.s2、将2.0mg/ml的血栓调节蛋白抗体按1:5的比例加入到活化后的磁微粒混合液中，轻摇混匀，在4℃混悬条件下反应5小时，使得血栓调节蛋白（血栓调节蛋白）抗体被共价偶联在磁微粒表面，得到磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，将该磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体放至到第一保存液中，第一保存液以400mmol/l tris-hcl缓冲液为缓冲体系，将磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体的浓度稀释至0.1
µ
g/ml，第一保存液中含有0.75% nacl、2.75%牛血清白蛋白、1.05%丙三醇、0.55%聚乙二醇6000、0.52% afp134抗冻蛋白、0.52%黄
原胶、0.03% proclin300，ph调整为7.3，得到r1试剂。
49.s3、取1.0mg 的血栓调节蛋白抗体，浓缩至2.0mg/ml，加入浓度为12.5mg/ml的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应12.5min，使用sephadex g25凝胶柱子除盐，收集活化后的血栓调节蛋白抗体；取1.2mg碱性磷酸酶(alp)，浓缩至2.5mg/ml，加入浓度为12.5mg/ml的活化剂smcc（琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐）溶液，室温反应7.5min。使用sephadex g25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶；将活化后血栓调节蛋白抗体与活化后的碱性磷酸酶(alp)按1：8比例混合，放置4℃下反应31.5小时，使用supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的血栓调节蛋白抗体和碱性磷酸酶(alp)，得到碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，放至第二保存液中保存，第二保存液以65mmol/l的hepes缓冲液作为缓冲体系，将碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体稀释至0.3
µ
g/ml，其中第二保存液包括0.75% nacl、2.75%牛血清白蛋白、1.05%甘露醇、0.55%聚乙二醇6000、0.52%afp134抗冻蛋白、0.52%黄原胶、0.03% proclin300，ph调整为7.2，得到r2试剂。
50.s4、取0.155mm 发光底物lumi-phos plus，放至第三保存液中，第三保存液以40mm tris-hcl缓冲液为缓冲体系，第三保存液包括0.5% nacl、0.003% na2so3、0.043%的0.3mm没食子酸、0.03% proclin300，ph 调整为8.05，得到r3试剂。
51.s5、将r1试剂、r2试剂、r3试剂组装，得到试剂盒；含量测定时需搭配清洗液（清洗液：ph为7.4的tris缓冲液，其中加入0.9%氯化钠，1%吐温80,0.02%proclin）使用。
52.实施例3一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒，包括r1试剂、r2试剂和r3试剂。
53.r1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体和第一保存液；其中，磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体：血栓调节蛋白抗体与磁微粒质量比为1:8；第一保存液：0.5% nacl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%丙三醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05% afp134抗冻蛋白、0.05%黄原胶、0.05% proclin300，余量为200mmol/l tris-hcl缓冲液，ph为7.2。
54.r2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体和第二保存液；其中，碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体：碱性磷酸酶与血栓调节蛋白抗体的质量比为1:5；第二保存液： 0.5% nacl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%甘露醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05%afp134抗冻蛋白、0.05%黄原胶、0.01% proclin300，余量为30mmol/l的hepes缓冲液，ph为7.0。
55.r3试剂包括发光底物和第三保存液；发光底物溶液为0.01mm lumi-phos plus；第三保存液： 0.2% nacl、0.001% na2so3、0.001%的0.3mm没食子酸、0.01% proclin300，余量为20mm tris-hcl缓冲液，ph为7.8。
56.该试剂盒的制备方法包括以下步骤：s1、取1ml 10mg/ml 羧基修饰微粒溶液在磁场作用下磁分离3分钟，去上清，分离的磁微粒用活化缓冲液55mmol/l的2-(n-吗啡啉)乙磺酸（mes），ph5.8缓冲液清洗3次。将洗涤后磁微粒用ph5.8的活化缓冲液55mmol/l mes充分混匀及加入活化剂10mg/ml edc（1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐），室温混悬反应70分钟，得到活化磁微粒。
57.s2、将2.0mg/ml的血栓调节蛋白抗体按1:8的比例加入到活化后的磁微粒混合液中，轻摇混匀，在4℃混悬条件下反应3小时，使得血栓调节蛋白（血栓调节蛋白）抗体被共价偶联在磁微粒表面，得到磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，将该磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体放至到第一保存液中，第一保存液以200mmol/l tris-hcl缓冲液为缓冲体系，将磁
微粒标记的血栓调节蛋白抗体的浓度稀释至0.1
µ
g/ml，第一保存液中含有0.5% nacl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%丙三醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05% afp134抗冻蛋白、0.05%黄原胶、0.05% proclin300，ph调整为7.2，得到r1试剂。
58.s3、取1.0mg 的血栓调节蛋白抗体，浓缩至2.0mg/ml，加入浓度为5mg/ml的活化剂2-亚氨基硫烷溶液，室温反应20min，使用sephadex g25凝胶柱子除盐，收集活化后的血栓调节蛋白抗体；取1.2mg碱性磷酸酶(alp)，浓缩至2.5mg/ml，加入浓度为5mg/ml的活化剂smcc（琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐）溶液，室温反应20min。使用sephadex g25凝胶柱子除盐，收集活化后的碱性磷酸酶；将活化后血栓调节蛋白抗体与活化后的碱性磷酸酶(alp)按1：5比例混合，放置4℃下反应48小时，使用supperdex200凝胶层析柱分离纯化，除去未连接的血栓调节蛋白抗体和碱性磷酸酶(alp)，得到碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，放至第二保存液中保存，第二保存液以30mmol/l的hepes缓冲液作为缓冲体系，将碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体稀释至0.3
µ
g/ml，第二保存液包括0.5% nacl、0.5%牛血清白蛋白、0.1%甘露醇、0.1%聚乙二醇6000、0.05%afp134抗冻蛋白、0.05%黄原胶、0.01% proclin300，ph调整为7.0，得到r2试剂。
59.s4、取0.01mm 发光底物lumi-phos plus，放至第三保存液中，第三保存液以20mm tris-hcl缓冲液为缓冲体系，第三保存液包括0.2% nacl、0.001% na2so3、0.001%的0.3mm没食子酸、0.01% proclin300，ph 调整为7.8，得到r3试剂。
60.s5、将r1试剂、r2试剂、r3试剂组装，得到试剂盒；含量测定时需搭配清洗液（清洗液：ph为7.4的tris缓冲液，其中加入0.9%氯化钠，1%吐温80,0.02%proclin）使用。
61.对实施例1的试剂盒进行性能评估：1、相关性由于不同免疫分析所选的抗体对和方法学等因素的不同，可能会导致检测时受到病人体内干扰物的干扰程度不同，因此无法直接从检测结果的数值来判断两种试剂盒的检测结果是否准确；因此取实施例1的试剂盒（考核系统）与sysmex公司hiscl 5000血栓调节蛋白分析系统（参比系统）进行测试，对40份样本(20例男性，20例女性，年龄在20-70岁之间)中的血栓调节蛋白进行检测，两者的测试结果应保持一致，即斜率k=1.00
±
0.10，相关系数r≥0.975；测试结果见下表：表1. 参比试剂与本发明实施例1的试剂盒的相关性测试结果
由上表结果可知，对已上市第三方的参比制剂检测结果和实施例1提供的试剂盒的检测结果进行相关性分析，构建回归方程，所得曲线如图1所示，所得方程为y=1.0026x-0.2616，r＝0.999，由此可知，本发明提供的血栓调节蛋白检测试剂盒的检测结果与市售的化学发光试剂盒检测结果相近，检测结果准确可靠。
62.2、准确度将使用校准品定标后的实施例1的试剂盒进行准确度检测，在血栓调节蛋白检测系统上测定校准品（180.4ng/ml），每个标准品测定5次，实测浓度和标示值的相对偏差应在
±
10%范围内，（由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，所用的标准品为第三方购标准品对试剂盒）检测结果见下表：；式中：t-标准品标示值；-平均值；b-相对偏差。
63.表2.实施例1的试剂盒的准确度测试结果序号校准品（ng/ml）1180.22179.43181.34179.4
5178.5平均值（）179.76标示值（t）180.4相对偏差（b）-0.35%由结果表明，本发明的试剂盒检测标准品偏差均小于5％，满足性能要求。
64.3、稳定性将实施例1的试剂盒在未开封状态下置于37℃的加速条件下储存，于第0、8、12、14、16天取样检测；测试结果应符合要求：试剂盒在未开封状态下置于37℃储存可以稳定16天，即相对偏差应在
±
10%范围内；检测结果见下表：表3.本发明实施例1的试剂盒试剂加速稳定性（37℃）测试结果由上表可知，该试剂盒在开瓶状态下置于37℃储存16天内相对偏差在
±
10%范围内，试剂盒的试剂稳定性好。
65.将实施例1的试剂盒在开封状态下置于2-8℃的加速条件下储存，于第0、20、30、35、40天取样检测；测试结果应符合要求：试剂盒在开瓶状态下置于2-8℃储存可以稳定30天，即相对偏差应在
±
10%范围内；检测结果见下表：表4.本发明实施例1的试剂盒的开瓶稳定性测试结果
由上表可知，该试剂盒在开瓶状态下置于2-8℃储存40天内相对偏差在
±
10%范围内，试剂盒的试剂稳定性好。
66.将实施例1的试剂盒在未开瓶状态下置于-20℃的加速条件下储存，于第0、1、2、3、4、5天取样检测；测试结果应符合要求：试剂盒在未开瓶状态下置于-20℃储存可以稳定5天，即相对偏差应在
±
10%范围内；检测结果见下表：表5.本发明实施例1的试剂盒的试剂加速稳定性（-20℃）测试结果由上表结果可知，试剂盒在未开瓶状态下置于-20℃储存可以稳定5天，相对偏差在
±
10%范围内，冻存5天后试剂盒的试剂仍可使用，即试剂盒的抗冻融稳定性好。
67.综上，本发明采用磁微粒作为载体，提供了近似于均相的反应体系，选用碱性磷酸酶为标记物，试剂中加入了丙三醇、多羟基醇、海藻糖、afp134抗冻蛋白等稳定剂，具有反应快速、检测结果准确、使用方法简单、测定灵敏度高、特异性强、试剂稳定性好，尤其是短时间冻融后的稳定性好等优点，在临床检验和用药指导等方面有广阔的应用前景。
68.并且通过上述具体的实施例选择来验证本发明的可行性与合理性，仅为本发明的
部分解释与说明，但并不局限于此。对于本领域的技术人员而言，凡是根据本发明申请的专利范围所进行的变化，修改和替换均应包含在本专利的权利要求范围内，皆属于本发明的保护范畴。
技术特征：1.一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒，其特征在于，包括r1试剂、r2试剂与r3试剂，所述r1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，所述r2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，所述r3试剂包括发光底物。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为超顺磁微粒，表面覆盖有羧基官能团，粒径为1.0-3.0
µ
m。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述r1试剂还包括用于保存磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体的第一保存液，所述第一保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-2.0%丙三醇、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%afp134抗冻蛋白、0.05-1.0%黄原胶、0.01-0.05% proclin 300，余量为200-600mm的tris-hcl缓冲液，所述第一保存液的ph为7.2-7.4。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述r2试剂还包括用于保存碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体的第二保存液，所述第二保存液包括以下质量百分比的组分：0.5-1.0%氯化钠、0.5-5.0%牛血清白蛋白、0.1-1.0%聚乙二醇6000、0.05-1.0%afp134抗冻蛋白、0.05-1.0%黄原胶、0.1-2.0%甘露醇、0.01-0.05% proclin 300，余量为30-100mm的hepes缓冲液，所述第二保存液的ph为7.0-7.4。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述r3试剂还包括用于保存发光底物的第三保存液，所述第三保存液包括以下质量百分比的组分：0.2-0.8%氯化钠、0.001-0.005% na2so3、0.001-0.085%的0.1-0.5mm没食子酸、0.01-0.05% proclin 300，余量为20-70mm的tris-hcl缓冲液，所述第三保存液的ph为7.8-8.3。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发光底物为lumi-phos plus。7.一种权利要求1-6任意一项所述的测定血栓调节蛋白含量的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、将经过羧基修饰的微粒溶液在磁场作用下磁分离，去上清，用活化缓冲液清洗，洗涤后的磁微粒用活化缓冲液重悬后加入第一活化剂进行活化，得到活化磁微粒；s2、取活化磁微粒、血栓调节蛋白抗体按比例混匀，得到磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，放至第一保存液中保存，得到r1试剂；s3、取血栓调节蛋白抗体、碱性磷酸酶分别与第二活化剂、第三活化剂进行活化，将活化后的碱性磷酸酶、活化后的血栓调节蛋白抗体按比例混匀，得到碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，放至第二保存液中保存，得到r2试剂；s4、取发光底物，放至第三保存液中，得到r3试剂；s5、将r1试剂、r2试剂、r3试剂组装，得到试剂盒。8.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤s1中，所述活化缓冲液为2-(n-吗啡啉)乙磺酸，浓度为10-100mm，ph为5.4-6.2。9.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤s1中，所述第一活化剂为1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，浓度为8
ꢀ‑
12mg/ml，活化时间为40-100min。10.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤s2中，所述血栓调节蛋白抗体与所述活化磁微粒的配比为1:（5-20），两者的反应时间为1-5h。11.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤s3中，第二活化剂为
2-亚氨基硫烷溶液，浓度为5.0-20.0mg/ml，活化时间为5-20min；第三活化剂为琥珀酰亚胺 4-(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸盐，浓度为5.0-20.0mg/ml，活化时间为5-20min。12.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤s3中，活化后的血栓调节蛋白抗体与活化后的碱性磷酸酶配比为1:（5-20），两者的反应时间为15-48h。13.根据权利要求7所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，在步骤s4中，所述发光底物浓度为0.01-0.3mm。
技术总结本发明公开了一种测定血栓调节蛋白含量的试剂盒及其制备方法，试剂盒包括R1、R2与R3试剂，R1试剂包括磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体，R2试剂包括碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体，R3试剂包括发光底物；方法包括以下步骤：将羧基修饰的微粒活化得到活化磁微粒；取活化磁微粒、血栓调节蛋白抗体混匀，得到磁微粒标记的血栓调节蛋白抗体；取活化后的血栓调节蛋白抗体、碱性磷酸酶混匀，得到碱性磷酸酶标记的血栓调节蛋白抗体；取发光底物；本发明用磁微粒作为载体，提供了近似于均相的反应体系，选用碱性磷酸酶为标记物，具有反应快速、检测结果准确、使用方法简单、测定灵敏度高、特异性强、试剂稳定性好的优点。试剂稳定性好的优点。试剂稳定性好的优点。
技术研发人员：韩学娉
受保护的技术使用者：深圳市帝迈生物技术有限公司
技术研发日：2022.05.31
技术公布日：2022/7/5
