用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于法医遗传学检测技术领域，涉及一种八色荧光标记复合扩增检测系统，具体为用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒及应用。
背景技术：2.短串联重复序列基因座(short tandem repeat，str)作为继限制性片段长度多态性之后的第二代遗传标记，自二十世纪八九十年代以来，被广泛应用于法医物证学方面相关的研究及鉴定，是目前应用最广泛的遗传标记之一。str标记与其他遗传标记物相比，str基因座片段小、容易扩增，更适用于微量和降解检材，且多个str基因座可以同时进行复合扩增，具有快速、高效、准确、灵敏、信息量大等优点，被广泛应用于法医物证中的个体识别和亲子鉴定。
3.目前法医检测领域中应用于str检测的主流试剂盒大多采用五色或者六色荧光复合扩增技术，扩增片段最大可达600bp，检测的str位点可达到20-30个。此类试剂盒在扩增正常样本时可获得较多的str位点信息，但扩增降解与微量的样本，效果并不理想，整体均衡性呈现前高后低，而且300bp之后的扩增片段有极大的丢峰可能性，难以满足检测的需要。
技术实现要素：4.解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，能够在微量降解dna样本中获得更多的基因座位点信息，本发明提供了用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒及应用。
5.技术方案：用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，所述试剂盒包括扩增16个str基因座和1个性别位点的特异性扩增引物；其中，16个基因座为d7s820、d13s317、csf1po、th01、d2s1338、d16s539、tpox、d5s818、d19s433、d21s11、d8s1179、vwa、dys391、d18s51、d3s1358、fga，性别位点为amel。
6.优选的，所述特异性扩增引物的序列如下：d7s820、seq id no:1～2；d13s317、seq id no:3～4；csf1po、seq id no:5～6；th01、seq id no:7～8；d2s1338、seq id no:9～10；d16s539、seq id no:11～12；tpox、seq id no:13～14；d5s818、seq id no:15～16；amel、seq id no:17～18；d19s433、seq id no:19～20；d21s11、seq id no:21～22；d8s1179、seq id no:23～24；vwa、seq id no:25～26；dys391、seq id no:27～28；d18s51、seq id no:29～30；d3s1358、seq id no:31～32；fga、seq id no:33～34。
7.优选的，所述特异性扩增引物在扩增体系中的终浓度为：d7s820、0.06μm；d13s317、0.15μm；csf1po、0.24μm；th01、0.1μm；d2s1338、0.2μm；d16s539、0.06μm；tpox、0.12μm；d5s818、0.21μm；amel、0.08μm；d19s433、0.18μm；d21s11、0.24μm；d8s1179、0.12μm；vwa、0.24μm；dys391、0.2μm；d18s51、0.2μm；d3s1358、0.2μm；fga、0.24μm。
8.该试剂盒包括的17个基因座对应的引物序列及其浓度具体如表1所示：
9.表1. 17个基因座的引物信息
[0010][0011][0012]
优选的，所述特异性扩增引物分为七组：d7s820、d13s317、csf1po为第一组，th01、d2s1338为第二组，d16s539、tpox、d5s818为第三组，amel、d19s433、d21s11为第四组，d8s1179、vwa为第五组，dys391、d18s51为第六组，d3s1358、fga为第七组；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
[0013]
优选的，所述荧光染料为6-fam、hex、t13、sum、lyn、pur、h13中的任一种，且各组引物采用的荧光染料均不同，内标选用橙色荧光siz。
[0014]
优选的，所述荧光染料为：第一组6-fam、第二组hex、第三组t13、第四组sum、第五组lyn、第六组pur、第七组h13。
[0015]
优选的，所述试剂盒包括反应混合液、等位基因分型标准物allelic ladder、dna
标准品、sdh2o和荧光分子量内标；其中反应混合液的组成为：mgcl
2 7.5mm,tris-hcl 125mm，kcl125mm，dntps 7.5mm，bsa 2g/l，热启动taq酶1u/ul。
[0016]
优选的，所述引物的pcr产物扩增子片段长度均小于220bp。
[0017]
以上任一所述用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲权鉴定或dna家谱构建中的应用。
[0018]
优选的，法医鉴定、亲权鉴定或dna家谱构建中采用的样本不仅包括正常样本，对于陈旧样本、降解样本等dna含量微量的样本也可进行有效的检测。
[0019]
有益效果：(1)本发明所述试剂盒为八色荧光复合扩增试剂盒，可在同等的片段长度范围内容纳更多的基因座位点；(2)本发明所述试剂盒基因座扩增片段均小于220bp，对于降解微量的检材有较好的检测效果；(3)本发明所述试剂盒中引物具有特异性强，灵敏度高，分型结果准确的优点，完全能够满足实际案件检验、dna数据库建设以及亲子鉴定的需要。
附图说明
[0020]
图1为基因座排布示意图；
[0021]
图2为本发明试剂盒降解样本扩增结果图；
[0022]
图3为同类型六色试剂盒降解样本扩增结果图。
具体实施方式
[0023]
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0024]
实施例1
[0025]
用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，所述试剂盒包括扩增16个str基因座和1个性别位点的特异性扩增引物；其中，16个基因座为d7s820、d13s317、csf1po、th01、d2s1338、d16s539、tpox、d5s818、d19s433、d21s11、d8s1179、vwa、dys391、d18s51、d3s1358、fga，性别位点为amel。
[0026]
所述特异性扩增引物的序列如下：d7s820、seq id no:1～2；d13s317、seq id no:3～4；csf1po、seq id no:5～6；th01、seq id no:7～8；d2s1338、seq id no:9～10；d16s539、seq id no:11～12；tpox、seq id no:13～14；d5s818、seq id no:15～16；amel、seq id no:17～18；d19s433、seq id no:19～20；d21s11、seq id no:21～22；d8s1179、seq id no:23～24；vwa、seq id no:25～26；dys391、seq id no:27～28；d18s51、seq id no:29～30；d3s1358、seq id no:31～32；fga、seq id no:33～34。
[0027]
所述特异性扩增引物在扩增体系中的终浓度为：d7s820、0.06μm；d13s317、0.15μm；csf1po、0.24μm；th01、0.1μm；d2s1338、0.2μm；d16s539、0.06μm；tpox、0.12μm；d5s818、0.21μm；amel、0.08μm；d19s433、0.18μm；d21s11、0.24μm；d8s1179、0.12μm；vwa、0.24μm；dys391、0.2μm；d18s51、0.2μm；d3s1358、0.2μm；fga、0.24μm。
[0028]
该试剂盒包括的17个基因座对应的引物序列及其浓度具体如表1所示：
[0029]
表1. 17个基因座的引物信息
[0030][0031][0032]
所述特异性扩增引物分为七组：d7s820、d13s317、csf1po为第一组，th01、d2s1338为第二组，d16s539、tpox、d5s818为第三组，amel、d19s433、d21s11为第四组，d8s1179、vwa为第五组，dys391、d18s51为第六组，d3s1358、fga为第七组；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。
[0033]
所述荧光染料为：第一组6-fam、第二组hex、第三组t13、第四组sum、第五组lyn、第六组pur、第七组h13，内标选用橙色荧光siz。
[0034]
所述试剂盒包括反应混合液、等位基因分型标准物allelic ladder、dna标准品、sdh2o和荧光分子量内标；其中反应混合液的组成为：mgcl
2 7.5mm,tris-hcl 125mm，kcl 125mm，dntps 7.5mm，bsa 2g/l，热启动taq酶1u/ul。
[0035]
所述引物的pcr产物扩增子片段长度均小于220bp。
[0036]
实施例2实际应用中使用本发明试剂盒检测实际样本的流程
[0037]
实施例1所述的用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，在法医鉴定、亲权鉴定或dna家谱构建中的应用步骤如下：收集基因组dna，进行pcr扩增，分析扩增产物。
[0038]
1、收集基因组dna
[0039]
法医鉴定、亲权鉴定或dna家谱构建中采用的样品来源包括利用chelex法、磁珠提取法或有机抽提法提取的人基因组dna；或采用免提取的滤纸、fta卡、棉签、纱布中任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。检材的来源包括人的血液、血痕、精液、唾液、体液、毛发、肌肉或组织器官。
[0040]
2、pcr扩增
[0041]
a、按照表2的组分配制扩增体系。
[0042]
表2.pcr扩增体系
[0043]
组分体积反应混合液10.0μl基因组dna含量为0.05-1ng特异性复合扩增引物5.0μlsdh2o补足至25.0μl
[0044]
b、扩增热循环
[0045]
(l)将pcr扩增管置于热循环仪上；
[0046]
(2)选择表3推荐的程序进行扩增；
[0047]
(3)扩增后的样品应避光保存；
[0048]
表3热循环仪的扩增程序
[0049][0050]
c、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
[0051]
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标agcu marker siz-500组成上样混合物〔(0.5μl agcu marker siz-500(无锡中德美联生物技术有限公司))
×
(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)
×
(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与1μl扩增产物或等位基因分型标准物allelic ladder(无锡中德美联生物技术有限公司)混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快使遗传分析仪进行电泳检测。
[0052]
3、分型分析
[0053]
用片段分析软件分析遗传分析仪检测收集的数据。
[0054]
实施例3本发明试剂盒在降解样本测试中的效果
[0055]
使用本发明试剂盒检测降解检材，其检测流程如下：
[0056]
1、降解检材的基因组dna提取
[0057]
各种检材基因组dna的提取参考《ga/t 383-2014法庭科学dna实验室检验规范》进行，此类样本均由磁珠法提取。
[0058]
2、操作步骤如下：
[0059]
2.1扩增体系为：
[0060][0061][0062]
2.2扩增程序为：
[0063][0064]
2.3、扩增产物在遗传分析仪上荧光检测
[0065]
由去离子甲酰胺与系统中分子量内标agcu marker siz-500组成上样混合物〔(0.5μl agcu marker siz-500(无锡中德美联生物技术有限公司))
×
(进样数)+(12μl去离子甲酰胺)
×
(进样数)〕。将12.5μl上样混合物与本试剂盒中1μl扩增产物混合，避免产生气泡。95℃变性3分钟，冰浴3分钟，并尽快电泳；用遗传分析仪检测分析。
[0066]
2.4、分型分析
[0067]
用片段分析软件分析遗传分析仪检测收集的数据。
[0068]
3、结论
[0069]
使用本发明试剂盒扩增某一降解样本(2016年陈旧血滤纸提取样本)，扩增结果见图2。使用applied biosystems的verifiler
tm plus试剂盒扩增同一样本，扩增结果见图3。两者结果相比较，本发明试剂盒扩增降解样本的结果在均衡性与检出率明显优于同类型的六色试剂盒，可获得更多有效str位点信息。
技术特征：1.用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括扩增16个str基因座和1个性别位点的特异性扩增引物；其中，16个基因座为d7s820、d13s317、csf1po、th01、d2s1338、d16s539、tpox、d5s818、d19s433、d21s11、d8s1179、vwa、dys391、d18s51、d3s1358、fga，性别位点为amel。2.根据权利要求1所述的用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物的序列如下：d7s820、seq id no:1～2；d13s317、seq id no:3～4；csf1po、seq id no:5～6；th01、seq id no:7～8；d2s1338、seq id no:9～10；d16s539、seq id no:11～12；tpox、seq id no:13～14；d5s818、seq id no:15～16；amel、seq id no:17～18；d19s433、seq id no:19～20；d21s11、seq id no:21～22；d8s1179、seq id no:23～24；vwa、seq id no:25～26；dys391、seq id no:27～28；d18s51、seq id no:29～30；d3s1358、seq id no:31～32；fga、seq id no:33～34。3.根据权利要求1所述的用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物在扩增体系中的终浓度为：d7s820、0.06μm；d13s317、0.15μm；csf1po、0.24μm；th01、0.1μm；d2s1338、0.2μm；d16s539、0.06μm；tpox、0.12μm；d5s818、0.21μm；amel、0.08μm；d19s433、0.18μm；d21s11、0.24μm；d8s1179、0.12μm；vwa、0.24μm；dys391、0.2μm；d18s51、0.2μm；d3s1358、0.2μm；fga、0.24μm。4.根据权利要求1所述的用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述特异性扩增引物分为七组：d7s820、d13s317、csf1po为第一组，th01、d2s1338为第二组，d16s539、tpox、d5s818为第三组，amel、d19s433、d21s11为第四组，d8s1179、vwa为第五组，dys391、d18s51为第六组，d3s1358、fga为第七组；每对引物中至少一条采用荧光染料标记其5’端。5.根据权利要求4所述的用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为6-fam、hex、t13、sum、lyn、pur、h13中的任一种，且各组引物采用的荧光染料均不同，内标选用橙色荧光siz。6.根据权利要求5所述的用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为：第一组6-fam、第二组hex、第三组t13、第四组sum、第五组lyn、第六组pur、第七组h13。7.根据权利要求1所述的用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反应混合液、等位基因分型标准物allelic ladder、dna标准品、sdh2o和荧光分子量内标；其中反应混合液的组成为：mgcl
2 7.5mm,tris-hcl 125mm，kcl 125mm，dntps 7.5mm，bsa 2g/l，热启动taq酶1u/ul。8.根据权利要求1所述的用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒，其特征在于，所述引物的pcr产物扩增子片段长度均小于220bp。9.权利要求1-8任一所述用于微量降解dna检测的八色荧光复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲权鉴定或dna家谱构建中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述试剂盒应用的样本包括陈旧样本、降解样本。
技术总结本发明公开了用于微量降解DNA检测的八色荧光复合扩增试剂盒及应用，所述试剂盒包括扩增16个STR基因座和1个性别位点的特异性扩增引物；其中，16个基因座为D7S820、D13S317、CSF1PO、TH01、D2S1338、D16S539、TPOX、D5S818、D19S433、D21S11、D8S1179、vWA、DYS391、D18S51、D3S1358、FGA，性别位点为Amel。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述试剂盒为八色荧光复合扩增试剂盒，可在同等的片段长度范围内容纳更多的基因座位点；(2)本发明所述试剂盒基因座扩增片段均小于220bp，对于降解微量的检材有较好的检测效果；(3)本发明所述试剂盒中引物具有特异性强，灵敏度高，分型结果准确的优点，完全能够满足实际案件检验、DNA数据库建设以及亲子鉴定的需要。DNA数据库建设以及亲子鉴定的需要。DNA数据库建设以及亲子鉴定的需要。
技术研发人员：周如华 王鑫 石云杰 张健 陈维忠 崔扬 史明皓 梅兴林 李娟 邵泽香 郭佳佳 朱晨煦
受保护的技术使用者：无锡中德美联生物技术有限公司
技术研发日：2022.02.17
技术公布日：2022/7/5
