脆弱拟杆菌的荚膜多糖a提取物的新应用
技术领域
1.本发明涉及益生菌技术领域，特别涉及一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖a提取物的新应 用。
背景技术：2.孤独症谱系障碍(asd，autism spectrum disorder)，也称自闭症，是一组以社会沟 通互动障碍、兴趣狭隘及局限重复的行为作为主要特征的严重神经发育障碍性疾病。 asd给社会、家庭、个人带来了沉重的负担。asd缺乏治愈手段，主要通过日常训练 和行为干预来改善患者的社会沟通和自理能力。现有的治疗药物，主要是根据患儿的实 际情况，针对某些症状进行改善，如氟哌啶醇和舒必利，能一定程度改善患者的兴奋多 动、刻板重复行为、自言自语等行为。
3.asd病因尚不清楚，被广泛接受的假设理论是多种基因和环境因素的交互作用导致 了发病。
4.脆弱拟杆菌zy-312(保藏编号为cgmcc no.10685)的荚膜多糖a提取物已被证 实对银屑病、过敏性皮炎等显效，然而还未有将脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a提取 物用于防治孤独症谱系障碍的报道。
技术实现要素：5.基于上述技术问题，本发明的主要目的是提供一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖a提取物 的新应用，主要是将脆弱拟杆菌zy-312的荚膜多糖a提取物用于制备预防和/或治疗孤 独症谱系障碍的药物。
6.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
7.脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备预防和/或治疗孤独症谱系障碍的药物中的应 用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为cgmcc no.10685，所述荚膜多糖提取物为荚膜多 糖a的提取物。
8.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的提取物中结合脂质的重量含量＜0.02％。
9.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为40kd-400kd。
10.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为40kd-200kd。
11.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为45kd-135kd。
12.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为50kd-130kd。
13.在其中一些实施例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。
14.在其中一些实施例中，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅 料。
15.在其中一些实施例中，所述辅料包含稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、 色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防 腐剂、局部止痛剂、ph调节剂和等渗或等张调节剂中的一种或者多种。
其保藏编号为cgmcc no.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该 菌株是一株非产肠毒脆弱拟杆菌。
31.本发明中，所述脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物的制备，可以但不限于如下制备步骤： 按菌体重量(m):纯化水体积(v)＝1:(3-10)的比例，往菌体中加入纯化水，调节ph 至2.0-5.0；70℃-110℃提取1.0h-4.0h，冷却，离心，收集上清；unigel 80q离子交换 层析，收集的脆弱拟杆菌荚膜多糖a组分，超滤除盐，冷冻干燥。通过例如如上所述的 酸提
→
离子交换层析工艺路线制备。所含荚膜多糖a，结构明确，分子量集中分布在40 kd-200kd，结合脂质含量小于0.02％(w/w)，蛋白残留小于1％(w/w)。其能改善 asd模型小鼠的绝望、认知能力、刻板的重复行为等症状，在制备改善孤独症谱系症状 (asd)药物组合物中有巨大应用潜力。
32.本发明中，所述荚膜多糖a的分子量分布系数为在1-1.3。
33.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的提取物中结合脂质的重量含量＜0.02％。所 述荚膜多糖a的提取物中的结合脂质的重量含量例如为0、0.005％、0.01％、0.015％、 0.02％。wo2013009945a1认为，脆弱拟杆菌荚膜多糖a提取物上结合有0.1％-2％(w/w) 的结合脂质，结合脂质为荚膜多糖a生物活性所必须，将结合脂质去除后，活性显著降 低。但本发明采用荚膜多糖a上结合脂质含量较低的荚膜多糖a的提取物制备防治孤 独症谱系障碍的药物，取得动物药效更好。
34.本发明中，所述的脆弱拟杆菌荚膜多糖a的重复单元由4个单糖组成，n-乙酰半乳 糖胺、β-d呋喃半乳糖、2-乙酰氨基-4-氨基-2,4,6-三脱氧-ɑ-d-吡喃半乳糖以及4,6-半乳 糖丙酮酸。所述的脆弱拟杆菌荚膜多糖a的还原端单糖为n-乙酰半乳糖胺和4,6-半乳 糖丙酮酸。
35.在其中一个示例中，所述荚膜多糖a的重均分子量为40kd-400kd。所述荚膜多糖 a的重均分子量可以选自，包括但不限于如下重均分子量或者两个重均分子量之间得范 围值：40kd、45kd、50kd、55kd、60kd、70kd、80kd、90kd、100kd、110 kd、120kd、130kd、150kd、180kd、200kd、220kd、240kd、260kd、280kd、 300kd、320kd、340kd、360kd、380kd、400kd。较优地，所述荚膜多糖a的 重均分子量为40kd-200kd。较优地，所述荚膜多糖a的重均分子量为45kd-135kd。 较优地，所述荚膜多糖a的重均分子量为50kd-130kd。进一步地，改善孤独症谱系障 碍模型小鼠认知能力试验表明，分子量为70kd-90kd的荚膜多糖a具有更好的治疗效 果。
36.在其中一个示例中，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅料。
37.可以理解得是，所述辅料例如为稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香 味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、 局部止痛剂、ph调节剂、等渗或等张调节剂等，可以含一种，也可以含两种或者两种 以上。
38.可以理解得是，所述药物可以根据临床需求制备成合适的剂型，例如片剂、颗粒 剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液、管饲制剂等。
39.可以理解得是，所述药物可以根据临床需求通过合适的给药途径进行给药，例如 注射给药、口服给药等。
40.在其中一个示例中，所述药物还包含其他孤独症谱系障碍治疗药物。所述其他孤
独 症谱系障碍治疗药物例如氟西汀、利培酮、阿立哌唑、孕烯醇酮、d-环丝氨酸、美金刚、 氯米帕明、褪黑素、金刚烷胺、哌甲酯、托莫西汀等，可以含一种，也可以是两种或者 两种以上。可以理解的是，其他孤独症谱系障碍治疗药物和所述荚膜多糖提取物可以根 据临床需要、以任意形式组合使用，例如制备成药物组合物，或者二者联合用药。
41.实施例1、不同方法制备脆弱拟杆菌荚膜多糖a
42.本实施例中，以制备方法一和制备方法二，分离纯化bacteroides fragilis zy-312及bacteroides fragilis nctc 9343中的脆弱拟杆菌荚膜多糖a。
43.(1)制备方法一：热酚法(文献公开方法)分离纯化脆弱拟杆菌荚膜多糖a
44.①
称取100g bacteroides fragilis zy-312菌体沉淀，加入37％的苯酚/水(v/v)溶液 750ml，68℃搅拌提取30min，5000g常温离心20min，收集水相。
45.②
加入750ml乙醚，充分震荡萃取，12000g常温离心20min，收集水相。60℃旋蒸 去除全部乙醚，得约200ml提取液。
46.③
全部提取液转入10kd透析袋中，流水透析48h后，冷冻干燥，得4.7g样品。
47.④
取全部样品，溶解在200ml的0.1mol/l的醋酸钠缓冲液中(ph4.5，含有10mm的 氯化钙和10mm的氯化镁)，加入2mg dnase和2mg rnase，37℃下酶解处理2h；重复处 理过夜。1mol/l氢氧化钠调节在ph为7.0
±
0.5。
48.⑤
加入20mg链蛋白酶，37℃处理过夜后，80℃加热5min，冷却至室温。
49.⑥
加入800ml 4℃中预冷的乙醇，4℃下沉淀24h，12000g常温离心20min，收集沉淀。
50.⑦
加入2％(v/v)的乙酸水溶液100ml，100℃下持续搅拌加热1h，冷却，naoh中 和，12000g常温离心20min，弃去沉淀物，10kd透析袋流水透析48h，冻干，得404mg 粗品。
51.⑤
粗品加入10ml 20mmol/l的pbs(ph7.5)缓冲液，溶解，12000g常温离心，去除 不溶物；取2ml，上样至s400凝胶柱中(1.6cm
×
100cm)，以1ml/min的起始缓冲液 (20mmol/l pbs，ph7.5)洗脱，分收集洗脱物，红外光谱鉴定，合并收集脆弱拟杆菌 荚膜多糖a，冻干。
52.(2)制备方法二
53.①
分别称取100g b.fragilis zy-312和b.fragilis nctc9343菌体沉淀，加入纯化水 500ml，搅拌均匀，1mol/l盐酸溶液调节ph至4.5；
54.②
75℃持续搅拌加热1h，冷却至室温，12000g常温离心10min，得上清500ml， 调节ph至中性；
55.③
加入100ml 40mmol/l的tris-hcl(ph8.5)缓冲液，混匀，过0.45μm滤膜；
56.④
以20ml/min流速上样至离子交换层析柱(unigel 80q填料)，氯化钠溶液梯度 洗脱，25个柱体积内，氯化钠溶液盐浓度由0升至0.2mol/l。
57.⑤
收集0.1mol/l-0.15mol/l的氯化钠浓度的氯化钠溶液的洗脱物，为荚膜多糖a。
58.⑥
透析除盐，冷冻干燥。
59.(3)实验结果
60.参见表1，制备方法二制备b.fragilis zy-312荚膜多糖a的得率为文献公布的热酚 法的3倍多，结合脂质含量为0.01％，明显低于制备方法一(热酚法)制备的荚膜多糖 a中的结合脂质含量(0.5％)。b.fragilis zy-312荚膜多糖a表达量约b.fragilis nctc9343 的约5倍。
61.b.fragilis zy-312荚膜多糖a重均分子量约90kd，分布系数在1.1-1.21之间，低于 b.fragilis nctc9343荚膜多糖a分子量(约110kd)。
62.表1、不同方法分离纯化b.fragiliszy-312和nctc9343 b.fragilis中荚膜多糖a对比
[0063][0064]
实施例2、不同分子量的脆弱拟杆菌荚膜多糖a的制备
[0065]
(1)制备方法
[0066]
①
称取100g b.fragilis zy-312，加入纯化水500ml，搅拌均匀，1mol/l盐酸溶液调 节ph至4.5；
[0067]
②
75℃持续搅拌加热1h，冷却至室温，12000g常温离心10min，得上清500ml， 调节ph至中性；
[0068]
③
加入100ml 40mmol/l的tris-hcl(ph8.5)缓冲液，混匀，过0.45μm滤膜；
[0069]
④
以20ml/min流速上样至离子交换层析柱(unigel 80q填料)，氯化钠溶液梯度 洗脱，25个柱体积内，氯化钠溶液盐浓度由0升至0.2mol/l。
[0070]
⑤
分管收集0.1mol/l-0.15mol/l的氯化钠浓度的氯化钠溶液的洗脱物(100ml/管)。
[0071]
⑥
透析除盐，冷冻干燥。
[0072]
(2)实验结果
[0073]
表2、不同分子量的脆弱拟杆菌荚膜多糖a制备结果
[0074][0075]
实施例3、脆弱拟杆菌荚膜多糖a改善asd相关症状的动物药效研究
[0076]
分别取实施例1和实施例2中制备的脆弱拟杆菌荚膜多糖a，以btbr t～(+)tf/j(简 称btbr)小鼠为自闭症的模型动物，考察其改善asd相关症状的效果。对比不同菌株 荚膜多糖a，不同工艺制备的荚膜多糖a，不同分子量的荚膜多糖a的药效。
[0077]
一、三箱社交试验
[0078]
1、动物模型
嗅探时间明显高于其他asd模型小鼠。
[0095]
btbr小鼠(asd模型小鼠)未经药物干预，仅仅给药相同体积的生理盐水时，其 在物体箱体中的停留时间以及嗅探时间，明显低于正常小鼠在箱体中的停留时间及嗅探 时间；btbr小鼠表现出了明显的社交缺陷。
[0096]
相对于模型组，经脆弱拟杆菌荚膜多糖a和利培酮的干预后，均可以较为显著的提 高在物体箱体中的停留时间以及嗅探时间，说明脆弱拟杆菌荚膜多糖a可以改善btbr 小鼠的社交缺陷：
[0097]
(1)给药脆弱拟杆菌荚膜多糖a后均能改善btbr小鼠的社交缺陷。
[0098]
(2)由表4可知，s1给药组的实验小鼠在小鼠箱体中停留的平均时间最长，动物 嗅探平均时间更长，s3给药组次之，s2给药组最短。
[0099]
(3)由表5可知，不同分子量的荚膜多糖a对asd模型小鼠的社交能力产生不同 的影响：重均分子量为78.5kd和81.3kd的荚膜多糖a较46.2kd和135.8kd的样品， 效果更佳。
[0100]
表4、不同制备方法制备的荚膜多糖a对asd模型小鼠的社交能力的影响
[0101][0102]
注：s1为制备方法二制备的b.fragilis zy-312的分子量为87kd的荚膜多糖a；s2 为制备方法一(热酚法)制备的b.fragilis zy-312荚膜多糖a；s3为制备方法二制备的 b.fragilis nctc9343的分子量为110kd的荚膜多糖a。
[0103]
表5、不同分子量荚膜多糖a对asd模型小鼠的社交能力影响实验结果
[0104][0105]
二、旷场试验
[0106]
旷场试验为常用的小鼠行为学试验，可以检测小鼠的自发活动行为、探索行为及焦 虑状态。动物模型、动物分组及给药方法同“一、三箱社交试验”。
[0107]
1、小鼠的自主探索及焦虑状态行为检测
[0108]
采用商品化的旷场试验设备及软件进行小鼠自发活性行为、探索行为及焦虑状态检 测。旷场反应箱高30cm，底边长40cm，宽40cm，内壁涂黑，分成了25个8cm
×
8cm 的区域。实验开始时，将受测小鼠放在盒子中央，摄像机记录20min；软件分析总运动 距离、运动速度、休息时间、沿边运动距离、中央区域停留时间。
[0109]
2、实验结果
[0110]
旷场试验结果见表6和表7，与正常组相比，模型组总运动距离较短，沿边运动距 离较少，自发活动减少，表现焦虑。
[0111]
给药脆弱拟杆菌荚膜多糖a和利培酮后，btbr小鼠沿边运动距离均增加，中央区 域停留时间减少；其表现出更佳的自发活动行为，更低的焦虑状态行为。
[0112]
(1)给药脆弱拟杆菌荚膜多糖a后均能改善btbr小鼠的自主探索行为及焦虑行 为。
[0113]
(2)由表6可以看出，s1给药组的实验小鼠沿边运动距离最长，中央区域停留时 间更少，s3给药组次之，s2给药组的效果最差。
[0114]
(3)由表7可以看出，不同分子量荚膜多糖a对asd模型小鼠的自主探索行为影 响试验表明，重均分子量为78.5kd和81.3kd的荚膜多糖a较46.2kd和135.8kd的 样品，药效更佳。
[0115]
表6、不同制备方法制备的荚膜多糖a对asd模型小鼠的自发活动及焦虑行为影响
[0116][0117]
注：s1为制备方法二制备的b.fragilis zy-312的分子量为87kd的荚膜多糖a；s2 为制备方法一(热酚法)制备的b.fragilis zy-312荚膜多糖a；s3为制备方法二制备的 b.fragilis nctc9343的分子量为110kd的荚膜多糖a。
[0118]
表7、不同分子量荚膜多糖a对asd模型小鼠的自发活动及焦虑行为影响实验结果
[0119]
[0120][0121]
三、埋珠和理毛试验
[0122]
埋珠及理毛试验用以评价动物的重复性行为，正常小鼠的理毛时间及埋珠数量更 少。动物模型、动物分组及给药方法同实施例3。
[0123]
1、小鼠的重复性行为检测
[0124]
埋珠试验：洁净鼠笼(27cm
×
16.5cm
×
12.5cm)中垫上了一层约5cm后的木屑， 将20颗黑色玻璃珠以4
×
5的样式排列在木屑上。放入一只受测小鼠，记录其在30min 内被埋藏的玻璃珠的数量(被埋体积大于50％则定义为埋藏)。
[0125]
理毛试验：受测小鼠放入标准鼠笼中，摄像机记录20min内的行为；分析软件自动 分析后10min内小鼠的理毛时间。
[0126]
2、实验结果
[0127]
(1)与模型组相比，给药脆弱拟杆菌荚膜多糖a后降低了asd模型小鼠的理毛时 间，但埋珠数量没有明显差异。
[0128]
(2)由表8可以看出，s1给药组的实验小鼠理毛时间最少，s3给药组的次之，s2 给药组的理毛时间最长。
[0129]
表8、不同荚膜多糖a对asd模型小鼠的重复性行为影响
[0130][0131]
注：s1为制备方法二制备的b.fragilis zy-312的分子量为87kd的荚膜多糖a；s2 为制备方法一(文献公布的热酚法)制备的b.fragilis zy-312荚膜多糖a；s3为制备方 法二制备的b.fragilis nctc9343的分子量为110kd的荚膜多糖a。
[0132]
表9、不同分子量荚膜多糖a对asd模型小鼠的重复性行为影响
[0133][0134]
由以上实验结果可见，采用本发明提供的脆弱拟杆菌荚膜多糖a治疗可以有效改善 asd模型小鼠的社交能力、焦虑情绪及重复性行为症状。
[0135]
实施例4、荚膜多糖a联合利培酮改善丙戊酸钠诱导大鼠孤独症
[0136]
一、实验方法
[0137]
(1)分组及给药
[0138]
正常健康育龄清洁级sd大鼠雌鼠(200-250g)12只和雄鼠(250-320g)6只，饲 养于正常周期性光照(明暗周期各12h)、恒温恒湿(室温20
±
2℃)。4周后，按照雌雄 2:1的比例于当日22:00合笼，次日早晨6:00检查雌鼠阴栓，查得阴栓为雌鼠妊娠第一 天(e1)，孕鼠依次分笼单独饲养并逐一编号，按编号随机分为3组：空白对照组(记 为c)孕鼠2只；空白给生理盐水组(记为ns)孕鼠2只；预造丙戊酸钠诱导子代孤 独症模型组(记为as)孕鼠8只。
[0139]
孕鼠怀孕12.5天(e12.5)，as组8只孕鼠腹腔注射丙戊酸钠600mg/kg；ns组孕 鼠腹腔注射等体积生理盐水；c组不做任何操作。
[0140]
孕鼠产下仔鼠，待幼鼠断奶后剔除雌鼠。从所有仔鼠出生后第一天(p1)开始记录， 待as组仔鼠生长至22天(p22)，将as组仔鼠随机分为模型组，脆弱拟杆菌zy-312 荚膜多糖a组(psa，0.1mg/kg，实施例1中样品s1)，利培酮组(ris，2.5mg/kg)， psa联用利培酮组(0.1mg/kg，2.5mg/kg，同时给药，无先后顺序要求)。c组、ns组、 模型组每日1次灌胃生理盐水0.5ml，各给药组每日1次灌胃相应剂量药物。连续给药 4周。
[0141]
(2)检测指标及方法
[0142]
①
体重
[0143]
从所有仔鼠出生后第一天(p1)开始记录，于每日上午9:00检查仔鼠体质量发育 情况，并于仔鼠p7、p12、p14、p22、p28、p35、p50称量仔鼠体重并逐一记录。
[0144]
②
刻板行为
[0145]
从所有仔鼠出生后第一天开始记录，于p22、p50，下午14:00进行刻板行为检测。 采用摄像仪器随机对各组仔鼠自主活动进行摄录，时长60分钟。由两位观察者通过观 察仔鼠60分钟的自主活动，对仔鼠的重复刻板行为进行评分，采用costall等的动物刻 板行为等级量表，具体如下：
[0146]
表10、动物刻板行为等级量表
[0147][0148]
③
旷场实验
[0149]
从所有仔鼠出生后第一天开始记录，于p28、p50，上午9:00进行旷场实验检测， 记录仔鼠在旷场中的水平跨格数、垂直站立次数及其总分，时间为3分钟。由两位观察 者同时观察仔鼠活动并记录，其中仔鼠身体水平横穿整格计1次，仔鼠前爪离地垂直站 立计1次。
[0150]
④
机械痛阈值检测
[0151]
从所有仔鼠出生后第一天开始记录，于p22、p29、p36、p43、p50，下午14:00对 仔鼠采用机械触痛发检测仔鼠对机械刺激反应的痛阈值。将待测仔鼠放在用透明亚克力 活动盒罩住的5mm
×
5mm的金属网孔上，仔鼠足底完全暴露在测试架上，待仔鼠稳定 15-30分钟后，依次用标准化的不同刺激强度的von frey纤维丝，按照重量递增的顺序 施加von frey纤毛，以纤毛稍稍弯曲为完全受力的标准。从0.008g开始，以每次持续2 秒、间隔15秒以上的频率垂直刺激仔鼠右侧后肢足底中侧皮肤表面，观察仔鼠的缩足 反应。实验持续5次，每只仔鼠记录至少3次缩足反应，能够引起3/5次抬腿比例的vonfrey纤毛克数则被定义为仔鼠的机械痛缩腿反射阈值(mwt)。
[0152]
⑤
学习记忆检测
[0153]
大鼠morris水迷宫实验
[0154]
从所有仔鼠出生后第一天开始记录，于p50，对各组仔鼠连续8天采用morris水迷 宫实验进行学习记忆功能检测，其阶段主要分为寻找可视平台阶段、定位航行阶段和空 间探索阶段，分别对仔鼠日间的定位航行阶段的逃避潜伏期、靶象限活动时间百分比、 游泳速度、策略分析以及空间探索阶段的靶象限活动时间百分比、穿台次数等指标进行 检测。
[0155]
a)寻找平台训练
[0156]
于仔鼠p50，上午8:00进入寻找可视平台训练阶段。待基本参数调试完毕，在水池 中心位置放置较水面高出10mm的可视平台。实验开始前先将仔鼠放置在可视平台上适 应20-30秒，然后从morris水迷宫的不同象限随机投放3次，如仔鼠在60s内未找到可 视平台，则由实验操作者引导仔鼠游至可视平台上适应15-20s，而后将仔鼠擦干并放回 笼中。
[0157]
b)定位航行
[0158]
于仔鼠p51-p57，上午8:00进入定位航行阶段。将不可视平台放置在第一象限的1/2 弧度，池壁至池中心距离1/2的位置，台面低于水面10mm。分别从四个象限随机放入 仔鼠，每日测验一次，仔鼠在四个象限各放一次，记录仔鼠在60秒内寻找不可视透明 平台的时间，每个象限测试间隔30s。如仔鼠在60s内未找到可视平台，则由实验操作 者引导仔鼠游至可视平台上适应15-20s，记录逃避潜伏期为60s；如仔鼠在60s内找到 不可视平台，则在仔鼠登上不可视平台5s后停止记录，将仔鼠在水池中游泳的时间记 为仔鼠的逃避潜伏期。实验结束后，将仔鼠擦干，并放回笼中。
[0159]
c)空间探索实验
[0160]
于仔鼠p58，将水池中的不可视透明平台撤掉，并将仔鼠从不可视透明平台所在象 限的对侧象限放入水中，记录仔鼠在60s内穿过原不可视透明平台所在位置的次数及仔 鼠停留在此象限的时间。实验结束后，将仔鼠擦干，并放回笼中。
[0161]
⑥
统计学方法：spss 25.0进行统计分析。
[0162]
二、试验结果
[0163]
(1)体重
[0164]
表11、各组大鼠体重(mean
±
sd)
[0165][0166]
表12、各组大鼠体重(mean
±
sd)
[0167][0168]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0169]
与c组相比，ns组体重没有明显差别，说明孕中注射操作对仔鼠没有显著影响。 实验过程中，各组仔鼠体重均呈上升趋势。在p7、p12、p14和p22天，c组、ns组仔 鼠体重始终高于as组；在p28、p35和p50天，模型组体重始终低于c组和ns组， 符合孤独症发育迟缓的现象，造模成功。ris加重了这种发育迟缓的情况；psa能够改 善ris导致的体重增长缓慢，促进仔鼠生长发育。
[0170]
(2)刻板行为
[0171]
表13、各组大鼠p50刻板行为得分(mean
±
sd)
[0172]
组别n刻板行为评分c组100**ns组100**模型组82.88
±
0.65psa91.32
±
0.53*ris91.25
±
0.60*psa+ris80.31
±
0.56*
[0173]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0174]
与c组、ns组相比，模型组刻板行为评分极显著上升。与模型组相比，各给药组 均显著下调大鼠刻板行为评分，psa联用ris组效果优于两者单用组。
[0175]
(3)旷场实验
[0176]
表14、各组大鼠p50旷场实验对比(mean
±
sd)
[0177][0178][0179]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0180]
旷场实验是一个常用的动物行为学实验，可以检测大鼠自发活动行为和探索行为。 其中水平运动指标反应大鼠的运动情况，垂直运动指标反应大鼠的探究行为。与c组、 ns组相比，模型组大鼠垂直站立次数、水平跨格次数和总分均显著下降；ris和psa 均提升了大鼠的垂直站立次数和水平跨格次数及总分。psa联用ris组同样提升了上述 指标，且提升幅度大于任一单用组，与模型组出现显著性差异。这说明psa能够提高 孤独症仔鼠的探究能力、运动功能的协调活动能力以及改善焦虑紧张情绪。psa联用 ris改善孤独症仔鼠症状的效果更佳。
[0181]
(4)机械痛阈值
[0182]
表15、第22天后各组大鼠机械痛阈值(mean
±
sd)
[0183][0184]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0185]
与c组、ns组相比，模型组仔鼠自测量起机械痛阈值即升高，显示出孤独症对疼 痛不敏感的症状。与模型组相比，psa和ris均在第49天(p49)显著下调了仔鼠的机 械痛阈值。psa联用ris组在第29天(p29)就已经显著下调了仔鼠机械痛阈值，且下 调幅度大于两者单用组。这说明psa能够提高孤独症仔鼠的疼痛敏感度，psa联用ris 时，提高效果更佳。
[0186]
(5)水迷宫实验
[0187]
①
逃避潜伏期
[0188]
表16、各组大鼠逃避潜伏期(mean
±
sd)
[0189][0190]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0191]
逃避潜伏期反应大鼠的空间学习记忆能力。随着时间延长，各组仔鼠逃避潜伏期均 缩短。c组、ns组仔鼠day3即达到最短逃避潜伏期。与c组、ns组相比，模型组仔 鼠逃避潜伏期始终较长，至day7时，仍与c组、ns组存在差距。与模型组相比，psa、 ris组仔鼠逃避潜伏期较短，day7时与c组、ns组差距较小。psa联用ris组仔鼠逃 避潜伏期较单用组更短，在day6时，与c组、ns组已无差距。这说明psa能够增强 孤独症仔鼠的空间学习能力，psa联用ris的增强效果更佳。
[0192]
②
游泳速度
[0193]
表17、各组大鼠游泳速度(mean
±
sd)
[0194][0195]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0196]
游泳速度反应大鼠的运动能力。与c组、ns组相比，模型组仔鼠游泳速度有所降 低。与模型组相比，psa、ris组仔鼠游泳速度上升。psa联用ris组仔鼠游泳速度也 有所上升，且上升幅度大于两者单用组。这说明psa能够增强孤独症仔鼠的运动能力， 且psa联用ris组效果更佳。
[0197]
③
靶象限活动时间百分比
[0198]
表18、定位航行阶段各组大鼠靶象限活动时间百分比(mean
±
sd)
[0199][0200]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0201]
表19、空间探索阶段各组大鼠靶象限活动时间百分比(mean
±
sd)
[0202]
组别n靶象限活动时间百分比(％)c组1038.71*ns组1038.49*模型组825.96psa932.65ris930.16psa+ris839.53*
[0203]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0204]
靶象限活动时间反应了大鼠的空间记忆能力。
[0205]
在定位航行阶段，随着时间延长，各组仔鼠靶象限活动时间百分比均上升。与c组、 ns组相比，模型组仔鼠靶象限活动时间百分比始终较低，至day7时，仍与c组、ns 组存在差距。与模型组相比，psa、ris组仔鼠靶象限活动时间百分比较高，day7时与 c组、ns组差距较小。psa联用ris组仔鼠靶象限活动时间百分比较单用组更高，在 day7时，与c组、ns组差距极小。
[0206]
在空间探索阶段，与c组、ns组相比，模型组仔鼠靶象限活动时间百分比显著降 低。与模型组相比，psa、ris组仔鼠靶象限活动时间百分比上升。psa联用ris组仔 鼠靶象限活动时间百分比也有所上升，且上升幅度大于两者单用组。
[0207]
上述结果说明psa能够增强孤独症仔鼠的空间记忆能力，且psa联用ris组效果
[0208]
④
穿台次数
[0209]
表20、空间探索阶段穿台次数(mean
±
sd)
[0210]
组别n穿台次数c组105.67
±
1.73*ns组105.63
±
2.55*模型组83.60
±
2.27psa94.50
±
2.79ris94.91
±
1.34psa+ris85.78
±
3.02*
[0211]
注：与模型组比较，*表示差异显著p《0.05；**表示差异极显著p《0.01。
[0212]
穿台次数反应了大鼠的空间学习记忆能力。与c组、ns组相比，模型组穿台次数 显著下降。与模型组相比，psa、ris组仔鼠穿台次数上升。psa联用ris组仔鼠穿台 次数也有所上升，且上升幅度大于两者单用组。
[0213]
上述结果说明psa能够增强孤独症仔鼠的空间学习记忆能力，且psa联用ris组 效果更佳。
[0214]
综上所述，脆弱拟杆菌zy-312荚膜多糖a联用ris能够有效治疗丙戊酸钠诱导的 大鼠孤独症。
[0215]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的 技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保护范围。
[0216]
应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、 推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所述附权利要求的保护范围内。因此，本 发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书可以用于解释权利要求的内容。
技术特征：1.脆弱拟杆菌的荚膜多糖提取物在制备预防和/或治疗孤独症谱系障碍的药物中的应用，所述脆弱拟杆菌的保藏编号为cgmcc no.10685，所述荚膜多糖提取物为荚膜多糖a的提取物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的提取物中结合脂质的重量含量＜0.02％。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的重均分子量为40kd-400kd。4.根据权利要求1至3任一项所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的重均分子量为40kd-200kd。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的重均分子量为45kd-135kd。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述荚膜多糖a的重均分子量为50kd-130kd；可选地，所述荚膜多糖a的重均分子量为70kd-90kd。7.根据权利要求1至3、5和6任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包含所述荚膜多糖提取物和药学上可以接受的辅料。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述辅料包含稀释剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、色香味调节剂、溶剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、抗氧剂、金属络合剂、惰性气体、防腐剂、局部止痛剂、ph调节剂和等渗或等张调节剂中的一种或者多种。9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、注射剂、口服液或者管饲制剂；和/或，所述药物的给药途径为注射给药或者口服给药。10.根据权利要求1至3、5、6、8和9任一项所述的应用，其特征在于，所述药物还包含其他孤独症谱系障碍治疗药；所述其他孤独症谱系障碍治疗药物包含氟西汀、利培酮、阿立哌唑、孕烯醇酮、d-环丝氨酸、美金刚、氯米帕明、褪黑素、金刚烷胺、哌甲酯和托莫西汀中的一种或者多种。
技术总结本发明提供一种脆弱拟杆菌的荚膜多糖A提取物的新应用。本发明人经过长期的经验积累及大量创造性实验研究发现，脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A提取物能有效改善ASD症状，挖掘了脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A提取物的新用途，开拓了脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A提取物防治ASD的应用领域。本发明采用脆弱拟杆菌ZY-312荚膜多糖A提取物制备的药物，对机体没有副作用，同时还可以与其他治疗ASD的药物联合使用，具有很好的药用前景，为临床提供了一种适合人体服食的改善ASD症状的良品。食的改善ASD症状的良品。
技术研发人员：权利要求书1页说明书16页
受保护的技术使用者：广州知易生物科技有限公司
技术研发日：2022.02.16
技术公布日：2022/7/5
