1.本发明属于化学分析技术领域，尤其涉及一种用于观测有机超分子解聚的微流控平台及亲和分析方法。
背景技术：2.微流控芯片可以用于各个分析领域，如生物医学、新药物的合成与筛选、以及食品和商品检验、环境监测、刑事科学、军事科学和航天科学等其他重要应用领域，其中生物分析是热点。目前其应用主要集中在核酸分离和定量、dna测序、基因突变和基因差异表达分析等。另外，蛋白质的筛分在微流控芯片中也已有报道针对病原微生物基因组的特征性片段、染色体dna的序列多态型、基因变异的位点及特征等，设计和选择合适的核酸探针，经pcr扩增后检测，就能获得病原微生物种属、亚型、毒力、抗药、致病、同源性、多态型、变异和表达等信息，为疾病的诊断和治疗提供一个很好的切入点。但是常规使用的微流控芯片的材质多为聚二甲基硅氧烷(pdms)，虽然pdms本身的生物相容性较好，所以能够用来模拟一些生物层面的环境。但是如果在实验当中如果要使用一些弱极性非水溶性的溶剂时，pdms材质的微流控芯片可能就会出现溶胀，进而导致变形。已经有文献指出，pdms材质的微流控芯片对于相容性有三个因素的影响：pdms在溶剂中的溶胀、溶剂与pdms之间的溶质分配以及pdms寡聚物在溶剂中的溶解。而在这三个因素中，pdms的溶胀影响最大。使pdms膨胀最少的溶剂包括水、硝基甲烷、二甲亚砜、乙二醇、全氟三丁胺、全氟十氢化萘、乙腈和碳酸丙烯；使pdms膨胀最多的溶剂是二异丙胺、三乙胺、戊烷和二甲苯等弱极性非水溶性的溶剂。所以，构建一种能够耐受弱极性非水溶性的溶剂的微流控观测平台还是十分有必要的。
3.对于生物趋向性的报道有很多，2015年nature报道了利用单分子荧光相关光谱，发现一些酶在放热型催化过程中，自身扩散系数会逐渐增加，且扩散速率与底物浓度、累积时间都构成线性关系。那么是不是将携带长脂肪烃的卟啉聚集体也能看成酶，而与能够将其解聚的客体结合时看成一种反应。2021年的angew.chem.有报道过，当加入支链较长的配体时，“h”型堆叠的卟啉超分子会逐渐变为“j”型堆叠。但如果将客体体型远远小于卟啉超分子的溶液当中时，是否也会出现“h”型堆叠的卟啉超分子会逐渐变为“j”型堆叠，甚至于是以1:1形成单分子层面的结构呢。目前还尚未有文献报道在微流控平台当中观测有机超分子在客体的作用下，出现的解聚、结合及定向迁移现象。
技术实现要素：4.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于观测有机超分子解聚的微流控平台及亲和分析方法。
5.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于观测有机超分子解聚的微流控平台，包括适用于弱极性非水溶性的微流控芯片装置、光学检测平台和主客体；
6.所述的适用于弱极性非水溶性的微流控芯片装置，包括微流控芯片和芯片外置流动注射泵系统，二者通过peek底座以及聚四氟乙烯微管所连接；所述的微流控芯片设有3个
微通道入口，1个反应室和1个微通道出口；所述的芯片外置流动注射泵系统，包括1个三通道流动注射泵，3个1ml玻璃注射器以及与之连接的聚四氟乙烯微管和peek转接头；
7.所述的光学观测平台，所述的照相机通过外置图像采集卡连接到计算机，将采集的通道荧光图像传输至计算机进行处理，呈现出荧光光强分布；
8.所述的微流控芯片中使用的主客体的溶剂均为有机溶剂。
9.进一步地，微流控芯片的材质为钠钙玻璃，与之相连接的玻璃注射器、聚四氟乙烯微管和peek转接头都能够耐受有机溶剂。
10.进一步地，所述的有机溶剂为弱极性非水溶性溶剂。
11.进一步地，各微通道入口分别经流动注射泵注入主体溶液或客体溶液或溶剂，溶液的入口顺序为溶剂、主体溶液、客体溶液，各溶液在入口合流点汇合，进入反应室，最后从微通道出口流出。
12.进一步地，所述的有机超分子主体为光致化学发光物质。
13.进一步地，所述的光致化学发光物质是携带长脂肪烃侧链的锌卟啉。
14.进一步地，所述的客体为能够解聚有机超分子的含n有机杂环物质。
15.进一步地，所述的客体为吡啶或咪唑。
16.进一步地，所述的主体在溶于弱极性非水溶性溶剂后，会受分子间相互作用力形成π-π堆叠，故而呈现为分散较好的聚集态；所述的客体在加入有机超分子主体溶液后，使得主体的聚集态出现解聚，形成主体-客体配位结构。
17.一种基于上述微流控平台的有机超分子解聚的亲和分析方法，包括以下步骤：
18.步骤1：配制主体溶液、客体溶液以及溶剂，所述的主体溶液和客体溶液均采用溶剂配制；
19.步骤2：先用溶剂充分润洗微流控通道，再将主体溶液、客体溶液和溶剂通入微流控芯片的微通道入口；
20.步骤3：打开发光荧光汞灯光源，激发主体产生光致发光，荧光经过成像物镜传递至外置照相机进行捕捉通道的荧光成像，记录微流控通道的入口合流点以及不同位点处的荧光图像，将记录的图像通过图像采集卡传输到计算机上处理分析。
21.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
22.(1)本发明所搭建的微流控芯片装置能够在弱极性非水溶性有机溶剂环境中进行实验，且稳定性高，不易出现腐蚀现象；
23.(2)本发明采用具有光致发光性质的携带长脂肪烃侧链的锌卟啉作为研究对象，允许其在微流体通道会受诱导其解聚的客体作用时，所出现的浓度分布可被荧光显微直接成像；
24.(3)本发明的微流控光学平台能够观察有机超分子在聚集态时受到诱导其解聚的客体的作用下，出现的解聚、扩散现象，可行性高；
25.(4)本发明所使用的微通道的流体雷诺数足够小，且流动状态为层流，以分子扩散为主，不会出现湍流、对流等流动状态，能够真实的收集到有机超分子受到诱导其解聚的客体作用时，出现的扩散、迁移现象。
interest，感兴趣区域)荧光强度分布数据收集后，在origin软件中进行荧光强度分布处理。
41.本发明中的有机超分子主体为携带长脂肪烃侧链的锌卟啉，自身便具有光致化学发光特性；例如，以四(4-羧基苯基)卟啉(meso-tetra(4-carboxyphenyl)porphine，tcpp)与3,4,5-三(((s)-3,7-二甲基辛基)氧基)苯胺(3,4,5-tris(((s)-3,7-dimethyloctyl)oxy)aniline,toa)作为原材料所合成的zntcpp-toa。
42.本发明中的客体为能够与主体特异性结合的物质；例如，能与zntcpp-toa特异性结合的配体，为含n有机杂环物质，如吡啶(pyridine)、咪唑(imidazole)等。
43.本发明中的主客体溶液的溶剂均为弱极性非水溶性溶剂，如甲基环己烷(mch)、二氯甲烷(dcm)等。
44.本发明中的主体在溶于弱极性非水溶性溶剂后，会受分子间相互作用力形成π-π堆叠，故而呈现为分散较好的聚集态。
45.本发明中的客体在加入有机超分子主体溶液后，会使得主体的聚集态出现解聚，形成主体-客体配位结构。
46.常规的pdms材质的微流控芯片3在不同极性的溶剂中具有一定的溶胀性，对精细的测量与分析会导致较大的误差。所以对于弱极性非水溶性的溶剂，则需要使用其它材质的微流控芯片3，才能够保证在后续的实验中，不会出现因为材质的溶胀而导致的误差。当以tcpp与长脂肪烃胺类结合后，会形成携带长脂肪烃的zntcpp-toa，此时zntcpp-toa溶解于弱极性非水溶性溶剂时，受自身作用会形成π-π堆叠，故而会形成类型于“h”型的堆叠态。如图2所示，当加入有机胺类后，会使本身π-π堆叠的zntcpp-toa因为dsp2杂化的锌与配基n上的孤对电子之间的轴向配位以严格的1:1化学计量比发生，从而导致形成“h”型堆叠态的zntcpp-toa逐渐解聚，生成新的一个五配位络合物，进而在溶液中的状态变为单独不聚集的分子态。另外，因为卟啉本身所具有的的荧光活力，加之其在上述相互作用中的光学稳定性以及解聚前后出现的荧光强度变化，在整个微流控系统中能够敏锐的观察到有机超分子的解聚，从而进行解聚亲和的分析。
47.本发明一种基于上述微流控平台的有机超分子解聚的亲和分析方法，包括以下步骤：
48.步骤1：以tcpp为原材料合成zntcpp-toa。
49.步骤1.1：将50ml圆底烧瓶处于氮气氛围中，然后将紫黑色的tcpp(135mg，1.71
×
10-4
mol)悬浮于15ml氯仿(chcl3)中，一起加入圆底烧瓶中。待到搅拌稳定后，在悬浮液中加入草酰氯(oxalyl chloride，350μl，4.14
×
10-3
mol)，并加入两滴无水n,n-二甲基甲酰胺(dmf)。整个装置在氮气氛围下避光搅拌过夜后，用氮气流吹干溶剂。最后在65℃真空干燥箱中经2h除去挥发物，得到绿色的酰氯化tcpp(tcpp-cl)。
50.步骤1.2：将步骤1.1得到的tcpp-cl溶解在8.5ml chcl3中，加入4ml 3,4,5-三(((s)-3,7-二甲基辛基)氧基)苯胺(toa)(769mg，1.37
×
10-3
mol)和n,n-二异丙基乙胺(700μl，4.02
×
10-3
mol)的chcl3溶液，在氮气保护下避光搅拌48h。之后加入60ml chcl3稀释反应体系，依次用10％柠檬酸水溶液(10ml
×
3次)、1m naoh(10ml
×
2次)和饱和nacl(10ml)萃取有机相；每步的水相都弃去，有机相最后用无水na2so4干燥，并置于4℃冰箱中过夜。抽滤分离去na2so4，所得产物经40℃旋转蒸发后，通过填充硅胶柱纯化，用庚烷/乙酸乙酯(3:1)
作为流动相洗脱，收集第二潴留组分，得到紫色固体(tcpp-toa)。
51.步骤1.3：将步骤1.2所得产物tcpp-toa重新溶解在二氯甲烷(ch2cl2)中，加入过量醋酸锌(zn(oac)2，500mg，2.73
×
10-3
mol)，置于避光氮气中搅拌过夜。混合物同样经抽滤、旋蒸，再流经硅胶柱，用庚烷/氯仿/乙酸乙酯(4:4:1)作为展开剂，得zntcpp-toa。
52.步骤2：将步骤1制得的zntcpp-toa溶于氘氯(cdcl3)中，进行zntcpp-toa的核磁表征。如图3所示，通过分析zntcpp-toa的一维核磁氢谱，能够进而确定zntcpp-toa的氢位置以及合成成功。
53.步骤3：将步骤1制得的zntcpp-toa，与不同浓度的吡啶，溶于甲基环己烷中，进行紫外可见吸收光谱与荧光发射波谱表征。
54.步骤4：将步骤1制得的zntcpp-toa，与不同浓度的吡啶，溶于甲基环己烷中，进行sem形貌表征。
55.步骤5：配制主体溶液、客体溶液；所述主体溶液和客体溶液的溶剂均为甲基环己烷。
56.步骤6：先用甲基环己烷充分润洗微流控通道，再按实验设计将主体溶液、客体溶液和溶剂通入微流控芯片3的微通道入口。
57.步骤7：打开长寿命汞灯光源4，激发受体产生光致发光，荧光经过成像物镜传递至照相机进行捕捉通道的荧光成像，记录微流控通道的入口合流点以及不同位点处的荧光图像，将记录的图像通过图像采集卡传输到计算机5上处理分析。
58.在下述实施例中，采用的光学观测平台包括倒置荧光显微镜2(nikon eclipse ti2-u)、长寿命汞灯光源4。入射光通过绿色荧光激发块(λ
ex
＝538～580nm)、经20x物镜(数值孔径：0.75，plan apoλ∞/0.17，起焦距离：1.0)聚焦于微流控芯片3底部。用尼康ds-qi2照相机捕捉通道的荧光成像，并用nis-elements ar软件的(timelapse)模块实时拍摄。具体参数：曝光间隔30s、周期15min、曝光时长：1s。记录的图像通过图像采集卡传输到计算机5上处理分析，具体分析方法如下：选择感兴趣区域(region of interest，roi)的荧光强度，扣除背景并取平均值；再以通道宽度为函数自变量，用origin 8.0软件做归一化处理。
59.实施例1
60.本实施例提供有机超分子受诱导其解聚的客体作用下的紫外可见吸收光谱表征，具体步骤如下：
61.(1)取1.2mg zntcpp-toa溶于4ml甲基环己烷制成0.1mm zntcpp-toa作为储备液。
62.(2)将所得到的储备液稀释16倍得6
×
10-6
m zntcpp-toa溶液，再逐级稀释成4.8
×
10-6
m、3.6
×
10-6
m、2.4
×
10-6
m、1.2
×
10-6
m、6
×
10-7
m、4.8
×
10-7
m、3.6
×
10-7
m、2.4
×
10-7
m、1.2
×
10-7
m、6
×
10-8
m的zntcpp-toa溶液，溶剂均为mch。之后分别取200μl滴加至96孔板中，进行uv-vis分光光度表征。
63.(3)将所得到的储备液稀释8倍得1.2
×
10-5
m的zntcpp-toa溶液。然后分别配置2m、1m、200mm、100mm、20mm、10mm、2mm、200μm、20μm、2μm吡啶溶液，溶剂均为mch。将所选zntcpp-toa溶液与不同溶液的吡啶溶液1:1进行混合后，就得到6
×
10-6
m zntcpp-toa与1m、500mm、100mm、50mm、10mm、5mm、1mm、100μm、10μm、1μm吡啶的混合溶液。之后分别取200μl滴加至96孔板中，使用酶标仪进行uv-vis分光光度表征。
64.由图4(a)可见，对6
×
10-8
m至4.8
×
10-6
mol浓度的zntcpp-toa溶液随着溶度的增
加，紫外吸收光度值也随之增加，在λ
max
＝391nm处表现为最大值(带)，并且根据图4(a)内插图可知，吸光度值与浓度遵循beer-lambert定律，呈线性关系。因为zntcpp-toa在在弱极性非水溶性溶剂当中所受溶剂中氢键影响较小，使得π-π堆叠所产生的力较为明显，从而整体形态呈现为堆砌的胶束状，也就是“h”型堆叠，当加入较大浓度的吡啶溶液时，如图4(b)所示，因为吡啶上的n与zntppr的zn产生配位，从而使得zntcpp-toa逐渐解离，由“h”型堆叠逐渐解聚为单分子的络合物，此时，整体的紫外吸收光谱呈现出较大的红移
65.实施例2
66.本实施例提供有机超分子受诱导其解聚的客体作用下的荧光发射波谱以及sem表征，具体步骤如下：
67.(1)取2.4mg zntcpp-toa溶于4ml甲基环己烷制成0.2mm zntcpp-toa作为储备液。
68.(2)分别配置2m、1m、200mm、100mm、20mm、10mm、2mm、200μm、20μm、2μm吡啶溶液，溶剂均为mch。将zntcpp-toa溶液与不同溶液的吡啶溶液1:1进行混合后，就得到0.1mm zntcpp-toa与1m、500mm、100mm、50mm、10mm、5mm、1mm、100μm、10μm、1μm吡啶的混合溶液。之后分别取200μl滴加至96孔板中，使用酶标仪进行荧光发射波谱表征。
69.(3)将前两步所制得的溶液进行配置为0.1mm zntcpp-toa溶液作为空白对照组，接着依次制备0.1mm zntcpp-toa+10μm吡啶溶液、0.1mm zntcpp-toa+5mm吡啶溶液、0.1mm zntcpp-toa+1m吡啶溶液，分别取10μl滴加到处理好的硅片上，烘干、喷金后进行sem表征。
70.荧光发射波谱表征时，所使用的的激发光设为λ
ex
＝(λ
ab
)
max
＝391nm，发射范围设为λ
em
＝560～750nm，用酶标仪的“底读”模式进行测试，如图5(a)所示，得到了不同浓度zntcpp-toa的荧光发射波谱，荧光发射有2个极大值，分别在(λ
em
)
max
＝606nm和660nm。图5(a)内插图所示，zntcpp-toa的荧光光强面积积分与浓度能够较好的拟好为等温吸附曲线。如图5(b)所示，当加入不同浓度吡啶的时候，随着吡啶浓度的增加，相较于zntcpp-toa荧光发射波谱，(λ
em
)
max
＝606nm的荧光峰逐渐降低，而(λ
em
)
max
＝660nm的荧光峰也随之升高，和紫外吸收光谱所得到的结论一样，因为当吡啶加入后，吡啶上的n与zntppr的zn产生配位，从而使得zntcpp-toa逐渐解离，从而导致了荧光发射波谱最强峰的偏移。
71.而这一点也能够从sem表征中得到，如图6(a)所示，不加吡啶的zntcpp-toa溶液在烘干后呈现出较大颗粒的聚集态，而且相互围绕在一起。依次比较图6(b)(c)(d)，能够看到随着吡啶浓度的增加，zntcpp-toa所形成的聚集态逐渐解聚，当吡啶达到最大浓度时，zntcpp-toa的聚集态已经完全解聚。
72.实施例3
73.本实施例提供一种观察有机超分子受含n有机杂环物质出现的解聚、结合而发生的化学趋向行为的实验，具体的步骤如下：
74.(1)取1.2mg zntcpp-toa溶于4ml甲基环己烷制成0.1mm zntcpp-toa溶液，同时配置1m的吡啶溶液。
75.(2)使用甲基环己烷充分润洗如图7(a)所示的微流控通道。
76.(3)如图7(b)(c)中的(a)线所示，按微流控通道从左至右的三个入口分别通入如下溶液，该配置记作mch/zntcpp-toa/mch，记录微流控通道的入口合流处及出口处的roi的荧光光强分布数据，作为空白对照。
77.(4)如图7(b)中的(b)线所示，将三条通道分别通入mch/zntppr+吡啶/mch，记录微
流控通道的入口合流处及出口处的roi的荧光光强分布数据，作为有机超分子出现的内聚焦现象。
78.(5)如图7(c)中的(b)线所示，将三条通道分别通入mch/zntppr/吡啶，记录微流控通道的入口合流处及出口处的roi的荧光光强分布数据，作为有机超分子与客体结合出现的定向迁移现象。
79.可以在图7(b)中观察到出口处相较于入口处出现了(b)线相对(a)线的内聚，即zntcpp-toa受到吡啶的影响后，因为解聚而出现的向内聚焦的化学趋向行为。如图7(c)中(b)线相对(a)线所示，出口处相较于入口处，在通入吡啶的侧流打破了zntcpp-toa所呈现的横向正态分布的对称性，这证明了吡啶的加入确实会引起zntcpp-toa的解聚，从而引起定向迁移现象。
80.实施例4
81.本实施例提供一种zntcpp-toa在加入吡啶后，出现的解聚而导致的定向迁移的化学趋向行为的微流控光学分析方式，具体步骤如下：
82.(1)取1.2mg zntcpp-toa溶于4ml甲基环己烷制成0.1mm zntcpp-toa溶液，同时配置1m、500mm、100mm、50mm、10mm、5mm、1mm、100μm、10μm、1μm的吡啶溶液。
83.(2)使用甲基环己烷充分润洗微流控通道。
84.(3)将微通道按三个入口从左至右的配置顺序，分别通入mch/zntcpp-toa/mch，记录微流控通道的出口处的roi的荧光光强分布数据，作为空白对照；
85.(4)将微通道按三个入口从左至右的配置顺序，分别通入mch/zntcpp-toa/吡啶，记录微流控通道的出口处的roi的荧光光强分布数据，将所得所有光强分布数据与空白对照数据组合起来，得到因加入吡啶后，zntcpp-toa所出现的定向迁移，如图8(a)；
86.(5)将加入所有浓度梯度的吡啶后所得到的荧光光强分布数据，进行位移单位强度积分，得到加入吡啶后zntcpp-toa所出现的解聚定向迁移位移数据，如图8(b)所示。
87.从图8(a)中可以看出，随着吡啶浓度的增加，zntcpp-toa所出现的定向迁移距离越来越大，通过进行计算后的图8(b)中可以看出所呈现的曲线与荧光发射波谱所得到的曲线几乎一致，这说明随着吡啶流加入后，zntcpp-toa会因为结合解聚后，逐渐的迁移至吡啶流的区域，这证明吡啶能够有效的解聚zntcpp-toa后，zntcpp-toa能够向吡啶流方向出现定向迁移。
技术特征：1.一种用于观测有机超分子解聚的微流控平台，其特征在于，包括适用于弱极性非水溶性的微流控芯片装置、光学检测平台和主客体；所述的适用于弱极性非水溶性的微流控芯片装置，包括微流控芯片和芯片外置流动注射泵系统，二者通过peek底座以及聚四氟乙烯微管所连接；所述的微流控芯片设有3个微通道入口，1个反应室和1个微通道出口；所述的芯片外置流动注射泵系统，包括1个三通道流动注射泵，3个1ml玻璃注射器以及与之连接的聚四氟乙烯微管和peek转接头；所述的光学观测平台，所述的照相机通过外置图像采集卡连接到计算机，将采集的通道荧光图像传输至计算机进行处理，呈现出荧光光强分布；所述的微流控芯片中使用的主客体的溶剂均为有机溶剂。2.根据权利要求1所述微流控平台，其特征在于，微流控芯片的材质为钠钙玻璃，与之相连接的玻璃注射器、聚四氟乙烯微管和peek转接头都能够耐受有机溶剂。3.根据权利要求1所述微流控平台，其特征在于，所述的有机溶剂为弱极性非水溶性溶剂。4.根据权利要求1所述微流控平台，其特征在于，各微通道入口分别经流动注射泵注入主体溶液或客体溶液或溶剂，溶液的入口顺序为溶剂、主体溶液、客体溶液，各溶液在入口合流点汇合，进入反应室，最后从微通道出口流出。5.根据权利要求1所述微流控平台，其特征在于，所述的有机超分子主体为光致化学发光物质。6.根据权利要求5所述微流控平台，其特征在于，所述的光致化学发光物质是携带长脂肪烃侧链的锌卟啉。7.根据权利要求1所述微流控平台，其特征在于，所述的客体为能够解聚有机超分子的含n有机杂环物质。8.根据权利要求7所述微流控平台，其特征在于，所述的客体为吡啶或咪唑。9.根据权利要求1所述微流控平台，其特征在于，所述的主体在溶于弱极性非水溶性溶剂后，会受分子间相互作用力形成π-π堆叠，故而呈现为分散较好的聚集态；所述的客体在加入有机超分子主体溶液后，使得主体的聚集态出现解聚，形成主体-客体配位结构。10.一种基于权利要求1-9任一项所述微流控平台的有机超分子解聚的亲和分析方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：配制主体溶液、客体溶液以及溶剂，所述的主体溶液和客体溶液均采用溶剂配制；步骤2：先用溶剂充分润洗微流控通道，再将主体溶液、客体溶液和溶剂通入微流控芯片的微通道入口；步骤3：打开发光荧光汞灯光源，激发主体产生光致发光，荧光经过成像物镜传递至外置照相机进行捕捉通道的荧光成像，记录微流控通道的入口合流点以及不同位点处的荧光图像，将记录的图像通过图像采集卡传输到计算机上处理分析。
技术总结本发明公开了一种用于观测有机超分子解聚的微流控平台及亲和分析方法。所述的微流控平台包括光学观测平台和微流控芯片装置，该微流控芯片装置能够在弱极性非水溶性溶剂中对能够光致化学发光的有机超分子进行解聚的观测，利用有机超分子的光致发光特性进行图像采集，观测有机超分子在不同浓度的客体下出现不同程度的解聚情况，呈现出不同强度的荧光特性进行分析，结合数理统计，分析亲和力现象。分析亲和力现象。分析亲和力现象。
技术研发人员：邓盛元 李斌 卓西勇 吴莹
受保护的技术使用者：南京理工大学
技术研发日：2022.02.17
技术公布日：2022/7/5
